DNA粗提取與鑒定導(dǎo)學(xué)案

1、【課題5】：課題1 DNA的粗提取與鑒定【知識(shí)回顧】一、實(shí)驗(yàn)原理1、提取DNA的方法提取生物大分子的基本思路是。對(duì)于DNA的粗提取而言，就是要利用 、等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異提取DNA，去除其他成分。1) DNA的溶解性思考題1 ： DNA在氯化鈉溶液中的溶解度有什么特點(diǎn)對(duì)此有什么應(yīng)用2) DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性蛋白酶能水解，但是對(duì)沒(méi)有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60-80C的高溫，而DNA在以上才會(huì)變性。洗滌劑能夠瓦解，但對(duì)DNA沒(méi)有影響。3) DNA的鑒定思考題2 :依據(jù)什么原理來(lái)鑒定DNA在條件下DNA遇會(huì)被染成色因此二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1、實(shí)驗(yàn)材料的

2、選取凡是含有 的生物材料都可以考慮，但是使用 的生物組織，成功的可能性更大。2、破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液1)制備和提取細(xì)胞核物質(zhì)：動(dòng)物細(xì)胞的破碎比較容易，以雞血細(xì)胞為例。在雞血細(xì)胞液中加入一定量的 同時(shí)用攪拌，得到雞血細(xì)胞液。過(guò)濾后收集研如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞需要先用 溶解細(xì)胞膜。例如，提取洋蔥的 DNA時(shí)，在切 2)溶解細(xì)胞核的DNA :碎的洋蔥中加入一定的和，進(jìn)行充分的攪拌和研。過(guò)濾后收集研磨液。向收集的濾液中加入的溶液攪拌使DNA呈溶解狀態(tài)。3、去除濾液中的雜質(zhì)方案一的原理是DNA在不同濃度NaCI溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質(zhì)，不分 解DNA ；方案三的原理是蛋白

3、質(zhì)和DNA的變性溫度不同。4、DNA的析出與鑒定將處理后的溶液過(guò)濾，加入與濾液體積 、冷卻的，靜置，溶液中會(huì)出現(xiàn)，這就是粗提取的DNA。用玻璃棒攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。取兩支20ml的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為的NaCI溶液5ml，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4ml的。混合均勻后，將試管置于中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩支試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變 。三、實(shí)驗(yàn)案例：以雞血細(xì)胞DNA的提取和鑒定為例：1 .制備雞血細(xì)胞液：在雞血中加入質(zhì)量濃度為0. 1g/mL的檸檬酸鈉溶液，離心處理；加入檸檬酸鈉的

4、目的：2 提取雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì)：向雞血細(xì)胞液中加入蒸館水，攪拌、過(guò)濾； 思考1 ：加入蒸憎水的目的是什么為什么能達(dá)到此目的3 溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA :加入2mol/L的氯化鈉溶液，攪拌，使DNA呈溶解狀態(tài)；4 析出含DNA的黏稠物：加入蒸憎水，用玻璃棒攪拌；思考題2 :此時(shí)加入蒸憎水的目的是什么 5 .濾取含DNA的黏稠物：過(guò)濾；思考題3:這次過(guò)濾與上次過(guò)濾的目的一樣嗎為什么6 .將DNA的黏稠物再溶解：加入2mol/L的氯化鈉溶液，攪拌，使DNA呈溶解狀態(tài)；7 過(guò)濾含有DNA的氯化鈉溶液：思考題4：這一步驟過(guò)濾的目的是什么思考題5 :為什么反復(fù)地溶解與析出DNA,能夠去除雜質(zhì)8. 提取含

5、雜質(zhì)較少的DNA :加入冷卻的95%的酒精，攪拌；思考題6 ：這一步驟的目的是什么 9. DNA的鑒定：取兩支試管，各加入0. 015mol/L的氯化鈉溶液5mL, 支加入提取的DNA,兩支 各加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝笾糜诜兴屑訜帷Ｋ?、操作提示1、以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100ml血液中需要加入3g，防止。2、 加入洗滌劑后，動(dòng)作要，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟地操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要，以免，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。3、二苯胺試劑要 ，否則會(huì)影響鑒定的效果。4、DNA的溶解度與NaCI溶液濃度的矢系：當(dāng)NaCI溶液濃度低于L時(shí)，隨濃度的升高，DNA的

6、溶解度降低；當(dāng)NaCI溶液濃度高于L時(shí)，隨濃度 升高，DNA的溶解度升高。5盛放雞血細(xì)胞液的容器，最好是塑料容器。雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的 DNA，容易被玻璃容器吸附，由于細(xì)胞內(nèi)DNA的含量本來(lái)就比較 少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就會(huì)更少。因此，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中最好使用塑料的燒杯和試管，這樣可以減少提取過(guò)程的DNA的損失。典例解析本實(shí)驗(yàn)中有三次過(guò)濾：過(guò)濾用蒸館水稀釋過(guò)的雞血細(xì)胞液過(guò)濾含粘稠物的LNaCI溶液過(guò)濾溶解有DNA的2mol/LNaCI溶液 以上三次過(guò)濾分別為了獲得（）A含核物質(zhì)的濾液、紗布上的粘稠物、含 DNA的濾液 B含核物質(zhì)的濾液、濾液中DNA粘稠物、含DNA的濾液c含

7、核物質(zhì)的濾液、濾液中DNA粘稠物、紗布上的DNAD含較純的DNA濾液、紗布上的粘稠物、含DNA的濾液答案：A解析：用蒸憾水稀釋雞血細(xì)胞液，使血細(xì)胞的細(xì)胞膜、核膜破裂，釋放出核物質(zhì)，此時(shí)過(guò)濾只 能得到含DNA和其他物質(zhì)如蛋白質(zhì)的濾液，這種濾液必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)中其他步驟得相繼處理，方能得到 較純的DNA。DNA在LNaCI溶液中溶解度最低，成絲狀粘稠物，可經(jīng)過(guò)濾 留在紗布上。【習(xí)題鞏固】一、選擇題（10個(gè)）1 在研究DNA的基因樣本前，采集來(lái)的血樣需要蛋白水解酶處理，然后用有機(jī)溶劑除去蛋白質(zhì)。用蛋白水解酶處理血樣的目的是（）A.除去血漿中的蛋白質(zhì)B.除去染色體上的蛋白質(zhì)C.除去血細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)D.除

8、去血細(xì)胞中的所有的蛋白質(zhì)，使DNA釋放，便于進(jìn)一步提純2 與析出DNA粘稠物有尖的敘述，不正確的是（）A. 操作時(shí)緩緩滴加蒸館水，降低DNA的溶解度B. 在操作A時(shí)，用玻璃棒輕緩攪拌，以保證DNA分子完整C加蒸館水可同時(shí)降低DNA和蛋白質(zhì)的溶解度，兩者均可析岀D.當(dāng)絲狀粘稠物不再增加時(shí)，此時(shí)NaCI的濃度相當(dāng)于L3.洗滌劑能夠瓦解（），但對(duì)DNA沒(méi)有影響。A.細(xì)胞壁B.細(xì)胞膜C細(xì)胞核D.細(xì)胞質(zhì)4.在沸水浴的條件下，DNA遇（）會(huì)被染成藍(lán)色。A.斐林試劑B.蘇丹川染液C雙縮腺試劑5.用塑料試管和燒杯，目的是（A.不易破碎B.減少提取過(guò)程中DNA的損失D.二苯胺在DNA提取過(guò)程中，最好使）C增加D

9、NA的含量D.容易洗刷6. 下列操作中對(duì)DNA的提取量影響最小的是（）A. 使雞血細(xì)胞在蒸鐳水中充分破裂，放出 DNA等核物質(zhì)B. 攪拌時(shí)，要使用玻璃棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌C在“析出DNA粘稠物”時(shí)，要緩緩加蒸飽水，直至溶液中粘稠物不再增加D.在用酒精沉淀DNA時(shí)，要使用冷酒精，甚至再將混合液放入冰箱中冷卻E在DNA的溶解和再溶解時(shí)，要充分?jǐn)嚢?.的、冷卻的（色絲狀物。DNA的粗提取中，將與濾液體積相等 ），靜置2 3min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白.9%的NaCI的NaCI溶液C.質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的HCI D.體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液8.以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，需要向血液中加入（），防止血液凝固。A.醋酸鈉

10、B.龍膽紫C檸檬酸鈉D醋酸洋紅9在向溶解DNA的NaCI溶液中，不斷加入蒸館水的目的是（）A.加快溶解DNA的速度B.加快溶解雜質(zhì)的速度C減少DNA的溶解度，加快DNA析出D.減小雜質(zhì)的溶解度，加快雜質(zhì)的析出10.時(shí)，直接在濾液中加入嫩肉粉，利用嫩肉粉中的（去除濾液中的雜質(zhì)）分解蛋白質(zhì)。A.胃蛋白酶B胰蛋白酶C.木瓜蛋白酶D.腸肽酶二、非選擇題（3個(gè)）1 提取雞血中DNA時(shí)，要除去血液中的上清液，這是因?yàn)槭裁? 填寫(xiě)本實(shí)驗(yàn)完成下列實(shí)驗(yàn)操作時(shí)所用試劑。提取雞血細(xì)胞中核物質(zhì) 溶解核內(nèi)DNA： 析出2mol/LNaCI溶液中的DNADNA粘稠物的再溶解提取雜質(zhì)較少的DNA白色乳狀絲狀物（6）DNA的

11、鑒定3尖于DNA粗提取的實(shí)驗(yàn)材料的選擇，也經(jīng)過(guò)了多次實(shí)驗(yàn)效果的比較，最終選擇雞血做實(shí)驗(yàn)材料的原 因是什么請(qǐng)回答下列問(wèn)題：雞血細(xì)胞中紅細(xì)胞 ，家雞屬于鳥(niǎo)類(lèi)，新陳代謝旺盛，因而血液中 細(xì)胞數(shù)目較多，可以提供豐富的 。生活在牧區(qū)的人們，采集牛、羊和馬血比較方便，若他們按實(shí)驗(yàn)要求完成實(shí)驗(yàn)步驟后，結(jié)果是這是因?yàn)檫@些動(dòng)物和人一樣成熟的紅細(xì)胞中 但若改用動(dòng)物肝臟做實(shí)驗(yàn)材料， 實(shí)驗(yàn)?zāi)茼樌M(jìn)行。這是因?yàn)镺若選用動(dòng)物肝臟做實(shí)驗(yàn)材料，在提取之前，最好增加 程序,使組織細(xì)胞更易分離。【疑難點(diǎn)撥】1 為什么加入蒸館水能使雞血細(xì)胞破裂答：蒸館水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi),使血細(xì)胞脹裂，再加上

12、攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂（細(xì)胞膜和核膜的破裂），從而釋放出DNA。2 加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么答：洗滌劑是一些離子去污劑， 能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCI, 有利于DNA的溶解。3 如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響答：研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的 DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致 看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。4 此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。5. 為什么反復(fù)地溶解與析出 DNA，能夠去除雜質(zhì)答:用高鹽濃度的溶液溶解DNA,能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；

13、用低鹽濃度使DNA析出，能除去 溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。6 .方案二與方案三的原理有什么不同答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi)；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。7. DNA的溶解度與NaCI溶液濃度的矢系：當(dāng)NaCI溶液濃度低于L時(shí)，隨濃度的升高 DNA的溶解度降低；當(dāng)NaCI溶液濃度高于L時(shí)，隨濃度升高，DNA的溶解度升高。思考題5、加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA ；蒸憎水對(duì)于雞血細(xì)胞 來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可

14、以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂。思考題6、使氯化鈉溶液濃度接近0. 14mol/L，使DNA最大限度地析出。思考題7、不一樣；這次過(guò)濾是為了去除不溶于氯化鈉溶液的雜質(zhì)，而上次過(guò)濾是為了去除破裂的細(xì) 胞膜等物質(zhì)。思考題8、除去含有DNA濾液中的雜質(zhì)；思考題9、用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出， 能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同 的多種雜質(zhì)。思考題10、去除溶于酒精的雜質(zhì)；思考題11、可抑制核酸水解酶的活性，防止降解DNA ；降低分子的運(yùn)動(dòng)，易于形成沉淀析出；低溫有利于增加DNA分子柔韌性，