非蛋白氮的概述和檢測(cè)方法

1、非蛋白氮的概述和檢測(cè)方法1發(fā)布時(shí)間：2002-11-08非蛋白氮的概述非蛋白氮大致可以分為以下幾類，尿素及其衍生物類，如縮二脲、羥甲基尿素等；氨態(tài)氮類，如液氨、氨水等；銨類，如硫酸銨、氯化銨等；肽類及其衍生物，包括氨基酸、酰胺、胺等；動(dòng)物糞便及其它廢棄物類。以下是幾種常見(jiàn)的 非蛋白氮的介紹：1l雙縮脲又稱縮二脲，是一種尿素縮合產(chǎn)品，其含氮量在 35上，蛋白質(zhì)當(dāng)量為 219?？s二脲難溶于水，一般的定量檢驗(yàn)方法為紫紅色配位化合物比色法（原理：魚粉中的雙縮脲經(jīng)抽提后，在酒石酸鈉的堿性溶液中與硫酸銅生成紫紅色配位化合物，在 550nm 波長(zhǎng)下比色從而測(cè)出其含量）。12尿素是氮和二氧化碳在高溫高壓下化合

2、而成。純尿素的含氮量為 47，折合蛋白當(dāng)量為 29375。易潮解，易溶于水，一般的定量檢驗(yàn)方法有二種：一種為二甲基氨基苯甲醛顯色法；另一種為二嗪衍生物顯色法。但以上兩種方法只能測(cè)定游離性尿 素而不能測(cè)定其衍生物。13尿素甲醛聚合物是由尿素和甲醛聚合而成，其含氮量為 38.89，折合蛋白當(dāng)量為 24306。該聚合物難溶于水。14硫酸銨俗稱肥田粉，其含氮量為 20左右，折合蛋白當(dāng)量為 125。硫酸銨的工業(yè)品一般為白色或微帶黃色的結(jié)晶，易溶于水，其分子式為（nh4）2so4。15異亞丁基二脲又名二脲異丁烷，簡(jiǎn)稱 ibdu，為尿素和異丁醛在催化劑的作用下綜合反應(yīng)生成。ibdu 為一種子的白色粉末或顆粒

3、，總含氮量為 3218，折合蛋白當(dāng)量為 201.13， 吸濕度遠(yuǎn)低于尿素。以上是比較常見(jiàn)的非蛋白氮物質(zhì)。隨著科技的發(fā)展，還會(huì)有越來(lái)越多的非蛋白氮物質(zhì)被合成出來(lái)，從而使反芻動(dòng)物所用的非蛋白氮使用廣泛，而摻假者很容易將 此物質(zhì)摻入飼料原料中以提高原料的粗蛋白質(zhì)。22l非蛋白氮的檢驗(yàn)非蛋白氮的定性檢驗(yàn)在對(duì)原料樣品的檢測(cè)中，一般有定性檢測(cè)和定量檢測(cè)。在定性檢測(cè)中，使用的比較多的為顯微鏡檢，包括直接鏡檢、分層鏡檢（用四氯化碳或三氯甲烷分層）、反應(yīng)劑鏡檢（用化學(xué)物質(zhì)和樣品中的某些物質(zhì)反應(yīng)而在顯微下區(qū)分）、染色鏡檢等。 在使用的過(guò)程中，往往使用一項(xiàng)或多項(xiàng)鏡檢方法對(duì)樣品中的物質(zhì)進(jìn)行判定。對(duì)于非蛋白氮的檢驗(yàn)，顯

4、微鏡檢是一種比較有效的方法。在對(duì)樣品的檢測(cè)中，一般使用的是生物顯微鏡，其放大的倍數(shù)在 36400 倍之間，為了獲得更好的顯微效果，可以根據(jù)實(shí)際情況作出具體的調(diào)整。以下是鏡檢使用過(guò)程中的一些技巧：2.1.l直接鏡檢直接鏡檢一般所用的倍數(shù)比較小，通過(guò)對(duì)樣品不同的物理特征，如顏色、透明度、表面組織、形狀等物理性狀進(jìn)行判定。特別的要與典型的樣品進(jìn)行比較，以便能夠更好區(qū)分樣品與雜質(zhì)的不同。在直接鏡檢中，用不同的濾光片有時(shí)可以起到比較明顯的效果。雖然直接鏡檢比較方便和直觀，但有時(shí)對(duì)于樣品中的物質(zhì)很難區(qū)分時(shí)， 可以用其它的檢驗(yàn)方法。2.1.2分層鏡檢將樣品用四氯化碳進(jìn)行脫脂和比重分離之后，樣品與其它物質(zhì)的區(qū)

5、分會(huì)更加容易。對(duì)樣品中的有機(jī)物和無(wú)機(jī)物分層之后，需在常溫下干燥后再進(jìn)行鏡檢。非蛋白氮一類的物質(zhì)與原料的很多外觀性質(zhì)很不一樣，通過(guò)兩者的特異性之間的觀察，可以 對(duì)樣品中是否摻有非蛋白氮一類的物質(zhì)作出一個(gè)大概的判斷。213反應(yīng)劑鏡檢用反應(yīng)劑和樣品進(jìn)行反應(yīng)，非蛋白氮一類的物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)和樣品不一樣，通過(guò)此種方法可以對(duì)樣品中的非蛋白氮進(jìn)行鑒別。經(jīng)過(guò)四氯化碳分層之后，再與反應(yīng)劑反應(yīng)是比較好的一種方法。而鏡檢時(shí)在樣品中加一滴或數(shù)滴濃硫酸，觀察樣品與濃硫酸反應(yīng)的情況是一種比較直觀的鑒別方法。因?yàn)闊o(wú)論動(dòng)物蛋白還是植物蛋白，其與 濃硫酸的反應(yīng)速度和產(chǎn)生的現(xiàn)象比較明顯。2.1.4染色鏡檢用染色劑對(duì)樣品進(jìn)行染色，使

6、樣品中的植物或動(dòng)物細(xì)胞染成不同的顏色，而非蛋白氮一類的物質(zhì)則和樣品的染色后的表現(xiàn)不同，通過(guò)此種方法使兩者區(qū)分開(kāi)來(lái)從 而加以鑒別。以下是比較常用的染色方法：對(duì)植物細(xì)胞的染色方法：番紅固綠染色法。取適量脫胎（視樣品脂肪多少而定，可以用四氯化碳，也可以用丙酮，對(duì)于脂肪少的也可以不用脫脂）樣品于燒杯中，用 1的番紅水溶液浸泡 l3h 水洗（去多余的染料）。將樣品涂在玻片上，稍晾干。滴加 0l的固綠（溶劑用 95乙醇）。過(guò) 15s 后滴加 95的乙醇，沖去多余固綠染料。待乙醇稍揮發(fā)后，加甘油液（甘油:水1:1）浸潤(rùn)，加蓋玻片。用生物顯微鏡檢查。染色結(jié)果：細(xì)胞核，木質(zhì)化細(xì)胞壁呈鮮紅色，纖維素細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)

7、呈綠色。因?yàn)榉堑鞍椎獩](méi)有細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等結(jié)構(gòu)，所以只要能夠較好的掌握染色技巧，其對(duì)比效果比較明顯。當(dāng)然，不能從染色效果判斷其一定為非蛋白氮。對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的染色方法：蘇木精曙紅對(duì)染法。取適量的脫脂樣品于燒杯中，加入埃利希蘇木精染色液浸泡 35min，水洗數(shù)次（用 5min 左右）。將樣品涂在玻片上，滴加氨水。34s 后立即滿加水，洗 l min，稍晾一下，加 0.2曙紅水溶液浸潤(rùn) 3min，滴加 95的乙醇，洗去多余曙紅染料。再稍晾一下，加甘油浸潤(rùn)，加蓋玻片，用生物顯微鏡觀察。其染色的結(jié)果為：細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈淡紅色。 通過(guò)此種方法染色，一般能夠很容易的區(qū)分樣品和非蛋白氮一類的物質(zhì)。為了能夠更

8、清晰的在顯微鏡下區(qū)分樣品與雜質(zhì)，也可采用以下方法（對(duì)于檢驗(yàn)魚粉一類的物質(zhì)比較有效）：先用四氯化碳或三氯甲烷對(duì)樣品分層，除去無(wú)機(jī)物，必要時(shí)再用丙酮進(jìn)行脫脂，再取一定量的樣品置入蒸餾水中，攪拌，除去溶于水的物質(zhì)，再用 60 目或 80 目的樣品篩過(guò)濾，將樣品放入 5060的烘箱中進(jìn)行烘干（時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，以保持樣品原來(lái)的狀態(tài)），然后在顯微鏡下進(jìn)行檢驗(yàn)或再對(duì)其進(jìn)行處理后 鏡檢。在顯微鏡檢中，只能對(duì)非蛋白氮作初步判斷。若要進(jìn)一步的分析判斷，還需 進(jìn)行定量分析檢驗(yàn)。2.2非蛋白氮的定量檢驗(yàn)在非蛋白氮定量的檢測(cè)方法中，比較常用的方法是硫酸銅沉淀法和氨基酸測(cè)定法。除此之外，本文根據(jù)非蛋白氮的組成結(jié)構(gòu)的不同，采

9、用水解蒸餾法對(duì)樣品中的非蛋白氮進(jìn)行檢驗(yàn)。2.2.l硫酸銅沉淀法根據(jù)非蛋白氮的化學(xué)性質(zhì)來(lái)看，大部分溶于水，一部分在常溫下不溶水，但在沸水中溶解。根據(jù)此種性質(zhì)，可以先將樣品煮沸，用硫酸銅將樣品中的蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)，由于非蛋白氮已經(jīng)溶于水，故可用過(guò)濾方法將其與樣品中的蛋白質(zhì)分離。在過(guò)濾時(shí)，水的溫度一定不能太低，否則象雙縮脲一類的物質(zhì)會(huì)因?yàn)椴蝗苡诔厮荒鼙贿^(guò)濾掉。用此種方法測(cè)定出的蛋白質(zhì)含量稱為樣品的真蛋白質(zhì)。但實(shí)際上，此種方法有很大的局限性。如果非蛋白氮不溶于沸水，或者將一般的非蛋白氮微囊化，此種方法測(cè)出的結(jié)果會(huì)與樣品中的實(shí)際真蛋白有很大的差異。2.2.2氨基酸測(cè)定法為了真正能夠判定樣品中是否摻有

10、非蛋白氮，需測(cè)定樣品中的氨基酸含量。無(wú)論采用經(jīng)典的氨基酸自動(dòng)分析儀分析（柱后衍生），還是采用比較快捷的hplc分析（往前衍生），將所測(cè)定的氨基酸總量相加得到一個(gè)總氨基酸數(shù)值，然后將此數(shù)值乘以 6.25 為 m，和用凱氏定氮法測(cè)定的粗蛋白質(zhì) n 相比較，m 至少為 n 的 85（m 可能略大于 n）。如果低于此數(shù)值，則可以判定該樣品中摻有非蛋白氮。2.2.3水解蒸餾法原理非蛋白氮主要包括以下五類：尿素及其衍生物類、氨態(tài)氮類、銨類、肽類及其衍生物、動(dòng)物糞便及其它廢棄物類。如果在原料中摻有氨態(tài)氮類、銨類和糞便比較容易判斷（可采用硫酸銅沉淀法加鏡檢），一般很少將肽類及其衍生物摻入其中，剩下比較難鑒別的

11、就是尿素及其衍生物。尿素和尿素衍生物經(jīng)過(guò)強(qiáng)酸或強(qiáng)堿水解為氨鹽或氨和其它的物質(zhì)，在強(qiáng)堿的條件下可以蒸餾出氨氣，原料中的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)水解成氨基酸鹽，氨基酸鹽在強(qiáng)堿條件下穩(wěn)定，從而可將非蛋白氮和真蛋白氮進(jìn)行分離。儀器和設(shè)備：酒精噴燈，試管和其它常用的儀器。試劑與溶液：6mol1 的鹽酸溶液和其它常用的試劑。測(cè)定方法：本文只列出用酸水解的方法。采集有代表性樣品約 100g，混勻后用四分法縮分出 209 左右，將其粉碎，使其全部通過(guò) 60 目樣品篩。精確稱取 0.300 0g 的樣品，置于容積為 60ml 的試管底部（注意樣品勿沾在管壁上），加入 30ml 6moll 的鹽酸溶液，將試管在距試管口 l2c

12、m 處用噴燈加熱并封口。將封好的試管置于干燥箱內(nèi)，于110下水解 24h。冷卻后打開(kāi)試管，將水解液過(guò)濾至 100ml 容量瓶中，用蒸餾水反復(fù)多次沖洗試管和濾紙，然后定容至刻度。用 10ml 移液管移取 10ml 樣液移入半微量式定氮儀的反應(yīng)室中，加入2oml 1:1 的氫氧化鈉溶液蒸餾 10 min，余下的步驟按照測(cè)定粗蛋白的方法進(jìn)行操作，得出樣品所消耗的鹽酸的體積為 v1（ml）。同時(shí)作空白滴定可得消耗的鹽酸的體 積為 v0，設(shè)所稱樣品的質(zhì)量為 m（g）。非蛋白氮的粗蛋白質(zhì)計(jì)算公式:cp(%)（v1-vo）co14625/ m3 討論及注意事項(xiàng)31 關(guān)于尿素衍生物是否水解和水解是否完全的問(wèn)題

13、。從理論上講，在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿和一定的溫度（110）的條件下，尿素及其尿素聚合物一定會(huì)水解，但不一定能夠在 24h 內(nèi)水解完全。經(jīng)過(guò)筆者做了大量的試驗(yàn)，證明了縮二脲在 24h 內(nèi)的水解程度可達(dá)到 50以上，尿素在同樣的條件下的水解比率可達(dá)到 90以上。即使水解不完全，如果樣品中含有尿素衍生物，其的數(shù)值 v1 也會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)的大于 v0，通過(guò)此數(shù)值， 也可判定樣品中是否摻有非蛋白氮。3.2關(guān)于水解后的產(chǎn)物問(wèn)題，經(jīng)過(guò)筆者反復(fù)試驗(yàn)，確定該水解的最終物質(zhì)為氨鹽或一水合氨。33關(guān)于用半微量蒸餾時(shí)所用堿量和所用的時(shí)間：通過(guò)筆者大量的實(shí)踐，如果水解程度比較完全，則按照做粗蛋白的方法確定蒸餾的時(shí)間，但筆者推薦將加堿量增大一倍即 20ml，蒸餾時(shí)間增大一倍以上即 10min 以上怎樣做能使數(shù)據(jù)盡量的準(zhǔn)確。34關(guān)于鹽酸和氫氧化鈉反應(yīng)生成的大量的氯化鈉對(duì)反應(yīng)是否有影響的問(wèn)題。筆者做了以下試驗(yàn)：先用加熱的方法除去水解完畢后的鹽酸，使其大部分揮發(fā)，然后再加等體積的氫氧化鈉進(jìn)行蒸餾，得出的結(jié)果可以看出：使用加熱除去鹽酸的方法和不除去鹽酸的方法得出的結(jié)果相差不大（已經(jīng)考慮在加熱過(guò)程中的氨的損失）。35關(guān)于用堿水解的問(wèn)題。堿水解的