實驗三___線粒體活體染色

1、線粒體活體染色 n實驗目的：實驗目的： 掌握線粒體活體染色的方法與原理掌握線粒體活體染色的方法與原理 n實驗原理：實驗原理： 線粒體是細胞內(nèi)一種重要細胞器，是細胞進行呼吸作用的場所。線粒體是細胞內(nèi)一種重要細胞器，是細胞進行呼吸作用的場所。 活活 體染色是應用無毒或毒性較小的染色劑真實地顯示活細胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu)而體染色是應用無毒或毒性較小的染色劑真實地顯示活細胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu)而 又很少影響細胞生命活動的一種染色方法。詹納斯綠又很少影響細胞生命活動的一種染色方法。詹納斯綠 B是線粒體的專一是線粒體的專一 性活體染色劑。呈堿性，具有脂溶性，能夠穿過細胞膜進入細胞內(nèi)，并性活體染色劑。呈堿性，具有脂溶性，能夠穿

2、過細胞膜進入細胞內(nèi)，并 通過其結(jié)構(gòu)中帶有正電荷的染色基團結(jié)合到帶負電荷的線粒體內(nèi)膜上。通過其結(jié)構(gòu)中帶有正電荷的染色基團結(jié)合到帶負電荷的線粒體內(nèi)膜上。 線粒體中細胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)呈藍綠色，而在周圍的細線粒體中細胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)呈藍綠色，而在周圍的細 胞質(zhì)中染料被還原，成為無色狀態(tài)。胞質(zhì)中染料被還原，成為無色狀態(tài)。 線粒體活體染色 活體染色：是使生活有機體的細胞或組織特異性著色，活體染色：是使生活有機體的細胞或組織特異性著色， 但對該樣本又沒有毒害作用的一種染色方法。但對該樣本又沒有毒害作用的一種染色方法。 目的：既顯示活體細胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，又不影響細胞目的：既顯示活體

3、細胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，又不影響細胞 的生命活動和產(chǎn)生任何物理和化學變化以致細胞的死亡。的生命活動和產(chǎn)生任何物理和化學變化以致細胞的死亡。 應用：活體染色技術(shù)可用來研究生活狀態(tài)下的細胞形應用：活體染色技術(shù)可用來研究生活狀態(tài)下的細胞形 態(tài)結(jié)構(gòu)和細胞生理、病理狀態(tài)態(tài)結(jié)構(gòu)和細胞生理、病理狀態(tài) 線粒體活體染色 1、人口腔粘膜上皮細胞活體染色顯示線粒體 （1）用消毒牙簽刮取口腔粘膜細胞，用力應稍重些， 以便得到生活力教旺盛的細胞，將刮取物涂在載玻片 中央。 （2）滴1滴詹納斯綠B染液于細胞涂片處，23分鐘后 蓋上蓋玻片。 （3）用顯微鏡觀察，在高倍鏡下可見細胞質(zhì)中散在一 些被染成亮綠色的短棒狀和圓形顆粒，即為

4、線粒體。 線粒體活體染色 小鼠肝細胞中線粒體的顯示 實驗四 染色體標本制備 染色體標本制備 n實驗目的： 初步掌握動物骨髓（精巢細胞）染色體 標本制備基本過程，了解操作步驟的原 理。 染色體標本制備 實驗原理： 染色體是細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的載體。骨髓細胞具有高度 的分裂能力，可直接觀察到細胞周期中的各個時相。但通 常情況下，中期染色體在鏡下的數(shù)量較少，如經(jīng)秋水仙素 處理后，分裂的骨髓細胞大多被阻斷在有絲分裂中期，經(jīng) 離心、低滲、固定、滴片等步驟，便可得到理想的染色體 標本，用以觀察中期染色體形態(tài)和染色體組型分析等實驗。 實驗儀器、用具實驗儀器、用具 n天平 n離心機 n溫箱 n顯微鏡 n酒精燈 n

5、注射器 n解剖盤 n解剖剪 n刀片 n離心管 n吸管 n燒杯 n冰凍載玻片 染色體標本制備 骨髓細胞染色體標本制備 1. 秋水仙素處理動物：按4g/g體重的劑量經(jīng)腹腔注 射秋水仙素，34h后殺死動物。 2. 取骨髓取出動物后肢的股骨，剪去兩端骨骺。 用注射器吸取2ml 0.075M KCl溶液注入骨髓腔，將 骨髓細胞沖入離心管中，用吸管反復吸打骨髓細胞， 使細胞團塊分散。 3. 加至5ml低滲液，吹打后將離心管置37水浴中低滲 20min。 精巢細胞染色體標本制備 1. 秋水仙素處理動物：按4g/g體重的劑量經(jīng)腹腔注 射秋水仙素，34h后殺死動物。 2. 取雄性小鼠睪丸及附睪組織，將其放在平皿

6、中。加入 2ml 0.075M KCl低滲液，用剪子剪開睪丸及附睪組 織，使精細胞游離出來，吸取上清液轉(zhuǎn)移到離心管中。 3. 加至5ml低滲液，吹打后將離心管置37水浴中低滲 20min。 染色體標本制備 4. 1000rmin離心8min。，棄上清液。 5. 固定：加入新配制的甲醇：冰醋酸(3：1)固定液5ml， 立即用吸管將細胞輕輕吸打均勻，靜置固定20min。 （如此反復固定23次，每次20min。） 6. 滴片：固定的細胞經(jīng)離心后，吸去上層固定液，加入 少量新配制的固定液，將細胞團塊輕輕吸打成懸液。 在干凈、冰冷的載玻片上滴23滴上層細胞懸液， 在酒精燈上文火烘干。 染色體標本制備 7

7、. 染色：將玻片標本放于染缸中，用1：10 Giemsa應 用液染色10min。 8. 沖洗：在自來水管下細流水沖洗15s。 9. 觀察：用濾紙吸干玻片標本，置于顯微鏡觀察。 染色體標本觀察 1. 在顯微鏡下可觀察到染色體被Giemsa應用液染為紫 紅色或桃紅色。小鼠染色體數(shù)目2n=40。 2. 在低倍鏡下可見較多的圓形的間期細胞核。尋找染 色體分散良好的中期分裂相，移至視野中央，然后 用油鏡觀察。在油鏡下，可見40條清晰的染色體， 每條染色體中，還可以見到著絲粒、染色體長臂和 短臂等特征。 油鏡下小鼠骨髓細胞染色體 油鏡下觀察 染色體標本觀察 線粒體活體染色 線粒體活體染色 A C C M

8、M N 線粒體電鏡觀察 線粒體電鏡觀察 C C M N MV L C B M M N N N MVMV L L 線粒體電鏡觀察 線粒體活體染色 染色體標本制備 實驗原理： 染色體是細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的載體。骨髓細胞具有高度 的分裂能力，可直接觀察到細胞周期中的各個時相。但通 常情況下，中期染色體在鏡下的數(shù)量較少，如經(jīng)秋水仙素 處理后，分裂的骨髓細胞大多被阻斷在有絲分裂中期，經(jīng) 離心、低滲、固定、滴片等步驟，便可得到理想的染色體 標本，用以觀察中期染色體形態(tài)和染色體組型分析等實驗。 染色體標本制備 實驗原理： 染色體是細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的載體。骨髓細胞具有高度 的分裂能力，可直接觀察到細胞周期中的各個時相。但通 常情況下，中期染色體在鏡下的數(shù)量較少，如經(jīng)秋水仙素 處理后，分裂的骨髓細胞大多被阻斷在有絲分裂中期，經(jīng) 離心、低滲、固定、滴片等步驟，便可得到理想的染色體 標本，用以觀察中期染色體形態(tài)和染色體組型分析等實驗。 精巢細胞染色體標本制備 1. 秋水仙素處理動物：按4g/g體重的劑量經(jīng)腹腔注 射秋水仙素，34h后殺死動物。 2. 取雄性小鼠