分子診斷學(xué)：第十一章 遺傳性疾病的臨床分子診斷

1、第十一章第十一章 遺傳性疾病的臨床分子診斷遺傳性疾病的臨床分子診斷 什么是遺傳?。╣enetic disorders） n典型的遺傳病指由于遺傳（inheritance）了 特殊的突變型基因而致病的一類疾病。 n指完全或部分由遺傳物質(zhì)即DNA改變引起的 疾病。 n幾乎所有的疾病都受遺傳物質(zhì)的影響，這些 致病基因有的直接來(lái)自父母，有的來(lái)自后天 的隨機(jī)突變或者環(huán)境致變； 遺傳病的分類 n單基因遺傳?。╩onogenetic disorders）， 又稱孟德爾遺傳病，如鐮狀細(xì)胞病，多囊 性腎??； n多因子遺傳病（multifactorial inheritance disorders）如糖尿病，腫瘤

2、，精神??； n染色體病（chromosome disorders）如21 三體 n線粒體遺傳?。╩itochondrial disorders）， 母系遺傳 遺傳病分子診斷的主要內(nèi)容及意義 n分析患者的核酸（DNA或RNA）、蛋白質(zhì)、染 色體和某些代謝產(chǎn)物來(lái)揭示與該遺傳病發(fā)生相 關(guān)的致病基因、基因型、基因突變、染色體核 型等； n對(duì)已知致病基因結(jié)構(gòu)與功能分析，對(duì)未知致病 基因的定位。 n有利于對(duì)遺傳病進(jìn)行早預(yù)防、早診斷和早治療， 從而達(dá)到減少或控制某些遺傳病的發(fā)病、減輕 癥狀和改善預(yù)后的目的； 遺傳病的分子診斷策略 n直接診斷策略 (direct diagnosis) 直接揭示導(dǎo)致遺傳病發(fā)生的

3、各種遺傳缺陷，包括DNA中堿基的 點(diǎn)突變、缺失、插入、倒位、重復(fù)或重排等結(jié)構(gòu)變化，或者由 于結(jié)構(gòu)變化與轉(zhuǎn)錄異常導(dǎo)致的基因表達(dá)量的改變等。 n間接診斷策略 (indirect diagnosis) 通過(guò)對(duì)遺傳標(biāo)記的多態(tài)性判斷染色體單倍型是否與致病基因連鎖，從 而判斷被檢者患病的風(fēng)險(xiǎn)以及是否為致病基因攜帶者。 n直 接 診 n斷 突變的DNA在向子代傳遞 的過(guò)程中進(jìn)一步發(fā)生改變， 主要以重復(fù)序列拷貝數(shù)的 增加為主。 靜態(tài)突變 (stationary mutation) 動(dòng)態(tài)突變 (dynamic mutation) 突變的DNA分子能夠 穩(wěn)定地遺傳，使子代 保持突變DNA的穩(wěn)定性 點(diǎn)突變 缺失 位

4、點(diǎn)確定：PCR-ASO/ASP-PCR/PCR- RFLP/gene chip/PCR-ELISA 位點(diǎn)不明：PCR-SSCP/DGGE/DNA Sequencing/ 小片段的變化可借鑒點(diǎn)突變檢測(cè)方法 大片段異常：Southern blot/多重-PCR 根據(jù)DNA異常情況可直接檢測(cè) 利用PCR/Southernblot檢測(cè)DNA, RT-PCR/Northern blot檢測(cè)mRNA, ELISA/Western blot/IH/p-Chip檢測(cè)蛋白 n間 接 診 斷 連鎖分析 linkage analysis 關(guān)聯(lián)分析 relation analysis 通過(guò)覆蓋密度適當(dāng)?shù)倪z傳標(biāo)記在患病

5、家系中進(jìn)行 連鎖分析，以此找到與某一遺傳標(biāo)記緊密連鎖的 致病基因座位，從而確定該基因在染色體上的粗 略位置。 在可能的候選致病基因附近選擇遺傳標(biāo)記，并在 患者和正常個(gè)體間比較，從而得到該遺傳標(biāo)記與 致病基因關(guān)聯(lián)的相對(duì)危險(xiǎn)度。 第一節(jié) 單基因遺傳病的分子診斷 n單基因遺傳?。阂粚?duì)等位基因控制，符 合孟德爾遺傳規(guī)律，從親代向子代垂直 傳遞的疾病。 n目前已發(fā)現(xiàn)有6500種，其中超過(guò)1000種 可以進(jìn)行基因分子診斷； nOMIM: Online Mendelian lnheritance in Man 單 基 因 遺 傳 病 常染色體遺傳 X連鎖遺傳 Y連鎖遺傳 常染色體顯性遺傳 常染色體隱性遺傳

6、X連鎖隱性遺傳 X連鎖顯性遺傳 n一、家系分析 一、家系分析中的注意事項(xiàng) n1、無(wú)家族史的先證者不一定就是隱形遺 傳病患者，有可能來(lái)自自發(fā)突變； n2、外顯不全影響家系分析結(jié)果； n3、遺傳異質(zhì)性導(dǎo)致不同種類的遺傳病被 認(rèn)為是同一種遺傳病； n4、選用的遺傳標(biāo)志不同，有可能得出不 同的遺傳方式的結(jié)論。 二、候選基因篩查 n1、功能克隆（functional cloning） n2、定位克?。╬ositional cloning） n3、候選基因克?。╟andidate gene cloning） 1、功能克?。╢unctional cloning） n利用疾病的已知遺傳突變引起的某一生化功能改

7、變來(lái) 定位基因，進(jìn)而將其克隆； n從表型異常出發(fā)，找出導(dǎo)致出現(xiàn)異常表型的異常功能 蛋白質(zhì)，根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列推導(dǎo)出編碼的核苷 酸序列，以此作為探針，在基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)中 去篩選目的基因或目的cDNA，最后克隆和定位這種異 常蛋白質(zhì)的編碼基因。 2、定位克?。╬ositional cloning） n特點(diǎn)：用疾病表型代替致病基因來(lái)觀察疾病與遺傳標(biāo)記之間的連鎖分離 關(guān)系，無(wú)需預(yù)先知道基因的DNA 順序和其表達(dá)產(chǎn)物的有關(guān)信息； n過(guò)程 n1、首先通過(guò)家系連鎖分析將目標(biāo)基因基因定位在染色體的特定位置； 找到與目標(biāo)基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記； n2、構(gòu)建含有大插入片段的基因組文庫(kù)(BAC 庫(kù)或Y

8、AC) ； n3、以與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選基因組文庫(kù)； n4、用獲得的陽(yáng)性克隆構(gòu)建含目的基因區(qū)域的跨疊群(contig)； n5、通過(guò)染色體步移等技術(shù)獲得含有目標(biāo)基因的大片段克??； n6、通過(guò)亞克隆獲得含有目的基因的小片段克??； n7、通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)驗(yàn)證，最終確定目標(biāo)基因的堿基序列。 三、地中海貧血 n血紅蛋白病 （hemoglobinopathy）： n常見的遺傳性溶血性疾 病，由于編碼血紅蛋白 的基因異常而發(fā)生的一 類遺傳性貧血。 n由4條肽鏈（珠蛋白） 和4分子的血紅素分子 （卟啉亞鐵離子 ） 血紅蛋白病的分類 n1.異常血紅蛋白?。河捎谥榈鞍捉Y(jié)構(gòu)異 常所致，如鐮狀細(xì)

9、胞貧血、不穩(wěn)定血紅 蛋白病、氧親和力異常血紅蛋白病、血 紅蛋白M?。?n2.珠蛋白生成障礙性貧血（地中海貧 血）：由于珠蛋白多肽鏈的合成速率不 平衡引起，分為/型。 珠蛋白基因簇結(jié)構(gòu)模式圖 1 31（117bp）32 99（140bp）100 141 1 30（117bp） 31 104 （850bp） 105 146 珠蛋白基因結(jié)構(gòu)珠蛋白基因結(jié)構(gòu) 珠蛋白基因結(jié)構(gòu)珠蛋白基因結(jié)構(gòu) 珠蛋白基因表達(dá)珠蛋白基因表達(dá) E1 E2 E3 5 -3 Transcription Processing 5-Cap- -polyAAAAA mRNA Translation 異常血紅蛋白病鐮狀細(xì)胞病 （sickle

10、mia） n第一個(gè)被揭示的“分子 病”； n屬于常染色體隱性遺傳病 （AR）; n珠蛋白基因的第6位密碼 子突變，由GAGGTG,導(dǎo) 致珠蛋白第6位氨基酸殘 基由Glu Val 鐮狀細(xì)胞病的分子生物學(xué)檢驗(yàn) n常用方法：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 （RFLP）、等位基因特異性寡核苷酸 （ASO ）探針雜交、等位基因特異性引 物PCR (ASP-PCR) nRFLP: 設(shè)計(jì)特異性引物（包括珠蛋白基 因的第5、6、7位密碼子） PCR 經(jīng) Mst酶切電泳分析/Southern雜交 RFLP n限制性內(nèi)切酶Mst 的識(shí)別序列是 n CCT NAG G, 正常： CCT GAG GAG 編碼 Pro Glu

11、Glu 鐮狀： CCT GTG GAG 編碼 Pro Val Glu 注意：注意：酶切要徹底，防止將正常型誤認(rèn)為攜帶者，設(shè)置正常/ 攜帶者對(duì)照 PCR-RDB交 n1.分別設(shè)計(jì)正常探針和 突變探針； n2. PCR擴(kuò)增含突變點(diǎn)區(qū) 域的序列； n3.將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在雜技膜 上并經(jīng)變性處理； n4.分別用探針與變性的 PCR產(chǎn)物雜交； n5.顯影后觀察判斷結(jié)果； 珠蛋白生成障礙性貧血（地中 海貧血）的檢測(cè) n珠蛋白基因缺失/突變導(dǎo)致某種珠蛋白鏈 合成障礙造成鏈和鏈合成數(shù)量不平衡， 引起的溶血性貧血稱為地中海貧血。 地中海貧血由于珠蛋白基因的缺失或突變使鏈 的合成受到抑制而引起的溶血性貧血，多由缺失

12、引起。 地中海貧血由于珠蛋白基因的缺失或突變使鏈 的合成受到抑制而引起的溶血性貧血，多由突變引起。 地中海貧血的分類 n地中海貧血主要由基因缺失引起，目前全球已鑒定的缺失 超過(guò)20種，我國(guó)常見的類型是（-SEA/）、（-3.7/）、（- 4.2/）； n目前發(fā)現(xiàn)的珠蛋白基因突變至少有68種，其中46種位于 2基因，17種位于1基因，5種位于2和1基因之外， 我國(guó)目前報(bào)道的有12種，主要以（ws/） 、 （cs/） 、 （qs/）三種為主； n突變多數(shù)發(fā)生在一個(gè)基因上，故一般定義為+-地中海貧血 ，記為（ T /）或（ T / ） 地中海貧血的分類 珠蛋白生成障礙的分子機(jī)制 n基因缺失型：不等位

13、交換引起；主要原因 珠蛋白生成障礙的分子機(jī)制 n基因非缺失（突變）型： n錯(cuò)義突變 是由于單個(gè)核苷酸的改變導(dǎo)致由特定三聯(lián)體密碼子編碼的氨基酸的改變，導(dǎo)致蛋 白鏈不穩(wěn)定；如Hb QS 突變 n移碼突變 在正常密碼子中插入或缺失一個(gè)或幾個(gè)堿基,導(dǎo)致該位點(diǎn)后面編碼的氨基酸種類順 序改變，如 CD49（-GC） n無(wú)義突變 原密碼子終止密碼肽鏈合成提前終止 nmRNA加工突變 轉(zhuǎn)錄的mRNA無(wú)法正常剪接或添加polyA尾信號(hào)，如IVS-I-117（GA） n終止密碼子突變 終止密碼編碼氨基酸的密碼，導(dǎo)致肽鏈異常延長(zhǎng)，如Hb CS突變。 分子生物學(xué)檢測(cè) n1. gap-PCR：裂口/跨越斷點(diǎn)PCR 分別

14、設(shè)計(jì)針對(duì)缺失區(qū)域和正常區(qū)域序列的引物 （針對(duì)缺失型）； n2. PCR-RDB n3. Southern雜交：不同類型的內(nèi)切酶切后，用 珠蛋白特異性探針雜交后，根據(jù)片段長(zhǎng)度大 小判斷結(jié)構(gòu)； n4. ASP-PCR：分別設(shè)計(jì)正常引物和突變引物； n5. SSCP:單鏈構(gòu)象多態(tài)性 n6. DNA sequencing 缺失型-地貧的基因檢測(cè) 突變型-地貧的基因檢測(cè) 地中海貧血的分類 n地中海貧血絕大多數(shù)是由于珠蛋白基因不 同類型的點(diǎn)突變所致。這些點(diǎn)突變分別導(dǎo)致 轉(zhuǎn)錄受阻，mRNA前體剪接加工錯(cuò)誤，翻譯無(wú) 效，或合成不穩(wěn)定的珠蛋白鏈而阻礙-二聚 體形成，使珠蛋白鏈不平衡等。 地中海貧血的分類 n目前

15、全世界已發(fā)現(xiàn)珠蛋白基因突變類型200多種， 我國(guó)已報(bào)道48種，其中17種突變約占我國(guó)南方地中 海貧血人群的99%； nCD41-42(-CTTT)、IVS-654(CT) 、-28(AG)、 CD71-72 (+A)、CD17 (AAGTAG)、CD26 (GAGAAG)、CD31(-C)、CD27/28(+C)、IVS-1 (GT)、CD43 (GAGTAG)、-32 (CA)、-29(AG) 、-30 (TC)、CD14-15 (+G)、Cap+40-43(-AAAC) 、Int (ATGAGG)、 IVS-5 (GC) 分子生物學(xué)檢驗(yàn) n1.PCR-RDB(PCR-reverse dot

16、 blot); n2.PCR-ASO(PCR-allele specific oligonucleotide) n3.AS(allele specific)-PCR:多對(duì)引物多重 PCR n4.基因芯片 n5.突變寡核苷酸延伸擴(kuò)增（MOEA） n6. DNA sequencing 突變型-地貧的基因檢測(cè) 3.血友病的分子生物學(xué)檢驗(yàn) n血友病：由于凝血因子缺陷所致的凝血 機(jī)制異常而引起的遺傳性出血性疾病。 n主要分為A、B兩型，均為X連鎖隱性遺傳 n血友病A又稱血友病甲、因子缺乏癥， 主要是由于血漿中缺乏F引起； n血友病B又稱血友病乙、凝血因子缺乏 癥，主要是由于缺乏凝血第9因子； 血友病A（

17、HA） nF位于X染色體長(zhǎng)臂末端，包括26個(gè)外顯子和 25個(gè)內(nèi)含子，全長(zhǎng)186kb，其中外顯子總長(zhǎng)9kb。 n遺傳缺陷由基因缺失和突變組成； n基因缺失主要由第22號(hào)內(nèi)含子倒位引起，約占 HA的50，引起重型血友病 n目前已檢測(cè)到的突變有近600種，其中點(diǎn)突變 占64（無(wú)義突變引起重型HA,錯(cuò)義突變引起 中性和輕型），缺失突變占31（重型），插 入突變占5（重型）； n人F基因結(jié)構(gòu)及基因倒位 HA的分子檢測(cè) n1.直接診斷策略 n長(zhǎng)距離PCR(LD-PCR)：針對(duì)缺失型 n分別涉及針對(duì)內(nèi)含子22中A1基因和其同 源基因A2/A3的引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并 根據(jù)擴(kuò)增帶型鑒定。 n2.間接診斷策略

18、 n突變型中點(diǎn)突變占大多數(shù)(64),且突變位點(diǎn)分 散,無(wú)高頻突變位點(diǎn)，利用F基因與特定的多 態(tài)性遺傳標(biāo)記緊密連鎖的特點(diǎn)，通過(guò)連鎖分析 來(lái)診斷家系成員或開展產(chǎn)前診斷。 nPCR-RFLP nPCR-STR nPCR-VNTR nPCR-SSCP 血友病B（HB） nF基因位于X染色體長(zhǎng)臂2627區(qū)，全長(zhǎng) 33.5kb，含8個(gè)外顯子，內(nèi)含子占整個(gè)基因的 95，編碼461個(gè)氨基酸殘基肽鏈； n基因突變種類繁多，目前已發(fā)現(xiàn)約有700多種， 包括點(diǎn)突變、堿基缺失和插入，突變涉及整個(gè) 基因的每個(gè)位置，其中點(diǎn)突變占80左右，但 是大片段的缺失和基因重排較為少見； HB的分子檢測(cè) n直接診斷： n包括southern雜交、DNA測(cè)序、基因芯片、 毛細(xì)管電泳、 n間接診斷： n包括RFLP（XmnI、EcoRI、TaqI）、 V