dn連接反應(yīng)的影響因素提高平端連接效率的方法

1、dna1接反應(yīng)的影響因素 艱高平端連接效率的方法&外源dna和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)&端。1人連接接反應(yīng)1、 連接緩沖液的影響：大體上緩沖液含有以下組分： 20-100mmol/l的tris-hcl ,較多用50mmol/l, ph的范圍在7.4-7.8 ,較多 用7.8, 目的是提供合適酸堿度的連接體系； 10mmol/l 的 mgcl2， 作用是激活酶反應(yīng)；1-20mmol/l的dt1較多用10mmol/l,作用是維持還原性 環(huán)境，穩(wěn)定酶活性，25-50ug/ml的bsa作用是增加蛋白質(zhì)的濃度，防止因蛋白濃度過稀而造成酶的失活。與限制酶緩沖液不同的是連接酶緩沖液還含有0.5-4mmol/l的a

2、tfp現(xiàn)多用1mmol/l,是酶反應(yīng) 所必需的。2、ph的影響：一般將緩沖液的ph調(diào)節(jié)到7.4-7.8 ,較多用7.8。 有實(shí)驗(yàn)表明，若把ph為7.5-8.0時(shí)的酶活力定為100%那么體系偏堿（ph為8.3）時(shí)僅為全部活力的65%當(dāng)體系偏酸（ph為6.9）時(shí) 僅為全部活力的40%。3、atp濃度的影響：連接緩沖液中atp的濃度在0.5-4mmol/l之間， 較多用1mmol/l。研究發(fā)現(xiàn)，atp的最適濃度為0.5-1mmol/l ,過濃 會(huì)抑制反應(yīng)。例如，5mmol/l的atp會(huì)完全抑制平末端連接，黏端的連接也有10%抑制；還有報(bào)道，當(dāng)atp的濃度為0.1mmol/l時(shí)，去 磷酸載體的自環(huán)比例

3、最大。由于atpb易分解，所以當(dāng)連接反應(yīng)失敗 時(shí)，除了 dnaw酶的問題外，還應(yīng)考慮 atp的因素。含有atp的緩沖 液應(yīng)于 -20 保存， 溶化取用后立即放回。 連接緩沖液體積較大時(shí)最好分小管貯存，防止反復(fù)凍融引起atp分解。與限制酶緩沖液不同的 是，含atp的連接緩沖液長 期放置后往往失效，所以也可自行配制 不含atp的緩沖液（可長期保存），臨用時(shí)加入新配制的atp母液。4、連接溫度與時(shí)間的影響：因?yàn)轲ば阅┒说膁nax鏈間有氫鍵的作 用， 所以溫度過高會(huì)使氫鍵不穩(wěn)定， 但連接酶的最適溫度又恰為37。為了解決這一矛盾，在經(jīng) 過綜合考慮后，傳統(tǒng)上將連接溫度定為16， 時(shí)間為 4-16h 。 現(xiàn)

4、經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 對(duì)于一般的黏性末端來說，2030min就足以取得相當(dāng)好的連接效果，當(dāng)然如果時(shí)間充裕的話，20c60min能使連接反應(yīng)進(jìn)行得更完全一些。對(duì)于平末端是不用考慮氫鍵 問題的，可使用較高的溫度，使酶活力得到更好的發(fā)揮。5、酶濃度的影響：日常使用的 dnat度比酶單位定義狀態(tài)低10-20倍，連接平末端時(shí)酶用量要比連接黏端大10-100 倍。進(jìn)行黏末端連接時(shí)需先行稀釋， 稀釋液的成分與酶保存緩沖液相同或類似， 稀釋液 中的酶能在長時(shí)間保持活力，也便于隨時(shí)取用。6、dna濃度的影響：要求得到環(huán)化的有效連接產(chǎn)物， dna濃度不可 過高，一般不會(huì)超過20nmol/l。要求線性化的連接產(chǎn)物， dna

5、的濃 度可以高些， 至少是接近推薦的濃度。 在用大質(zhì)粒載體進(jìn)行大片段克隆時(shí)，以及在雙酶切片段的連接反應(yīng)中，dn頌度還應(yīng)降低，甚至是dna勺總濃 度低至幾個(gè)nmol/l。另據(jù)研究，t4 dna1接酶對(duì)dn襪 端的表觀km值為1.5nmol/l ,所以，連接時(shí)dnat度不應(yīng)低于 1nmol/l 。即應(yīng)具有2nmol/l 的末端濃度。提高平端連接效率的方法：1、 低溫下長時(shí)間的連接效率比室溫下短時(shí)間連接的好， 平端連接需要過夜反應(yīng)。2、 在體系中加一點(diǎn)切載體的酶，只要連接后原來的酶切位點(diǎn)消失。這樣可避免載體自連， 應(yīng)該可以大大提高平端連接的效率。 足夠多的載體和插入片段是最重要的。要看片段具體情況而

6、言，有時(shí)載體和片段濃度過高，容易產(chǎn)生線性化產(chǎn)物，不利于環(huán)化的。插入的dn*段的摩爾數(shù)是載體摩爾數(shù)的5-10 倍，這個(gè)很關(guān)鍵。 載體通常 50ng就夠了，若載體在10k 左右，可用 50 100ng。3、平端的連接對(duì)于離子濃度很敏感，回收的時(shí)候多洗洗，加pegffi擴(kuò)大酶量，22度2小時(shí)后4c過夜。4、 盡可能縮小連接反應(yīng)的體積，最好不超過10 微升，在 5 、 6 微升左右最佳。5、 建議放在四度冰箱連接兩天效率更高比 14 度好。（一）外源dn a和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)外源dna片段和線狀質(zhì)粒載體的連接，也就是在雙鏈dna 5 磷酸和相鄰的 3 羥基之間 形成的新的共價(jià)鏈。如質(zhì)粒載體的兩條鏈都

7、帶5磷酸，可生成4個(gè)新的磷酸二酯鏈。但如果質(zhì)粒dn a已去磷酸化，則吸能形成2個(gè)新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產(chǎn)生的 兩個(gè)雜交體分子帶有2個(gè)單鏈切口，當(dāng)雜本導(dǎo)入后可被修復(fù)。相鄰的 5 磷酸和3 羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的dn a連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌d n a連接酶和t4噬菌體d na連接酶。實(shí)際上在有用途中，t 4噬菌體dna連接酶都是首選 的用酶。這是因?yàn)樵谙鲁练磻?yīng)條件下，它就能有效地將平端d n a片 段連接起來。dna一端與另一端的連接可認(rèn)為是雙分子反應(yīng)，在標(biāo)準(zhǔn)條件 下，其反應(yīng)速度完全由互相匹配的d n a末端的濃度決定。不論末端位于同一dna分子（分子內(nèi)連接）

8、還是位于不同分子（分子間連接），都是如此?，F(xiàn)考慮一種簡單的情況，即連接混合物中只含有一種d n a ,也就是用可產(chǎn)生粘端的單個(gè)限制酶切割制備的磷酸化載體dna。在瓜作用的底物。如果反應(yīng)中dna濃度低，則配對(duì)的兩 個(gè)末端同一d n a分子的機(jī)會(huì)較大（因?yàn)閐 n a分子的一個(gè)末端找到 同一分子的另一末端 的概率要高于找到不同d n a分子的末端的概 率）。這倦，在dna濃度低時(shí)，質(zhì)粒dna重新環(huán)化將卓有成效。 如果連接反應(yīng)中d n a濃度有所增高，則在分子內(nèi)連接反應(yīng)發(fā)生以前，某一個(gè)d n a分子的末端碰到另一d n a分子末端的可能性也有 所增大。因此在d n a濃度高時(shí)，連接反的初產(chǎn)物將是質(zhì)粒二

9、聚體和 更大一些的 寡聚體。dugaiczyk 等 （1975; 同時(shí)參見 bethesda res,lab.出版的focus第2卷，第2、3期合刊）從理論上探討了dn a濃度 對(duì)連接產(chǎn)物性質(zhì)的影響。 簡而言之， 環(huán)化的連接產(chǎn)物與多聯(lián)體連接產(chǎn)物的 比取決于兩個(gè)參數(shù)：j和i。j是dna分子的一個(gè)末端在同一分子的另一末端附近的有效濃度， j 的數(shù)值是根據(jù)如下一種假設(shè)作出的：沉吟液中的dna呈隨機(jī)卷曲。這樣，j與dna分子的長度成反比（因?yàn)閐na越長，某一給定分子的兩末端的越不可能相互作 用），因此j對(duì)給定長度的dna分子來說是一個(gè)常數(shù)，與 dna 深度無關(guān)。j=3/（3兀lb0）3/2 其中l(wèi)是d

10、na長度，以cm計(jì)，b 是隨機(jī)卷曲的dna區(qū)段的長度。b的值以緩沖液的離子強(qiáng)度為轉(zhuǎn)移， 而后者可影響dna的剛度。i 是溶液中所有互補(bǔ)末端的深度的測量值，對(duì)于具有自身互補(bǔ)粘端的雙鏈dna而言，i=2nomx10-3末端/ml這里n o是阿佛伽德羅常數(shù)， m是dna 的摩爾濃度（單位：mol/l）。理論上，當(dāng)j=i時(shí)，給定 d n a分子的一個(gè)末端與同一分子的另一末端，以及與不同分子的末端相接觸的可能性相等。因而在這樣的條件下，在反應(yīng)的初始階段中，環(huán)狀分子與多聯(lián)體分子的生成速率相等。而當(dāng) ji 時(shí)，有利于重新環(huán)化；當(dāng)ij ,則有利于產(chǎn)生多聯(lián)體。圖1.9顯示了dna區(qū)段的 大小與連接反應(yīng)混合物中j

11、:i之比分別為0.5、1、2和5時(shí)所需dn a濃度之間關(guān)系（d ugaiczyk等，1985）。現(xiàn)在考慮如下的連接反 應(yīng)混合物：其中除線狀質(zhì)粒之外，還含有帶匹配末端的外源dna片 段。 對(duì)于一個(gè)給定的連接混合物而言， 產(chǎn)生單體環(huán)狀重組的效率不僅受反 應(yīng)中末端的絕對(duì)濃度影響， 而且還受質(zhì)粒和外源d n a末端的 相對(duì)濃度的影響。當(dāng)i是j的2 3倍（即末端的絕對(duì)濃度足以滿足 分子間連接的要求，而又不致引起大量寡聚體分子的形成時(shí)） 外源有效重組體的產(chǎn)量可達(dá)到最大。 這些條什 下，連接反應(yīng)終產(chǎn)物的大約40%都是由單體質(zhì)粒與外源dna所形成的嵌合體。當(dāng)連接混合物中線瘃質(zhì)粒的量恒定（ j:i=3 ）而帶匹

12、配末端的外源dna的量遞增時(shí)，這種嵌合體在連接反應(yīng)之末的理論產(chǎn) 量。涉及帶粘端的線狀磷酸化質(zhì)粒d n a的連接反應(yīng)應(yīng)包含：1）足量的載體dna,以滿足j:i1和j:i3。對(duì)一個(gè)職pucil 般大小的質(zhì)粒，這意味著連接反應(yīng)中應(yīng)含有載體dna為20-60區(qū)g/ml 。2）未端濃度等于或稍高于載體dna的外源dna ,如外源dna濃度比載體低得多， 在效連接產(chǎn)物的數(shù)量會(huì)很低， 這樣就很難別小部 分帶重組抽粒的轉(zhuǎn)化菌落。 這種情況下，可考慮采用一些步驟來減少帶非重組質(zhì)粒的背景菌落。如用磷酸酶處理線狀質(zhì)粒d na或發(fā)跡 策略以便通過定向的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒。（ 二）粘端連接1）用適當(dāng)?shù)南拗泼赶|(zhì)粒和外源

13、dna。如有必要，可用凝膠電 泳分離片段并（或）用堿性磷酸酶處理質(zhì)粒dna。通過酚：氯仿抽 提和乙沉淀來純化dna,然后用 te（ph7.6）溶液使其濃度為 100/ml 。2）按如下所述設(shè)立連接反應(yīng)混合物：a.將0.1屋 載體dna轉(zhuǎn)移到無菌微量中，加等摩爾量的外源dnao b.加水至7.5屋，于45c加溫5分鐘以使重新退炎的粘端解鏈，將 混合物冷卻到0 c。c.加入：10xt4噬菌體dna連接酶緩沖液1 t 4噬菌體nd a連接酶 0.1weiss單位5 mmol/l atp 1 ”于16c溫育1 4小時(shí)10xt4噬菌體d n a連接酶緩沖液200mmol/l 同 tris.cl（ph7.

14、6）50mmol/k mgcl250mmol/l二硫蘇糖醇500 g/ml牛血清白蛋白（組分v .sigma產(chǎn)品）（可用可不用）該緩訓(xùn)液應(yīng)分裝成小份，貯存于 20。另外，再設(shè)立兩個(gè)對(duì)照反應(yīng)，其中含有（1 ）只有質(zhì)粒載體；（2 ） 只有外源dna片段。如果外源dna量不足，每個(gè)連接反應(yīng)可用 50-100ng質(zhì)粒dna,并盡可能多加外源dna,同時(shí)保持連接反 應(yīng)體積不超過10。可用至少3種不同方法來測定t 4噬菌體dn a連接酶的活性。大多數(shù)制造廠商（除 new england biolabs 公司 外）現(xiàn)在都用 weiss等，1 1968）對(duì)該酶進(jìn)行標(biāo)化。1個(gè) weiss單位 是指在37c下20

15、分釧內(nèi)催化1 mmol32雙焦磷酸根 置換到丫，（3 -32patp所需酶時(shí)，1個(gè) weiss單位相當(dāng)于0.2個(gè)用外切核酸酶耐 受試驗(yàn)來定義的單位（ modrich 和 lehman,1970） 或者 60個(gè)粘端單位（如new england biolabs 公司所定義）。因此，0.015weiss 單位 的t 4噬菌體dn a連接酶在16c下30分鐘內(nèi)可使50%的入噬菌體 hindin片段 （5g）得以連接。在本書中，丁4噬菌體。1人連接 酶一律用weiss單位表示。par目前提供的t 4噬菌體d n a連接酶 均為濃溶液（1-5 單位 / “），可用 20mmol/l tris.cl（ph

16、7.6）、 60mmol/l kcl、5mmol/l二硫蘇糖醇、500區(qū)g/ml牛血清白蛋白、50% 甘稀釋成 100 單位 /ml 的濃度置存。處于這種濃度并在這種緩沖液中的t 4噬體 dna連接酶于-20 c保存3個(gè)月可保持穩(wěn)定。3 ）每個(gè)樣品各取1 2區(qū)l轉(zhuǎn)化大腸桿菌。（三）平端dna連接t 4噬菌體dna連接酶不同于大腸桿菌dna連接酶，它可以催化平端dna片段的連接（sgaramella和 khorana,1972;sgaramella 和 ehrlich,1978 ）,由于dna很容易成 為平端，所以這是一個(gè)極為有用的酶學(xué)物性。有了這樣的 物性，才 能使任何dna分子彼此相連。然而

17、，相對(duì)而言，平端連接是低效反 應(yīng)，它要求以下4個(gè)條件：1 ）低濃度（0.5mmol/l）的 atp（ferretti 和 sgaranekka,1981 ）。 2 ）不存在亞精胺一類的多胺。3）極高濃度的連接酶（50weiss單位.ml）。4）高濃度的平端。1 .凝聚劑在反應(yīng)混合物中加入一些可促進(jìn)大分子群聚作用并可導(dǎo)致d npheiffer 和zimmerman,1983;zimmermarf口 pheiffer,1983;zimmermant harrison,1985) 或氯化六氨全高鉆(rusche和howard-flanders,1985 )，可以使如何取得適當(dāng)濃度的平端dna的總是

18、迎刃而解。在連接反應(yīng)中，這些物質(zhì)具有兩作用：1)它們可使平端d n a的連接速率加大1 3個(gè)數(shù)量級(jí)，因此可使連接反應(yīng)在酶dna濃度不高的條件下進(jìn)行。2)它們可以改變連接產(chǎn)物的分布，分子內(nèi)連接受到抑制，所形成的連接產(chǎn)物一律是分子間連接的產(chǎn)物。這樣，即使在有利于自身環(huán)化(j:i=10 )的dna濃度下，所有的dn a產(chǎn)物也將是線狀多聚體。par 在設(shè)立含凝聚劑的連接反應(yīng)時(shí)，下列資料可供參考。(1 )聚乙二醇(peg80001 )用去離子水配制的p e g 8000貯存液(40%)分裝成小份，冰凍保存， 但加入連接反應(yīng)混合物之前應(yīng)將其融化并使其達(dá)到室溫。 在含 15peg8000 的連接反應(yīng)混合物中

19、，對(duì)連接反刺激效應(yīng)最為顯著。除peg800和t 4噬菌體dna連接酶以外，其他所有連接混合物的組分應(yīng)于0c混合，然后加適當(dāng)體積的peg 8000(處于室溫)，混勻，加酶后于20進(jìn)行溫育。2 )連接混合物中含 0.5mmol/l at可口 5mmol/l mgcl2時(shí)對(duì)連接反應(yīng)的刺激效應(yīng)最為顯著，甚至atp濃度略有增加或m gcl2濃度略有降低，都會(huì)嚴(yán)重降低刺激的強(qiáng)度( pheiffer 和 zimmerman,1983)。3)濃度為15%的peg 8000可刺激帶粘端的dna分子的連接效率提高至原來的 10-100 倍，反應(yīng)的主產(chǎn)物是串聯(lián)的多聯(lián)體。4) peg 8000可刺激短至8個(gè)核甘酸的合

20、成寡聚物的平端連接，在這一方面，它與氯化六氨合高鈷有所不同。(2 )氯化六氨合高鉆1 )氯化六氨合高鉆可用水配成10mmol/l貯存液貯存于-20 c,它對(duì)連接反應(yīng)的刺激具有高度的濃度信賴性。 當(dāng)連接反應(yīng)混合物中鹽深度為1.0-1.5mol/l時(shí)，其刺激作用最大。氯化六氨合高鉆可使平端連接的效率大約提高到原來的50幡瓦但只能使端連接的效率提高到原來的 5 倍 (rusche和 howard-flanders,1985 )。2)在單價(jià)陽離子(30mmol/l kcl)存在下，它對(duì)平端連接仍有一定的刺激作用， 但此時(shí)連接產(chǎn)物的分布有所改變。 連接產(chǎn)物不再是清一色的分子間連接產(chǎn)物，相反，環(huán)狀dn a將點(diǎn)盡優(yōu)勢。3)與peg 8000不同，氯化六氨合高鉆不能顯著提高合成寡核昔酸的連接速率。一、轉(zhuǎn)化由于外源dna勺進(jìn)入而使細(xì)胞遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化，早在 1943年， avery等就發(fā)現(xiàn)有毒肺炎雙球菌的dnaw無毒肺炎雙球菌共培養(yǎng)后產(chǎn) 生有毒性的肺炎 雙球菌后代的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。但 dnas入細(xì)胞的效率很 低， 在分子生物學(xué)和基因工程工作中可采取一些方法處理細(xì)胞， 經(jīng)處 理后的細(xì)