醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗：小鼠脾臟單個核細胞分離及流式細胞術(shù)染色

1、小鼠脾臟單個核細胞分離及小鼠脾臟單個核細胞分離及 流式細胞術(shù)染色流式細胞術(shù)染色 實驗四實驗四 小鼠脾臟脾臟位于上腹部左后側(cè)， 體積較大，長條形體積較大，長條形，屬于外外 周免疫器官周免疫器官。 外周血中淋巴細胞可經(jīng)再循 環(huán)駐入脾臟等外周免疫器官 的特定區(qū)域，所以富含各類 免疫細胞。 解剖圖解剖圖 脾臟功能脾臟功能 占全身淋巴組織總量的25%，含有大量的淋巴細胞和巨嗜淋巴細胞和巨嗜 細胞細胞，是機體細胞免疫和體液免疫的中心機體細胞免疫和體液免疫的中心 通過多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用. 脾臟切除導(dǎo)致細胞免疫和體液 免疫功能的紊亂，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展 人和脊椎動物最大的淋巴器官最大的淋巴器官。人的脾臟

2、位于左季肋區(qū)的 后外側(cè)部，呈卵圓形，脾是血循環(huán)中重要的濾過器濾過器，能清除血 液中的異物、病菌以及衰老死亡的細胞，特別是紅細胞和血小 板。 為實質(zhì)性器官，質(zhì)軟而脆，若受暴力作用，易破裂出血而成為 急腹癥急腹癥。 實驗原理實驗原理 細胞濃度細胞濃度 =(W1+W2+W3+W4)/4 =(W1+W2+W3+W4)/410104 4/ml/ml稀釋倍數(shù) 細胞計數(shù)細胞計數(shù) W1 W2 W3 W4 3mm 計數(shù)原則：計數(shù)原則： 邊界線：上計下不計；左計右不計 血球汁數(shù)板使用后,用自來水沖洗,切勿用硬物洗刷,洗 后自行晾干或用吹風機吹干 臺盼藍原理臺盼藍原理: 正常正常的活細胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整胞膜結(jié)構(gòu)完整，

3、能夠排斥排斥臺盼藍，使之不 能夠進入胞內(nèi)。喪失活性或細胞膜不完整的細胞，胞膜的通透 性增加，可被臺盼藍染成藍色藍色。通常認為細胞膜完整性喪失細胞膜完整性喪失， 即可認為細胞已經(jīng)死亡死亡。 lived dead 實驗材料：實驗材料： 小鼠小鼠 手術(shù)器械（剪刀、鑷子）、酒精噴壺手術(shù)器械（剪刀、鑷子）、酒精噴壺 平皿，尼龍膜指套、研磨棒平皿，尼龍膜指套、研磨棒 PBSPBS緩沖液、紅細胞裂解液（緩沖液、紅細胞裂解液（ACKACK） 細胞計數(shù)板細胞計數(shù)板 0.2%0.2%臺盼藍染液臺盼藍染液 顯微鏡顯微鏡（關(guān)掉之前，請把光度調(diào)到最小?。P(guān)掉之前，請把光度調(diào)到最小?。?（一）取小鼠脾臟： F小鼠頸椎脫

4、位處死（注意安全注意安全）； F用75%酒精噴小鼠腹部，使其皮毛沾濕。用剪刀，剪開皮膚 暴露腹腔，再找到脾臟，勁量剪除脾臟周圍組織； 實驗步驟實驗步驟 （二）制備單個核細胞懸液： F將取出的脾臟置于盛有3mlPBS緩沖液的平皿中，然后再 置于尼龍指套中。用針芯輕輕碾磨使單個核細胞通過尼 龍指套懸浮于平皿中；再取3mlPBS沖洗培養(yǎng)皿后移入 15ml離心管。 F1500rpm離心5min(注意配平注意配平）。棄去上清，加ACK至 2ml，輕輕吹打混勻并放置2min，以破壞紅細胞。然后 加PBS緩沖液1ml，以1500rpm離心5min； F棄去上清，加PBS緩沖液1ml到離心管中，吹打混勻即為

5、小鼠脾臟單個核細胞懸液。 （三）計算細胞濃度 F將上述細胞懸液做一定倍數(shù)（10倍左右）的稀釋（小鼠脾小鼠脾 臟細胞一般為臟細胞一般為1x101x107 7-2x10-2x108 8）； F混勻稀釋后，取10uL加至細胞計數(shù)板中(不要有氣泡不要有氣泡），計 數(shù)細胞計數(shù)板中4大方格細胞總數(shù)； F計算細胞總數(shù)： 細胞濃度細胞濃度=4=4個大方格細胞總數(shù)個大方格細胞總數(shù)/4/4* *10104 4* *稀釋倍數(shù)。稀釋倍數(shù)。 細胞總數(shù)細胞總數(shù)=細胞濃度細胞濃度x x細胞懸液的體積細胞懸液的體積 （四）計算細胞活力 F10l細胞懸液+ 10l的0.2%苔盼蘭溶液并混勻； F顯微鏡下觀察，如果細胞被染成藍色

6、，旋轉(zhuǎn)顯微鏡微調(diào) 節(jié)鈕，細胞無反光，則為死亡；而細胞不被染色，晶瑩 透亮，旋轉(zhuǎn)顯微鏡調(diào)節(jié)鈕，細胞明顯反光而且有立體感， 為活細胞； F計算細胞活力：計數(shù)活細胞的百分率，一般活力應(yīng)在 95%以上。 注意：注意： 細胞總數(shù)和細胞活力可以一起做 細胞總數(shù)=視野內(nèi)活細胞數(shù)+死細胞數(shù) 細胞活力=活細胞數(shù)/總數(shù)x100% 1.頸椎脫臼處死小鼠頸椎脫臼處死小鼠：用拇指和食指用力往下按住鼠頭，另一只手抓住 鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之頸椎脫臼，造成脊髓與腦髓斷離 2.摘取脾臟摘取脾臟：用75%酒精噴小鼠腹部，使其皮毛沾濕。用剪刀，剪開皮 膚暴露腹腔，再找到脾臟，盡量剪除脾臟周圍組織 3.研磨脾臟研磨脾臟：在

7、培養(yǎng)皿中加入3mlPBS，將脾臟放入過濾網(wǎng)制成的指套中， 再放入培養(yǎng)皿中，用注射器的活塞棒或研棒將脾臟研碎。將含有脾臟細 胞的PBS移入15ml離心管。再取3mlPBS沖洗培養(yǎng)皿后移入15ml離心管。 4.離心離心：1500rpm，4，5min，去上清，彈散細胞沉淀 5.裂解紅細胞裂解紅細胞：加入2ml紅細胞裂解液，吹打混勻細胞，裂解2min后， 加入1ml PBS終止 6.離心離心：1500rpm，4，5min，去上清，彈散細胞沉淀，加入1mlPBS， 吹打混勻,過指套，細胞進行計數(shù)。 7.計數(shù)計數(shù)：可用1.5mlEP管將細胞稀釋10倍后，再利用血球計數(shù)板進行計數(shù)， 10l細胞懸液+ 10l

8、的0.2%苔盼蘭溶液混勻區(qū)分死（活）細胞 注意：步驟2以后，盡量在冰上或其他低溫環(huán)境下進行操作 （五）流式細胞術(shù)染色 1.收集細胞：取細胞總數(shù)約1x106-5x106脾臟細胞于1.5ml EP 管中（在 管蓋上標記好組別），1500rpm， 4，5min（離心機需預(yù)冷） 2.染色：小心用槍吸去上清，再加入50ul預(yù)混抗體的PBS（ CD3抗體 100倍稀釋； CD4抗體200倍稀釋； CD8抗體500倍稀釋），將細胞吹 打混勻，避光，415-20min 3.清洗：加500ulPBS,吹打混勻后， 5000rpm， 4，5min 4.檢測：小心用槍去除上清，再加入500ul PBS吹打混勻，置于

9、冰上， 流式細胞儀檢測 CD3： T cell CD4+ T cell； CD8+ T cell F通常分離細胞是為了下一步實驗。有些實驗如需要對細 胞作進一步培養(yǎng)，則在分離細胞時一定要嚴格無菌操作。 F在用ACK破壞紅細胞時，不要時間過長，以免破壞其他 細胞。 F計數(shù)完畢后請立即清洗細胞計數(shù)板！計數(shù)完畢后請立即清洗細胞計數(shù)板！ F所有器械洗凈擺好，老鼠尸體統(tǒng)一放入垃圾袋送至所有器械洗凈擺好，老鼠尸體統(tǒng)一放入垃圾袋送至516516 補充知識補充知識 思考題思考題 1.實驗過程中注意問題有哪些？ 1頸椎脫臼法：是大、小鼠最常用的處死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠頭，另一只手抓住鼠尾，用力稍向

10、后上方一拉，使之頸椎脫日，造成脊髓 與腦髓斷離，動物立即死亡。 2空氣栓塞法：主要用于大動物的處死，用注射器將空氣急速注入靜脈，可 使動物致死。當空氣注入靜脈后，可在右心隨著心臟的跳動使空氣與血液相 混致血液呈泡沫狀，隨血液循環(huán)到全身。如進入肺動脈，可阻塞其分支，進 入心臟冠狀動脈，造成冠狀動脈阻塞，發(fā)生嚴重的血液循環(huán)障礙，動物很快 致死。 3急性大失血法：用粗針頭一次采取大量心臟血液，可使動物致死。 4吸入麻醉致死法：應(yīng)用乙醚吸入麻醉的方法處死。大、小鼠在2030秒 陷人麻醉狀態(tài)，35min死亡。 5注射麻醉法：應(yīng)用戊巴比妥鈉注射麻醉致死。 6 吸入二氧化碳：此法安全、人道、迅速，被認為是處

11、理嚙齒類的理想方 法，國外現(xiàn)多采用此法。可將多只動物同時置入一個大箱或塑料袋內(nèi)，然后 充入CO2，動物在充滿CO2的容器內(nèi)l3min內(nèi)死去。 實驗小鼠處死方法 1頸椎脫臼法：是大、小鼠最常用的處死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠頭，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之頸椎脫日，造成脊髓 與腦髓斷離，動物立即死亡。 2空氣栓塞法：主要用于大動物的處死，用注射器將空氣急速注入靜脈，可 使動物致死。當空氣注入靜脈后，可在右心隨著心臟的跳動使空氣與血液相 混致血液呈泡沫狀，隨血液循環(huán)到全身。如進入肺動脈，可阻塞其分支，進 入心臟冠狀動脈，造成冠狀動脈阻塞，發(fā)生嚴重的血液循環(huán)障礙，動物很快 致死。 3急性大失血法：用粗針頭一次采取大量心臟血液，可使動物致死。 4