論文資料：煙草萜類物質及分析方法研究進展

1、煙草萜類物質及分析方法研究進展本文檔由【中文word文檔庫】提供，轉載分發(fā)敬請保留本信息；中文word文檔庫免費提供海量范文、教育、學習、政策、報告和經濟類word文檔。摘要：萜類物質廣泛存在于植物中，在植物防御過程中發(fā)揮著重要作用。煙草是最早運用于植物萜類物質研究的模式植物之一，到目前為止，發(fā)現(xiàn)的煙草萜類物質種類較多，主要是倍半萜、雙萜、三萜和四萜。另外，本文也簡述了煙草中萜類物質的五種提取方法：溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法、同步蒸餾萃取法、頂空動態(tài)吸附法、固相微萃取法。其中溶劑提取法作為最傳統(tǒng)的提取方法，操作比較簡單，回收率較高，但是溶劑消耗量大，其所用的有機溶劑對人體往往有害，而且只能對離體

2、的煙草進行提取，無法實現(xiàn)揮發(fā)性和非揮發(fā)性組分的分離。水蒸氣蒸餾法和同步蒸餾萃取法都屬于氣態(tài)萃取技術，能更好地穿過預處理材料。相對于水蒸氣蒸餾法，同步蒸餾萃取法集提取、蒸餾、萃取為一體，極大地簡化了整個樣品預處理的操作過程，縮短了預處理的時間。水蒸氣蒸餾法和同步蒸餾萃取法主要的缺點是高溫蒸餾過程中一些熱敏性萜類物質易被分解，與水相溶的物質無法提取出來，而且跟溶劑提取法一樣只能對離體的植物材料萜類物質進行提取。頂空動態(tài)分析法提取所得組分能夠較為真實反應植株在自然狀態(tài)下釋放揮發(fā)物的情況，而且適合于痕量分析。但是它所用時間較多，吹掃中有可能引入雜質從而影響結果的有效性和可靠性。頂空固相微萃取簡單、迅速

3、、可自動取樣分析，而且樣品用量較少，所測植株可以是活體植物材料。但是該方法的裝置成本高，提取物質只能用于化學分析，不適合于生物分析，提取的樣品也必須立即分析，不能長時間保存。最后提出目前萜類物質及分析方法研究存在的問題。植物在受到昆蟲或者病原物侵襲的時候，可以產生許多防御性的次生代謝物質。其中，萜類化合物是迄今為止發(fā)現(xiàn)在功能和結構上種類最多、分布最廣泛的一類物質，已鑒定出的就有幾萬種（mcgarvey and croteau, 1995; sacchettini and poulter, 1997）。萜類化合物是以異戊二烯為單位的烴類及其含氧衍生物，根據(jù)其在植物內的生理功能可分為初生代謝物和次

4、生代謝物。初生代謝物的萜類物質比較少，主要有甾體、胡蘿卜素、植物激素、多聚萜醇、醌類等。而次生代謝物的萜類種類繁多，根據(jù)碳原子數(shù)目可分為單萜（monoterpenoid c10）、倍半萜（sesquiterpenoid c15）、二萜（diterpenoid c20）、三萜（triterpenoid c30）、四萜(tetraterpenoid c40)和多萜等。單萜和倍半萜一般多具有揮發(fā)性，常以揮發(fā)油的形式存在于高等植物中；而雙萜及其以上的化合物一般不具有發(fā)揮性，常以樹脂等形式存在于植物中（langenheim, 1990）。屬于次生代謝物的萜類化合物一般是植物的植保素，雖然不是植物生長發(fā)育

5、所必需的化合物，但是在植物種群競爭、吸引昆蟲傳粉、防御植食性昆蟲和控制病蟲害等方面具有重要的作用。萜類物質可以作為化感物質抑制其他植物的生長，有時甚至抑制直自身幼苗的生長發(fā)育，比如菊科植物中的揮發(fā)性萜類物質檸檬烯、蒎烯、樟腦等可以保護其自身不受侵害，同時對其他植物生長產生抑制作用（谷文祥等, 1998）；熱帶低海拔森林的蘭花能夠散發(fā)特定的揮發(fā)性成分，吸引其專一的雄性長舌花蜂前來采集香味物質，而這些香味物質正是雄蜂用來合成其信息素的前體（dobsom et al, 1990）；楝科植物中的呋喃三萜化合物-川楝素，對菜粉蝶和粘蟲等昆蟲有很強的趨避和毒殺作用（趙善歡等, 1984; 趙善歡等, 19

6、85; 張興和趙善歡, 1992）。煙草是茄科一年生草本植物，是用于研究萜類化合物的最早模式植物之一。自1975年從感染煙草花葉病毒（tmv）的nicotiana glutinosa煙草葉片中分離出第一種倍半萜烯后，研究者已經從煙草中發(fā)現(xiàn)了很多萜類化合物（burden et al., 1975）。隨著研究的深入，萜類化合物在植物防御體系中的作用及作用機制已引起研究者的濃厚興趣。本文從萜類化合物合成途徑、種類和提取方法這三個方面對煙草中的萜類化合物研究進展進行總結。1. 煙草萜類物質合成途徑萜類化合物代謝途徑起始于異戊烯焦磷酸（ipp）與其同分異構體二甲丙烯基焦磷酸（dmapp）。ipp和dma

7、pp在異戊二烯轉移酶的作用下，縮合形成牻牛兒基焦磷酸（gpp），再衍生為單萜類化合物。gpp和ipp在法呢基焦磷酸（fpp）合成酶的催化下，縮合形成fpp，再通過倍半萜環(huán)化酶的作用形成倍半萜及其衍生物。以此類推，可以形成三萜、四萜、多萜及其衍生物等。到目前為止，萜類物質合成前體ipp和dmapp主要是通過甲羥戊酸（mva）途徑（newman and chappell1, 1999）和丙酮酸/磷酸甘油醛（mep）途徑合成（eisenreich et al., 1998; lichtenthaler, 1999）。mva途徑是以糖酵解產物乙酸輔酶a為原料，經mva這一前體，形成ipp和dmapp，

8、然后通過縮合形成倍半萜、三萜和甾體類化合物。這個反應途徑主要在細胞質中完成，涉及的主要酶有乙酰輔酶a乙?；D移酶(aact)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a(hmgs)，羥甲基戊二酰 coa還原酶（hmrg）及甲羥戊酸激酶(mk)等（羅永明等, 2003）。其中，hmrg被認為是該途徑中的最主要的限速酶，是細胞質萜類代謝中的重要調控位點（liao zhihua et al., 2006）。mep途徑是以丙酮酸和磷酸甘油醛途徑為原料，在轉酮酶的催化作用下聚合成反應前體1-脫氧木糖-5-磷酸(dxp)，經異構化和還原等反應，形成2-甲基-d-赤蘚糖-4-磷酸(mep)中間體，再經過磷酸化、環(huán)化等步

9、驟生成ipp，最終形成胡蘿卜素、單萜、二萜等物質。該途徑在質體中進行，涉及的主要酶有5-磷酸脫氧木酮糖合成酶(dxps)、脫氧木酮糖磷酸鹽還原異構酶(dxr)和4-磷酸胞苷-2-甲基赤蘚糖轉移酶(mct)等。其中，dxr是該途徑的最主要的限速酶，也是質體內類異戊二烯代謝中的重要調控位點（takahashi et al., 1998）。2. 煙草萜類的主要種類2.1倍半萜倍半萜是含有三個異戊二烯單位的萜類，多為含氧衍生物。在煙草中，最早發(fā)現(xiàn)的倍半萜是glutinosone，由burden等（1975）從感染煙草花葉病毒(tmv)的n. glutinosa煙草葉片中分離出來，也是最早在煙草中發(fā)現(xiàn)的

10、萜類物質。glutinosone只能在病毒的葉片中監(jiān)測到，而在健康葉片中無法檢測到。另外，bailey等（1975）在感染煙草壞死病毒(tnv)的n. tabacum和n. clevelandiiy煙草葉片中發(fā)現(xiàn)了capsidiol。ueagaki和fujimari等人先后從病害的煙葉中發(fā)現(xiàn)了solavetivone、phytuberin、phytuberol和solanascone等倍半萜類物質。其中，phytuberin也可以從受到pseudomonas lachrymans侵染的煙葉中可以分離到（hammerschmidt and kuc, 1979），而與之結構相近的phytubero

11、l 可以從受到tmv侵染的煙葉中可以分離得到。另外，這兩種倍半萜都能在感染了p. solanacearum 和p. syringae pv. tabaci煙葉的愈傷組織中檢測到（fujimori, 1983; takahashi and fujimori, 1985）。除此之外，從經過纖維素酶處理的煙草愈傷中也能提取capsidiol、phytuberin和phytuberol（watson et al., 1985）。uegaki等（1981）和fuchs等（1983）在感染了tmv的n. tabacum cv. samsun nn 煙草葉片中，他們檢測出了capsidiol、solavet

12、ivone、3-hydroxysolavetivone、3-hydroxylubimin、epirishitin、glutinose、oxyglutinose、solanascone、phytuberin和phytuberol。uegaki等（1988）從感染了tmv的n. undulata煙葉中提取到了至少19種倍半萜類物質，主要是dehydrocarissone、capsidiol 3-acetate、aubergenone、4-epi- aubergenone、trans-dihydrocarissone、1,2-dehydro-cyperone、3-epi-3-hydroxysolav

13、etivone、capsidiol、3-hydroxy-solavetivone、2-keto-cyperone、phytuberin、phytuberol、solavetivone、occidenol、occidentalol、occidol、occidol acetate、occidol isomer-1和occidol isomer-2。guides等人從受到p. lachryman感染的煙草葉片中提取到了六種倍半萜，發(fā)現(xiàn)了rishitin和lubimin這兩種新的倍半萜。nishikawaji等人從烤煙煙葉中分離出了四種新的倍半萜，即2,3-dehydrosolanascone、-ca

14、rdinene、-cardinene、2-keto-cyperone。另外，nishikawaji等（1983）感染了tnv的n. debneyi的煙草葉片中發(fā)現(xiàn)了debenyol和cyclodebneyol這兩種結構相似的倍半萜。接著，whitehead等（1988）人從細胞培養(yǎng)基經過纖維素酶處理所培養(yǎng)出的n. tabacum煙草葉片中發(fā)現(xiàn)了與debneyol相關的倍半萜，它們是7-epi-debneyol、1-hydroxydebneyol和8-hydroxydebneyol。后來whitehead等（1989）又發(fā)現(xiàn)了5-epi-aristolochene是capisidiol和debn

15、eyol的前體。 2.2雙萜cembranoids和labdanoids主要合成于煙草葉片表面或者煙草花上表皮毛的腺體中，是煙草中最主要的兩類雙萜。到目前為止，煙草中已發(fā)現(xiàn)50多種cembranoids，其中最主要是的是（1s,2e,4s,6r,7e,11e）-2,7,11-cembratiene-4,6diols和（1s,2e,4r,6r,7e,11e）-2,7,11-cembratiene-4,6diols。另外，從煙草葉片腺狀毛頂部發(fā)現(xiàn)了-4,8,13-duvatriene-1,3-diol和-4,8,13-duvatriene-1,3-diol，并且發(fā)現(xiàn)葉片腺狀毛是duvatriene

16、diol合成的唯一部位（roberts and rowland, 1962; chang and grunwald, 1976; keene and wagner, 1985; kandra and wagner, 1988）。一些煙草雙萜類物質比如sclareol、epi-sclareol、-4,8,13-duvatriene-1,3-diol、-4,8,13-duvatriene-1,3-diol和labdanediol，具有抑制小麥胚芽鞘生長的作用（cutler and cole, 1974; cutler et al, 1977）。另外，guo和wagner（1995）研究發(fā)現(xiàn)ladd

17、ane雙萜是水溶性環(huán)化酶催化的環(huán)化反應所生成的直接產物。2.3三萜和四萜目前煙草中已發(fā)現(xiàn)的三萜和四萜化合物比較少。三萜化合物主要有cycloarenol和24-methylenecycloartenol，主要存在于細胞質和細胞膜上（wahlberg and enzell, 1987）。煙草中的四萜化合物主要是類胡蘿卜素，包括-胡蘿卜素、葉黃素、紫黃質和新葉黃素。這些化合物的含量隨著煙葉位置、煙草年齡等不同而有較大的差異（wahlberg and enzell, 1987）。3. 萜類物質提取和分析方法3.1溶劑萃取法溶劑提取法是利用溶劑與溶質之間的親和性，直接借助溶劑萃取的技術，從植物組織或器

18、官中分離出萜類物質，是運用比較廣泛的方法之一。該方法的步驟是，首先參照bohlmann等（2002）和nugroho等（2002）等采用液氮冷凍對煙草葉片進行預處理，隨后加入一定量的溶劑進行抽提，在經過干燥、重懸浮，再次干燥等步驟，形成適合接下來分析的樣品。溶劑提取法最關鍵的是煙草樣品的預處理和提取劑的選擇，常見的提取劑有甲醇、乙醇、正乙烷、醚、氯仿、苯等。該方法雖然操作比較簡單，回收率較高，但是溶劑消耗量大，其所用的有機溶劑對人體往往有害，而且只能對離體的煙草進行提取，無法實現(xiàn)揮發(fā)性和非揮發(fā)性組分的分離。目前，在傳統(tǒng)的溶劑提取方法基礎上，出現(xiàn)了許多新的技術比如自動溶劑抽提、微波輔助抽提、超聲

19、波輔助抽提和加速溶劑萃取等。此外，對于葉片表皮的萜類化合物，可以參照severson等（1985）和wang等（2001）采用表皮分泌物提取的方法。3.2水蒸氣蒸餾法和同步蒸餾萃取法水蒸氣蒸餾法和同步蒸餾法都屬于氣態(tài)萃取技術，相比于溶劑提取等液態(tài)技術，氣態(tài)技術能更好地穿過預處理材料，并且小分子化合物在氣態(tài)中的擴散能力比液態(tài)要高。水蒸氣蒸餾法的主要步驟是首先水相和有機相充分接觸溶解，然后通過蒸汽將水相中夾帶的植物揮發(fā)物成分提取轉移至有機相中，最后得到的有機萃取液經過脫水、濃縮得到最終產品。常用的有機溶劑是乙醚、二氯甲烷、氯仿及甲醇等。同步蒸餾萃取法是將含有樣品組分的水蒸氣和萃取溶劑蒸汽在一定的裝

20、置中充分混合，冷凝后，兩相充分接觸實現(xiàn)組分的相轉移，且在反復循環(huán)中實現(xiàn)高效的萃取。相對水蒸氣蒸餾而言，同步蒸餾萃取集提取、蒸餾、萃取為一體，極大地簡化了整個樣品預處理的操作過程，縮短了預處理的時間。該方法比較適合提取大部分低揮發(fā)性的萜類化合物。水蒸氣蒸餾法和同步蒸餾萃取法主要的缺點是高溫蒸餾過程中一些熱敏性萜類物質易被分解，與水相溶的物質無法提取出來，而且跟溶劑提取法一樣只能對離體的植物材料萜類物質進行提取。 3.3頂空動態(tài)吸附法 頂空動態(tài)分析法是通過動力泵不斷產生惰性氣體通過植株將植株所產生的揮發(fā)性物質攜帶通過特定的吸附劑，吸附劑與揮發(fā)物分子結合，然后通過有機溶劑將吸附的揮發(fā)物洗脫下來，從而

21、得到揮發(fā)物的提取液。這個操作中最主要的就是吸附劑、洗脫溶劑的選擇和惰性氣體的流速。其中較常用的吸附劑有活性炭、super-q、porapak-q和tenax等，常用的洗脫溶劑有正己烷、乙醚、二氯甲烷等。該方法的主要優(yōu)點是提取植物自然狀態(tài)下或不同處理下的整個植株的揮發(fā)物或植物某個器官產生的揮發(fā)物，相比于溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法所得組分能夠較為真實反應植株在自然狀態(tài)下釋放揮發(fā)物的情況，而且該方法具有富集作用，適合于痕量分析。但是該方法所用時間較多，吹掃中有可能引入雜質從而影響結果的有效性和可靠性。3.4頂空固相微萃取技術固相微萃?。╯olid-phase microextraction, spme

22、）是20世紀90年代興起的一項新穎的樣品前處理和富集技術。它的操作方式有兩種：一是將spme萃取頭直接插入較為潔凈的液體樣品中，稱為直接spme；二是將spme萃取頭置于液體或者固體樣品的頂空進行萃取，稱為頂空spme（hs-spme）。對于非離體煙草的萜類物質提取，采用hs-spme比較合適。hs-spme主要包括分析物從樣品揮發(fā)至頂空，再擴散至萃取涂層以及在萃取涂層中的擴散這三個步驟。分析物本身的性質、其與基體間的作用力以及萃取涂層對分析物的萃取能力是影響hs-spme萃取效果的主要因素。萃取涂層選擇的主要原則就是“相似相容”原理。該方法主要的優(yōu)點是簡單、迅速、可自動取樣分析，而且樣品用量

23、較少，所測植株可以是活體植物材料。但是該方法的裝置成本高，提取物質只能用于化學分析，不適合于生物分析。另外提取的樣品必須立即分析，不能長時間保存。4. 總結煙草是一種重要的經濟作物，它在生長發(fā)育的每個階段都可能受到不同昆蟲或者病原物的侵害。而對于對病害或者昆蟲侵害起防御反應的一個重要方面就是萜類化合物的合成。但是關于昆蟲或者病害如何調控萜類化合物的合成，具體調控了哪些萜類化合物還是不清楚，有待深入研究。目前萜類物質及分析方法研究存在的問題。1. 采用不同的煙草種類或品種，提取到的萜類物質可能不同；2. 煙草在不同的環(huán)境條件下，例如，受到不同有害生物危害的情況下，萜類物質的合成和表達可能不同。3

24、. 不同的提取方法可能影響煙草萜類物質的分析。參考文獻：bailey ja, burden rs, vincent gg. 1975. capsidiol: an antifungal compound produced in nicotiana tabacum and nicotiana clevelandii following infection with tobacco necrosis virus. phytochemistry. 14: 597.bohlmann jrg, stauber ej , krock b, oldham nj, gershenzon j, baldwin

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