冷凍電鏡技術(shù)

1、實用標(biāo)準(zhǔn)文案冷凍電鏡技術(shù) 課程學(xué)習(xí)報告一、課程所講基礎(chǔ)知識回顧1、電子顯微鏡成像技術(shù)的發(fā)展歷史（1）上世紀(jì)50年代的負染技術(shù)（分辨率 2mm）：該技術(shù)的原理為重金屬燃料與 H結(jié)合，特點為對電子散射強，視野暗，襯 度大，易觀察到生物材料。但不足之處在于染料顆粒較大，不易進入分子內(nèi)部。 此外，因樣品需要脫水處理，會造成結(jié)構(gòu)失真。（2）上世紀(jì)60年代的三維重構(gòu)技術(shù)三維重構(gòu)的數(shù)學(xué)原理為傅里葉變換，其關(guān)鍵性質(zhì)為：三維函數(shù)投影的傅里葉 變換等于該三維函數(shù)傅里葉變換在垂直于投影方向上的中央截面。因此，通過對待測立體物質(zhì)的多角度投影信息采集， 可以借助數(shù)學(xué)的橋梁，重構(gòu)出該物質(zhì)的三 維結(jié)構(gòu)。顯然，對待測物質(zhì)投影

2、采集的角度越多，越精確，重構(gòu)出的三維圖像越 接近真實。在60年代，T4噬菌體的結(jié)構(gòu)通過該方法被成功解析。（3）上世紀(jì)70年代的電子晶體學(xué)即根據(jù)電子衍射的花樣確定物質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)。 被觀測的物體通過物鏡形成衍 射圖樣，而這些衍射光束的低散射角部分再通過透鏡而形成顯微像。 該方法相當(dāng) 于對原物體進行兩次傅里葉變換，一為將物體轉(zhuǎn)換成衍射譜，二為逆傅里葉變換 使衍射譜重構(gòu)成顯微圖像。在70年代，電子晶體學(xué)的發(fā)展使得第1個膜蛋白結(jié)構(gòu)被成功解析。（4）上世紀(jì)80年代的快速冷凍技術(shù)（分辨率達到 0.2nm ）主要原理為將樣品快速冷凍在玻璃態(tài)的水中， 樣品不需脫水，結(jié)構(gòu)與在溶液中相同，呈天然狀態(tài)。因此，電鏡成像

3、得到的更接近原物質(zhì)的真實結(jié)構(gòu)，且分辨 率咼。2、冷凍電鏡技術(shù)介紹(1) 關(guān)于玻璃態(tài)冰：冰的結(jié)構(gòu)多種多樣，包括六角形冰、立方體冰等，其物理狀態(tài)與冷凍速率有 關(guān)。若要形成玻璃態(tài)(即無定形態(tài))的冰，需要冷凍速率達到每秒鐘104攝氏度。 此時，冰的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)各向同性，不會因成像角度不同導(dǎo)致圖像產(chǎn)生偏差。(2) 操作步驟概要：冷凍包埋一一轉(zhuǎn)移至液氮或液氦中一一觀測，圖像采集一一三維重構(gòu)(3) 圖像采集的質(zhì)量要求：應(yīng)保證樣品在玻璃態(tài)冰中的分布均一，厚度一致切適當(dāng)，避免污染。此外， 特別應(yīng)注意的是，該方法對電子劑量很敏感，最適為10e/A2，明顯超過最適劑量即容易因受到過量電子輻射而破壞物理結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致冰迅速汽

4、化，出現(xiàn)氣泡，造成圖像采集不成功。因此，必須采用低劑量技術(shù)(w 20e/A 2)，用1k3k倍的低倍鏡尋找，在目 標(biāo)域的臨近區(qū)聚焦，使記錄區(qū)域僅在拍攝時(1s左右)受到電子輻射，保證樣 品不被損壞。二、課外補充學(xué)習(xí)：冷凍電鏡技術(shù)難點的擴展閱讀1、冰晶污染冰晶污染是冷凍電鏡的主要問題和最重要的難點，可發(fā)生在冷凍電鏡的各個 步驟。在每個步驟中，冰晶污染的形成的主要原因不同。在冷凍制樣階段，冰晶污染形成的原因主要有三點：(1 )冷凍速率不夠；(2)冷卻劑的溫度未接近凝點；(3 )容器邊緣的小冰晶墜入液氮中黏附在樣品上，或在樣品轉(zhuǎn)移過程， 空氣中的水分子凝結(jié)在樣品表面。2、電子輻射損傷電子輻射損傷的原

5、因幾乎均可歸結(jié)為熱效應(yīng)，被輻照區(qū)域的損傷大致可分為 晶化、升華、起泡和漂移4種類型。(1) 晶化 與電子束的加速電壓和電子劑量有關(guān)，一般發(fā)生在樣品表面，玻 璃態(tài)的冰晶化形成立方晶相，失去各向同性。(2) 升華一一也發(fā)生在樣品表面，本身現(xiàn)象與電子劑量無關(guān)，但是升華速率與電子劑量有關(guān).電子輻射會增加樣品表面分子的動能， 從而增加樣品表面分子脫 離樣品表面的幾率。(3) 起泡一一對于較厚的含水樣品。非彈性散射將造成能量沉積，大部分發(fā)生 在接近樣品表面的內(nèi)層，此外，水是熱的不良導(dǎo)體，因此會出現(xiàn)起泡現(xiàn)象。隨電 子劑量的增加，起泡的范圍和形態(tài)也會有所不同。(4) 漂移一一樣品的物理漂移來自于樣品本身的形變

6、，而樣品的象漂移原因為 電子在樣品內(nèi)的沉積，對電子束的偏轉(zhuǎn)方向產(chǎn)生影響。一般來說，使用盡可能低的電子劑量和盡可能小的照明光斑是避免上述四種 輻射損傷的最佳方法。3、圖像去噪由于冷凍電鏡特殊的低電子劑量和低襯度成像技術(shù)，使得圖像反差弱，信噪 比低，不易提取有效的結(jié)構(gòu)信息。而濾波是圖像去噪的主要方法。其原理為將信 號和噪聲都視為隨機信號，利用它們不同的統(tǒng)計特征，通過最小方差估計某點的 最似信號類型，若為噪點則予以除去。此外，圖像增強和圖像復(fù)原也可相對地減輕噪點對信號圖像的影響，其中圖像增強是將人們主觀感興趣的部分亮度提高，而圖像復(fù)原則是針對圖像中客觀存 在，但受到了噪點干擾（稱為退化）的樣品信號，

7、將它們的結(jié)構(gòu)性信息予以恢復(fù)。對于圖像增強，一般會綜合采用濾波、掩模、灰度變換、直方圖均衡化等方 法對感興趣區(qū)域的信息進行增強；而圖像復(fù)原的典型方法是根據(jù)先前的樣品經(jīng) 驗，建立一個退化模型，以此模型為基礎(chǔ)采用濾波等手段處理， 使得復(fù)原后的圖 像符合一定的準(zhǔn)則，達到改善圖像質(zhì)量的目的。其中信嗓比是評價圖像復(fù)原程度 的主要標(biāo)準(zhǔn)之一。三、我國冷凍電鏡技術(shù)的新應(yīng)用2011年1月，中科院生物物理所利用冷凍電鏡平臺，獲得了呼腸孤病毒科的質(zhì)型多角體病毒近原子分辨率的三維結(jié)構(gòu)，并獨立構(gòu)建了全原子模型。這是我國首次利用冷凍電鏡技術(shù)解析生物大分子原子結(jié)構(gòu)模型，也是世界上首次利用冷凍電鏡圖像獲得的生物大分子復(fù)合體的全

8、原子模型。該研究確認了呼腸孤病毒 mRNA的流出通道，定位了該病毒的兩個甲基轉(zhuǎn)移酶，并揭示了該流出通道是 如何引導(dǎo)mRNA依次經(jīng)過這兩個甲基轉(zhuǎn)移酶以完成“加帽”過程的。在論文Atomic model of a cypovirus built from cryo-EM structureprovides in sight into the mecha nism of mRNA capp ing中，研究人員通過冷凍電鏡技術(shù)，得出以下結(jié)論：（1） CPV與其他呼腸孤病毒科相比，其主要衣 殼蛋白缺乏特異的氨基酸序列，但它具有結(jié)構(gòu)保守的酶蛋白VP3和衣殼蛋白VP1，表明具turret蛋白的呼腸孤病毒科的

9、mRNA轉(zhuǎn)錄機制和衣殼組裝機制有共 性。（2）CPV五聚體turret蛋白頂部獨特的結(jié)構(gòu)組織區(qū)是其指導(dǎo) mRNA完成“加 帽”過程的關(guān)鍵區(qū)域。（3）CPV的VP5蛋白由RNA第7節(jié)段編碼，是由P50蛋白 在轉(zhuǎn)譯后分裂產(chǎn)生的。四、冷凍電鏡技術(shù)的應(yīng)用前景隨生物成像技術(shù)的發(fā)展，電鏡技術(shù)已不再限于單純的形態(tài)結(jié)構(gòu)研究，而發(fā)展為不同水平上的顯微學(xué)技術(shù)綜合應(yīng)用。同時，顯微學(xué)技術(shù)與細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等其他生命科學(xué)技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用正在成為研究熱點。例如，免疫細胞化學(xué)與電鏡技術(shù)相結(jié)合，使原位雜交技術(shù)已從理論走向?qū)嶋H，得到相當(dāng)普遍的應(yīng)用。因此，冷凍電鏡技術(shù)在對物質(zhì)細微結(jié)構(gòu)與功能的分析上必將極大地推動生物醫(yī)學(xué)的 發(fā)展。參考資料：1 尹長城老師現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)成像技術(shù)選修課內(nèi)容2 李鯤鵬 冷凍電鏡技術(shù)與冷凍電鏡圖像去噪研究D.中山大學(xué).20053 Cheng L, Sun J. et al. Atomic model of a cypovirus built from cryo-EM structureprovide