醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)例子

1、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 期別：xxx 班級(jí)：xx 學(xué)號(hào)：xxxxxxxx 姓名：ooo il-35對(duì)小鼠型糖尿病的治療效果及免疫機(jī)制【立題依據(jù)】自身免疫性疾病（autoimmunediseases）是指機(jī)體對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病。如今越來(lái)越多的自身免疫性疾病被不斷發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)，也越來(lái)越引起人們的關(guān)注。型糖尿病(t1dm自身免疫性胰腺炎)就是其中的一員，在全球大約有2000萬(wàn)患者，中國(guó)至少有100萬(wàn)的患者，但是型糖尿病常常在幼兒和青少年時(shí)期發(fā)生且為一種多基因遺傳病有較高的遺傳度（75%），表現(xiàn)為明顯的家族遺傳性。同時(shí)，型糖尿病患者如治療不善將引發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥，如失明、腎衰

2、竭、心臟病、截肢等。因此如果能正確了解型糖尿病的免疫學(xué)機(jī)制，并探索更加有效治療及預(yù)防方案，對(duì)于患者本身乃至整個(gè)家族的身體和生活質(zhì)量的提高意義重大。型糖尿病的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制是體內(nèi)除了抗原提呈細(xì)胞（apc）和活化的t淋巴細(xì)胞外正常細(xì)胞幾乎不表達(dá)mhc-類分子，研究表明ifn-轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島細(xì)胞分泌ifn-，由于ifn-刺激mhc-分子的表達(dá)這種小鼠的胰島細(xì)胞高表達(dá)mhc-類分子，這樣以來(lái)免疫細(xì)胞就會(huì)結(jié)合并識(shí)別胰島細(xì)胞然后對(duì)其進(jìn)行攻擊，使其喪失胰島素分泌活性，最終導(dǎo)致體內(nèi)胰島素缺乏。調(diào)節(jié)性t細(xì)胞（treg)是一些cd4+t cell還可高表達(dá)il-2受體的鏈（cd25）分子，胞質(zhì)中表達(dá)foxp3轉(zhuǎn)

3、錄因子的t細(xì)胞分化亞群。它的主要功能是通過(guò)抑制cd4+ tcell和cd8+ tcell的活化與增殖從而達(dá)到免疫的負(fù)調(diào)節(jié)作用。通過(guò)協(xié)調(diào)treg水平來(lái)調(diào)節(jié)型糖尿病患者的免疫功能可能成為新的治療手段。白細(xì)胞介素-35（il-35）是2007年新發(fā)現(xiàn)的一種獨(dú)特的具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)因子，屬于il12細(xì)胞因子家族，il-35為異源二聚，主要由活化的treg分泌，對(duì)多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子均有明顯的抑制作用，參與介導(dǎo)機(jī)體免疫耐受的形成。il-35是否對(duì)型糖尿病患者具有治療作用及其相關(guān)的免疫機(jī)制，還不十分清楚，仍有待繼續(xù)研究和解決。【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹勘緦?shí)驗(yàn)就是通過(guò)提高nod系小鼠（型糖尿病患鼠）體內(nèi)的il-35

4、水平，觀測(cè)小鼠各期的血糖尿糖等水平及后期的型糖尿病發(fā)病率、胰島炎評(píng)分等，評(píng)定il-35對(duì)型糖尿病的預(yù)防及治療效果，并與其它一些免疫抑制性的藥物（環(huán)孢菌素a）等，進(jìn)行藥敏對(duì)比；同時(shí)，體外測(cè)定小鼠體內(nèi)il-4及干擾素-（ifn-）的等含量及調(diào)節(jié)性t淋巴細(xì)胞的含量等，對(duì)小鼠的免疫體質(zhì)及il-35對(duì)型糖尿病作用的免疫學(xué)機(jī)制有大體認(rèn)識(shí)及方向把握，為以后的研究打下基礎(chǔ)。從而為新藥（聯(lián)合藥）的開發(fā)，免疫抑制領(lǐng)域的深入研究有一定意義?！緦?shí)驗(yàn)對(duì)象】nod系型糖尿病鼠和non系正常不患病鼠（雌性4周齡）起源在對(duì)icr/jcl小鼠進(jìn)行近郊培育的第6代，從白內(nèi)障易感亞系分離出非肥胖糖尿病品系（nod）和非肥胖正常品系

5、（non）。在近交20代時(shí)，首先發(fā)現(xiàn)nod雌鼠有胰島素依賴性糖尿病。特征自發(fā)型糖尿病以及多種自身免疫疾病小鼠。通過(guò)病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，nod小鼠自身免疫性胰島炎發(fā)生于4周齡。nod小鼠發(fā)病后，充分呈現(xiàn)該品系小鼠糖尿病的生理生化特征即：尿頻多飲高血糖癥狀。在幾周的時(shí)間內(nèi)，血糖迅速升高，飲水量劇增，大量的排尿，體重迅速下降，在這個(gè)過(guò)程中，患鼠血糖呈現(xiàn)迅速上升，后逐步下降，但仍維持高于正常值的狀態(tài)，體重直線下降，最后昏迷而死亡。于12周齡時(shí)出現(xiàn)明顯糖尿病癥狀，至30周齡時(shí)雌性小鼠累計(jì)發(fā)病率可達(dá)到80?！緦?shí)驗(yàn)材料】試劑及儀器il-35試劑，磷酸鹽緩沖液(pbs),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（elisa）試劑盒，流式

6、細(xì)胞儀，cd8及cd4單克隆抗體，注射器等基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)器械。【實(shí)驗(yàn)方法及步驟】1.小鼠的分組與處理選取nod系型糖尿病鼠20只和non系正常不患病鼠10只，分為三組。10只nod系小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，10只nod系小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，10只non系正常不患病鼠作為正常對(duì)照組。對(duì)各組四周齡小鼠采?。簩?shí)驗(yàn)組注射il-35注射液，每三天注射一次，注射量根據(jù)生物試劑公司提供的il-35試劑說(shuō)明書為準(zhǔn)，連續(xù)注射7周；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和正常對(duì)照組注射等量的磷酸鹽緩沖液（pbs），注射方式同實(shí)驗(yàn)組。各組小鼠自由飲食，飲水不限。2.糖尿病及體重檢測(cè)從各組小鼠10周齡開始每周記錄體重，每天采取斷尾方式測(cè)血糖含量和尿糖含量，血

7、糖連續(xù)2天超過(guò)16.00mmol/l即診斷為糖尿病，30周后觀察期滿終止觀察，計(jì)算各組小鼠發(fā)病率；3.胰腺炎嚴(yán)重程度評(píng)分30周后，頸椎脫臼法處死各組小鼠，取各組小鼠胰島做he染色切片進(jìn)行病理性胰島炎評(píng)分：0級(jí)：胰島完整無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，計(jì)0分；1級(jí)：有胰島周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（即胰島周圍炎）或50%的面積受累，計(jì)3分。記錄各組小鼠評(píng)分值。4.細(xì)胞因子水平測(cè)定取足等量的各組小鼠外周血用elisa法檢測(cè)il-4及干擾素-（ifn-）的含量；5. cd4+cd25+調(diào)節(jié)性t（treg）細(xì)胞亞群測(cè)定取各組小鼠脾臟制成單核細(xì)胞懸液，應(yīng)用流式細(xì)胞法檢測(cè)大鼠脾臟cd4+cd25+調(diào)節(jié)性t（treg）細(xì)胞水平。7.

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用spss統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。【預(yù)期結(jié)果及結(jié)論】預(yù)期結(jié)果實(shí)驗(yàn)組小鼠的發(fā)病率遠(yuǎn)低于對(duì)照組小鼠發(fā)病率；體重較對(duì)照組重；且對(duì)照組飲食飲水量遠(yuǎn)多于實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組；血糖和尿糖含量比對(duì)照組低，并接近于正常對(duì)照組（可偏高）；干擾素-（ifn-）的含量實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)遠(yuǎn)低于對(duì)照組和正常對(duì)照組鼠，il-4則恰恰相反；調(diào)節(jié)性t（treg）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組計(jì)數(shù)和活性較對(duì)照組和正常對(duì)照組高。結(jié)果分析il-35具有明顯減少型糖尿病發(fā)生及減輕病情的作用；由于il-35使th0細(xì)胞向th2細(xì)胞分化，抑制th1細(xì)胞分化，并升高調(diào)節(jié)性t（treg）細(xì)胞水平。所以il-35可能通過(guò)上調(diào)機(jī)體treg，誘導(dǎo)th1與th2

9、的平衡向th2轉(zhuǎn)化，從而不會(huì)減少免疫細(xì)胞對(duì)自體胰島細(xì)胞識(shí)別與破壞，保證了胰島細(xì)胞的正常胰島素分泌功能，維持血糖的正常。為探索治療型糖尿病的新方法提供理論依據(jù)?！緦?shí)驗(yàn)可行性分析】雖然沒(méi)有用直接注射免疫抑制細(xì)胞因子來(lái)治療自身免疫病的相關(guān)報(bào)道，但本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案合理；分組、對(duì)照完備；體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)兼有；技術(shù)方法和路線可行。通過(guò)免疫學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和理論的學(xué)習(xí)，已掌握免疫細(xì)胞、免疫分子的檢測(cè)技術(shù)（elisa法），具有可操作性；實(shí)驗(yàn)所需藥品、試劑及動(dòng)物均較易獲得，具備開展實(shí)驗(yàn)的條件?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】【1】金伯泉醫(yī)學(xué)免疫學(xué)第五版北京：人民衛(wèi)生出版社，2008【2】宋文剛免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教材北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2010

10、【3】孫黎飛細(xì)胞免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)研究方法北京：人民軍醫(yī)出版社，2009【4】王培林，傅松濱醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)第三版北京科學(xué)技術(shù)出版社2011【5】哈佛醫(yī)學(xué)院brighamandwomens醫(yī)院，ebioscience公司的科學(xué)家nature罕見(jiàn)的抑制性因子美國(guó)2007【6】王嘉軍微生物學(xué)免疫學(xué)新進(jìn)展第37卷，第4期2011【7】周國(guó)慶，唐琴，黃麗，孫保亮泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，treg的免疫磁珠提取純化方法【8】姜小麗，楊婷等中國(guó)免疫學(xué)雜志2013年第四期哮喘小鼠中foxp3+treg/th17的失衡及意義【9】王建華糖尿病自我管理全書北京：北京科學(xué)出版社2010【關(guān)鍵詞】 紅細(xì)胞 【摘要】 目的 應(yīng)用紅細(xì)胞免疫方

11、法檢測(cè)腫瘤患者紅細(xì)胞免疫功能。方法 應(yīng)用紅細(xì)胞c3b受體花環(huán)試驗(yàn)和紅細(xì)胞免疫復(fù)合物(ic)花環(huán)試驗(yàn)，檢測(cè)114例腫瘤患者的紅細(xì)胞免疫功能。結(jié)果 腫瘤患者紅細(xì)胞c3b花環(huán)率顯著降低(p0.01)，紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率升高(p0.05)。乳腺癌術(shù)后紅細(xì)胞c3b受體花環(huán)率升高，紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率降低。結(jié)論 腫瘤患者紅細(xì)胞免疫粘附功能降低。 【關(guān)鍵詞】 紅細(xì)胞；免疫；c3b受體 傳統(tǒng)觀念認(rèn)為消滅體內(nèi)突變細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞是白細(xì)胞的功能，而對(duì)于紅細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起何作用知之甚少。近年來(lái)隨著對(duì)紅細(xì)胞免疫功能的研究的逐步深入，有人發(fā)現(xiàn)癌癥患者紅細(xì)胞免疫粘附受體活性下降。為探討惡性腫瘤與紅細(xì)胞免疫粘附的

12、關(guān)系，該研究對(duì)114例腫瘤患者進(jìn)行了當(dāng)前常采用的紅細(xì)胞免疫功能二項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，并與50例正常人進(jìn)行對(duì)照。1 資料與方法1.1 一般資料 試驗(yàn)組：114例均為臨床病理確診的腫瘤患者，其中肺癌22例，食管癌30例，腦腫瘤10例，鼻咽癌8例，肝癌12例，乳腺癌術(shù)后12例，其他腫瘤20例。對(duì)照組：正常人50例均為志愿獻(xiàn)血者，男40例，女10例；年齡20歲。1.2 方法 紅細(xì)胞c3b受體花環(huán)(c3b花環(huán))試驗(yàn)，參照郭峰法。所用試劑均由上海長(zhǎng)海醫(yī)院提供。2 結(jié)果測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。乳腺癌術(shù)后患者紅細(xì)胞c3b受體花環(huán)率低于對(duì)照組(p0.01)，其他各組紅細(xì)胞c3b受體花環(huán)率明顯低于正常對(duì)照組(p0.01)，而紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率除乳腺癌術(shù)后低于對(duì)照，其他各組均高于對(duì)照組，但差異無(wú)顯著性(p0.05)。表1 兩組二項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較 (略)3 討論正常人體血液循環(huán)中免疫復(fù)合物少，因此紅細(xì)胞c3b受體花環(huán)率高于紅細(xì)胞ic花環(huán)率，約為2倍。文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤患者紅細(xì)胞c3b花環(huán)率顯著低于正常人，而紅細(xì)胞ic花環(huán)率高于正常人，提示腫瘤患者紅細(xì)胞免疫粘附活性降低。本文測(cè)定114例腫瘤患者的紅細(xì)胞c3b花環(huán)率顯著低于正常人，與其他同仁的報(bào)道一致。引起腫瘤患者紅細(xì)胞免疫失調(diào)的原因是：(1)腫瘤患者血清中存在一種免疫抑制因子，對(duì)其免疫功能有一定的抑制作用