液相色譜法檢測苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的疑難詳解

1、液相色譜法檢測苯甲酸、 山梨酸、糖精鈉的疑難詳解-不能不看的精華生活， 就是面對現(xiàn)實微 笑，就是越過障礙注視未來；生活，就是用心靈之剪，在人生之路上裁出葉綠的枝頭；生活，就是面對困惑或黑暗時，靈魂深處燃起豆大卻明亮且微笑的燈展。17過去與未來，都離自己很遙遠(yuǎn)，關(guān)鍵是抓住現(xiàn)在，抓住當(dāng)前。液相色譜法檢測苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的疑難詳解不能不看的精華液相色譜法檢測苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的疑難詳解苯甲酸、山梨酸、糖精鈉是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，苯甲酸、山梨酸的檢測參照GB/, 糖精鈉的檢測參照 GB/T，即可開展實驗。苯甲酸、山梨酸、糖精鈉雖是較常見的檢測項目，但是要得到一個準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，也存在

2、 一定的難度，許多新手常出現(xiàn)因?qū)Ψ椒ɡ斫獍l(fā)生偏差而檢測出錯的事故。筆者根據(jù)自己多年 該方面工作的實際經(jīng)驗出發(fā)，以苯甲酸、山梨酸為著重點，從樣品前處理、檢測儀器的選擇、超標(biāo)時的判斷等幾個易出問題的方面，進(jìn)行了詳細(xì)的闡述。2樣品前處理的注意事項GB/和GB/在文字結(jié)構(gòu)上有缺陷，在涉及用儀器法測定苯甲酸、山梨酸、糖精鈉時，只講述 了液體樣品的前處理方法，沒有涉及對固體樣品的前處理。食品樣品往往含有大量的油脂、蛋白質(zhì)，對提取極為不利；如處理不干凈也會污染色譜柱， 影響檢測工作。這類樣品處理的關(guān)鍵在于如何找到一種較理想的沉淀劑，盡量排除待測樣品 中的油脂、蛋白質(zhì)，且不影響待測物組分的回收率。GB/使用5

3、%硫酸銅溶液沉淀蛋白，對于蛋白質(zhì)含量較低的食品尚可，對于豆粉、奶粉、月餅 等高油脂、高蛋白樣品則沉淀效果不理想。如用10%鎢酸鈉溶液作為沉淀劑，效果好些；如用10%亞鐵氰化鉀溶液和20%醋酸鋅溶液則效果更理想（這是筆者目前用過最理想的沉淀劑）。具體操作步驟如下：取一定量樣品，搗碎，利用四分法原理稱取樣品克于50ml比色管中，加水20ml，浸泡、振蕩均勻，加入氫氧化鈉溶液 （1mol/L） ml ，加入亞鐵氰化鉀溶液，20%乙酸鋅溶液，定容，振蕩使其充分混勻后，用濾紙初濾除去沉淀物 ，初濾液過卩m微孔濾膜，收集濾液于樣品瓶 中，樣品處理液和標(biāo)準(zhǔn)有溶液各進(jìn)樣5uL測定。用這種方法簡單易行，接觸有機(jī)

4、試劑少，重復(fù)性和回收率都令人滿意；缺點是一定要用液相 色譜法檢測，有一定局限。3檢測儀器的選擇雖然液相色譜儀操作起來比氣相色譜儀要復(fù)雜，但筆者建議如條件許可仍盡量用液相色譜法檢測。原因如下：液相色譜法所用的樣品處理方法遠(yuǎn)比氣相色譜法簡單，且不需使用有機(jī)試劑。尤其對于高油脂樣品（如月餅）若采用堿化-排油-酸化-提取-揮干-溶解等步驟，再上氣相色譜儀檢 測，工作量大，試劑毒性也大，且結(jié)果由于處理步驟太多而難以保證準(zhǔn)確。用液相色譜法還可同時完成糖精鈉項目的檢測，而氣相色譜法只能做苯甲酸、 山梨酸的檢測。液相色譜儀所用的紫外檢測器比氣相色譜儀的氫火焰檢測器靈敏，可進(jìn)行更低含量的檢測。如用二極管陣列檢測

5、器，還可輔助定性，這更是氣相色譜氫火焰檢測器不可比擬的。4選用氣相色譜儀時的注意事項GB/所用的氣相色譜柱為 5 % DEGS-1%磷酸固定液的 60 80目Chromosorb W AW,。這種柱有性能穩(wěn)定、重復(fù)性好、保留時間穩(wěn)定的優(yōu)點，但同時也有穩(wěn)定時間較長的缺點。該柱的適用的樣品提取溶劑為石油醚或乙醚，如果用甲醇或乙醇，則溶劑峰拖尾效應(yīng)較大， 對山梨酸的測定有影響。如用毛細(xì)管柱，能取得更好的峰形和靈敏度，但其穩(wěn)定性及特異性不如填充柱。一般可用非極性毛細(xì)管柱，內(nèi)徑，10 15m長度。色譜條件可能需用程序升溫。在氣相色譜儀上的出峰次序為先出山梨酸，后出苯甲酸。糖精鈉不能直接用氣相色譜進(jìn)行檢測

6、，必須衍生化后才能汽化進(jìn)樣。5選用液相色譜儀的注意事項按照GB/，流動相應(yīng)為5： 95的甲醇：醋酸銨溶液，但是這個比例僅是個參考值，我們在工 作中應(yīng)根據(jù)實際情況進(jìn)行調(diào)節(jié)。為什么用甲醇溶液甲醇有兩個作用，（1）防腐，液相色譜柱最怕流動相長菌，尤其霉菌。甲醇可使蛋白質(zhì)變性，有殺菌作用。（2）調(diào)節(jié)流動相極性，這是最重要的一點。甲醇在溶液中比例的較小變化都會使苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的保留時間發(fā)生明顯的改變，因此可以通過 改變流動相中甲醇含量，以調(diào)節(jié)這幾個組分的出峰和分離，以得到較理想的色譜圖。5: 95是一個通用的比例，如減少甲醇含量，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的出峰時間變慢擴(kuò)散效應(yīng)增大，峰形較差，但這三

7、組分的分離情況較好。如增加甲醇含量，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的出峰時間提前，擴(kuò)散效應(yīng)較小，峰形尖銳，但這三組分的分離情況可能受影響，產(chǎn)生重疊。在選擇條件時，只能通過實驗手段，如配制3: 97, 4： 96, 5: 95, 6: 96, 7: 93的流動相，綜合考慮分離效果和分離時間選擇最佳比例。不同柱的最適比例不同，舉例來說，色譜科公司的液相柱最適比例為4: 96，而島津公司液相柱的最佳比例為 7: 93。就是同一根柱，一年前和一年后的極性也會有變化，需調(diào)節(jié)溶液 配比。為什么使用醋酸銨溶液加入醋酸銨是為了調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，使待測物的峰形不致于變壞。如果 單獨檢測苯甲酸和糖精鈉，加不加醋酸銨沒有什么關(guān)

8、系，都可以得到較好的峰形；但是檢測 山梨酸時流動相一定要加醋酸銨，否則得不到一個完整的色譜峰，峰形呈破裂狀。醋酸銨溶液濃度不需嚴(yán)格控制，、均可。苯甲酸、山梨酸、糖精鈉在液相上的出峰次序很有特點。在流動相5： 95及以下比例時，次序是苯甲酸、山梨酸、糖精鈉（注意一下氣相的出峰次序），逐步增大甲醇含量，苯甲酸、山梨酸的出峰時間逐步提前，而糖精鈉是出峰時間迅速提前，隨著甲醇比例的逐步增大（15%-30%）,原先在最后出峰的糖精鈉集次和前面的山梨酸、山梨酸重疊，并位于最前面，其次序變?yōu)樘蔷c、苯甲酸、山梨酸。再提高甲醇濃度，次序不變。用高甲醇比例條件（甲醇15%以上）做出的三種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖峰形較好，

9、出峰時間也較快,但做實際樣品時干擾較大；因此建議盡量使用低甲醇比例條件（甲醇5%左右）。6苯甲酸、山梨酸超標(biāo)時的判斷苯甲酸、山梨酸超標(biāo)的樣品較多，由于它們往往牽涉到一批貨物是否合格，因此責(zé)任重大。由于該方法定量較準(zhǔn)確，因此遇到超標(biāo)樣品時應(yīng)將精力集中于定性方面。如同時有氣相色譜儀和液相色譜儀，建議用這兩種性質(zhì)相差較大的儀器進(jìn)行對照，如定量結(jié)果差不多，即可確認(rèn)。如只有氣相色譜儀，應(yīng)利用其在填充柱保留時間穩(wěn)定的特性，同時進(jìn)五針標(biāo)準(zhǔn)液和五針樣品液（注：峰面積應(yīng)差不多，否則需對一方按比例稀釋），如標(biāo)準(zhǔn)和樣品液的保留時間相差時間超過1秒，可認(rèn)為不是。（如進(jìn)針的技術(shù)不過關(guān)，請不要做此實驗）如用液相色譜儀，當(dāng)

10、檢測器為二極管陣列檢測器時，根據(jù)保留時間和紫外吸收圖結(jié)合定性，當(dāng)只有紫外檢測器時，改檢測波長為220nm, 230nm, 250nm,重復(fù)進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)和樣品液，由標(biāo)準(zhǔn)和樣品在不同波長的峰高比值看是否吻合。如有微生物檢測手段，可加樣品于有菌培養(yǎng)基中，觀察有無抑菌現(xiàn)象，如無抑菌現(xiàn)象則無防腐劑。不是很推薦用雙柱法，因為有時柱極性相差不大，反而會影響最終判斷。7糖精鈉超標(biāo)時的判斷當(dāng)檢測糖精鈉超標(biāo)時，除了采用二極管陣列檢測器或波長驗證，還可以利用糖精鈉的熒光特性，用熒光檢測器進(jìn)行驗證。熒光條件是激發(fā)波長為 277nm熒光波長為410nmo只有當(dāng)用熒光檢測器和用紫外檢測器做出的定量結(jié)果相差不多，才可以判斷為是。

11、還有一個簡單粗糙、卻也行之有效的驗證方法，即感官法。糖精鈉是一種甜味劑，用舌頭可以感覺到它的甜味，如果含量超標(biāo)，一定能嘗出來。8標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制貯存問題。如用苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的標(biāo)準(zhǔn)溶液如用水、乙醇作基體，一般幾個月后會嚴(yán)重降解， 甲醇溶解再放于冰箱冷凍層，可保持穩(wěn)定一兩年。因此推薦用甲醇作溶劑。在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時，初學(xué)者常犯的錯誤多為用甲醇溶解苯甲酸鈉，用水溶解苯甲酸，晃了半 天才發(fā)現(xiàn)怎么也不沒溶解。應(yīng)該用弱堿性水溶解苯甲酸鈉、山梨酸鉀，用甲醇溶解苯甲酸、 山梨酸。9苯甲酸、山梨酸的應(yīng)用范圍首先應(yīng)注意到，并不是所有食品都需要加入防腐劑，只有那些富含營養(yǎng)物質(zhì)，且需要長時間 暴露于空氣的才有這樣的需要，否則對廠家來說會增加不必要的成本。醬油、醬料、咸菜、濃縮果汁等由于開封后不可能短期內(nèi)吃完，月餅等需在貨架上擺放，如 不加防腐劑很快會發(fā)霉變質(zhì)，有添加防腐劑的必要。而利樂裝或易拉罐裝的飲料由于很快可 以食用完畢，即在細(xì)菌大量繁殖前己被消化了，因而沒有添加的必要。苯甲酸、山梨酸如果要起到防腐的作用，含量就不能太低。如果我們檢測樣品時只有幾個ppm的濃度，有可能是從原料中帶來的或由其它添加劑轉(zhuǎn)化來的，而不是廠家出于防腐目的加入的。苯甲酸、山梨酸也只是防腐劑中的兩種。 并不是所有需要加入防腐劑的食品都會添加苯甲酸、山梨酸，