基因芯片檢測大鼠心肌頓抑相關(guān)基因的差異表達(dá)及左心室注射地爾硫卓對頓抑心肌功能的影響

1、基因芯片檢測大鼠心肌頓抑相關(guān)基因的差異表達(dá)及左心室注射地爾硫卓對頓抑心肌功能的影響心肌頓抑是一種常見的臨床現(xiàn)象 ,1975 年 Heyndrickx 等首次描述了這種心 肌缺血后收縮功能障礙延遲恢復(fù)的現(xiàn)象 ,1982 年 Braunwald 等明確提出心肌頓抑 的概念。開始僅僅認(rèn)為心肌頓抑是一種實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)象未引起重視 , 但在二十世紀(jì)九 十年代之后 , 缺血性心臟病人通過各種方式可以獲得冠狀動(dòng)脈的再通 , 因此對這 種現(xiàn)象的研究成為熱點(diǎn)。多年來人們選擇不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及方法對其發(fā)生機(jī)制進(jìn)行探討 , 但機(jī)制仍不 清楚, 主要的機(jī)制認(rèn)為與氧自由基、肌鈣蛋白降解及鈣假說有關(guān)。早有大量研究 證明缺血再灌注

2、可以誘導(dǎo)基因表達(dá)的改變 , 而這種改變正是心肌頓抑的分子學(xué)基 礎(chǔ)。了解心肌頓抑時(shí)有哪些基因的表達(dá)改變 , 不僅可以揭示缺血再灌注所導(dǎo)致的 心肌頓抑的分子學(xué)機(jī)制 , 還可以通過靶目標(biāo)基因的基因治療抑制心肌頓抑的機(jī)械 功能障礙而發(fā)揮心肌頓抑自我修復(fù)功能 , 這可能是今后缺血性心臟病治療的突破 口。雖然有各種針對心肌頓抑的基因表達(dá)改變的研究 , 但往往局限于幾個(gè)或數(shù)十 個(gè),對大量基因表達(dá)改變的研究需要新的方法學(xué) , 基因芯片是伴隨著人類基因組 計(jì)劃發(fā)展起來的一項(xiàng)高通量篩選技術(shù) , 它能在同一實(shí)驗(yàn)條件下同時(shí)篩檢數(shù)以千萬 計(jì)的基因的差異表達(dá) , 因此, 基因芯片技術(shù)的高效性和可靠性為研究心肌頓抑相 關(guān)基

3、因的表達(dá)變化提供了新的技術(shù)手段。心肌頓抑的特點(diǎn)在于其潛在的可恢復(fù)性 , 因此有人認(rèn)為治療一個(gè)可能自我痊 愈的病理生路過程沒有必要。但研究證明反復(fù)的心肌頓抑可以引起心肌冬眠 , 并 從而導(dǎo)致心力衰竭 , 因此及時(shí)有效地治療心肌頓抑對預(yù)防慢性心力衰竭的形成和發(fā)展是有重大意義的多數(shù)研究已經(jīng)證實(shí) , 再灌注時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣超載是心肌頓抑的主要原因。目前 , 預(yù)防細(xì)胞內(nèi)鈣超載的有效藥物之一是鈣拮抗劑。地爾硫卓是一類能選擇性地阻滯 Ca2+v/sup細(xì)胞膜上慢鈣通道進(jìn) 入細(xì)胞內(nèi)的藥物，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+v/sup度，另外，地爾硫卓作為鈣拮抗 劑可作用于外周血管平滑肌使血管舒張 ,降低血管阻力 ,減輕后負(fù)荷, 使

4、心輸出量 增加, 心肌的氧耗減少 , 減輕心肌頓抑。因此鈣離子拮抗劑有望逆轉(zhuǎn)這種異常從而 治療心肌頓抑。研究目的探討心肌頓抑的差異表達(dá)基因 , 分析其功能以探討心肌頓抑可能的 分子學(xué)機(jī)制以便為今后的基因治療提供目標(biāo)基因 ; 觀察鈣拮抗劑地爾硫卓不同時(shí) 間左心室直接注入對大鼠心肌頓抑的療效。研究方法 1. 采取大鼠開胸前降支結(jié) 扎 20 分鐘再灌注 120分鐘方法制造心肌頓抑模型 ;2. 取大鼠頓抑及假手術(shù)組前壁 心肌提取總RNA采用北京博奧生物有限公司的 27K Rat Genome Array芯片掃描 觀察差異表達(dá)的基因。3. 選擇基因芯片差異表達(dá)倍數(shù)高的基因進(jìn)行熒光 PCR驗(yàn)證確定芯片檢測

5、結(jié) 果的可靠性。4.應(yīng)用地爾硫卓在缺血前、 再灌注即刻、再灌晚期左心室注射觀測 其對頓抑大鼠心肌功能的影響。結(jié)果 1. 大鼠心肌頓抑模型的制造。心肌頓抑組與假手術(shù)組比較在缺血及再 灌注后出現(xiàn)心率增快 ,LVSP、LVDP、LVdp/dtmax 降低, 心肌酶無明 顯升高。2. 心肌頓抑時(shí)基因表達(dá)的變化基因芯片檢測頓抑組與假手術(shù)組心肌差異表 達(dá)的基因有 292條,其中 199條上調(diào),93 條下調(diào)。為便于進(jìn)一步分析基因功能及 意義, 我們進(jìn)一步以 4 倍差異表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)篩選出表達(dá)豐度較高的基因 41 條, 以芯片 中表達(dá)倍數(shù)較高的 HSP70 PAI-1、ATF-3、C-FOS與看家基因GADP做對照

6、,用 RT-PCR僉證,發(fā)現(xiàn)在RT-PCR僉證中表達(dá)倍數(shù)雖然不相同，但兩者總體的表達(dá)趨勢 是相同的 , 認(rèn)為芯片的篩查結(jié)果是可靠的。其中上調(diào)幅度最大為 23.1 倍, 進(jìn)一步提高篩選標(biāo)準(zhǔn)后表達(dá)下調(diào)的基因無入 選。對表達(dá)上調(diào)的基因進(jìn)行功能分類有以下幾種 :1 、熱休克蛋白。2、立即早期基因。 3、生長因子。4、凋亡相關(guān)基因。 5、其他如炎癥相關(guān)因子。3. 地爾硫卓不同時(shí)間點(diǎn)左心室注射對頓抑心肌功能的影響與假手術(shù)組比較,其他各組在缺血及再灌注 20 分鐘后均出現(xiàn)心率增快 ,LVSP、 LVDP、 LV dp/dtmax降低（Pv 0.05 ）;與心肌頓抑組比較，缺血期注射地爾硫卓 組再灌注60分鐘時(shí)LV dp/dtmax明顯改善（Pv 0.05 ）,再灌注90 分鐘時(shí)LVSP LVDP明顯改善（Pv 0.05 ）,至再灌注120分鐘時(shí)LV dp/dtmax 基本恢復(fù)至缺血前水平 ; 而再灌注早期注射地爾硫卓組在 再灌注90分鐘LV dp/dtmax明顯改善（Pv 0.05）,再灌注120分 鐘時(shí)LVSP LVDP明顯改善（Pv 0.05）;而再灌注晚期注射地爾硫卓組在再灌注 后 LVSP LVDP LV dp/dtmax 無明顯改善（P0.05 ）。結(jié)論 1.大鼠 開胸前降支結(jié)扎再灌注方法的心肌頓抑模型是成功可行的。2.心肌頓抑通時(shí)一些基因的表達(dá)發(fā)生改變 ,其中表達(dá)倍數(shù)較高的基因多