doc微柱高效液相色譜法測定大鼠腦微透析液中的乙酰膽堿和膽堿

1、微柱高效液相色譜法測定大鼠腦微透析液中的乙酰膽堿和膽堿2004年1月january2004色譜chinesejournalofchromatographyvo1.22n0.13335微柱高效液相色譜法測定大鼠腦微透析液中的乙酰膽堿和膽堿賈興元,吳安石,岳云,劉敬忠(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院,北京100020)摘要:用所建立的微柱高效液相色譜分離,柱后固定化酶反應(yīng)器酶解,電化學(xué)檢測器檢測的方法,對用不同濃度異氟醚麻醉前后的大鼠腦微透析液中的乙酰膽堿和膽堿的濃度進(jìn)行了測定.在乙酰膽堿和膽堿的濃度為102000nmovl時,其濃度分別與各自相應(yīng)峰高的線性關(guān)系良好,兩者的檢測限(以信噪比為3計)均

2、可達(dá)5nmol/l.微透析液中乙酰膽堿和膽堿的含量在大鼠清醒時最高,隨著異氟醚吸人濃度的增加,乙酰膽堿和膽堿含量明顯降低在大鼠海馬和腦皮層中乙酰膽堿濃度的降低與大鼠吸人異氟醚的濃度相關(guān)(p<0.05).研究結(jié)果表明,異氟醚麻醉劑抑制大鼠大腦皮層和海馬中乙酰膽堿的釋放程度與其劑量有關(guān).關(guān)鍵詞:高效液相色譜法;微柱;固定化酶反應(yīng)器;乙酰膽堿;膽堿中圖分類號:0658文獻(xiàn)標(biāo)識碼:a文章編號:10008713(2004)o1003303microborehighperformanceliquidchromatographicmethodformeasuringacetylcholineandch

3、olineinmicrodialysatesfromratbrainjiaxingyuan,wuanshi,yueyun,liujingzhong(beijingchaoyanghospitalaffiliateofcapitaluniversityofmedicalsciences,beffing100020,china)abstract:acetrlcholine(ach)andcholine(ch),twoimportantneurotransmitters,invivomicrodialysatesobtainedfromhippocampusandfrontalcortexofrat

4、sweremeasuredbymicroborehighperformanceliquidchromatographywithelectrochemicaldetectioncombinedwithapostcolumnimmobilizedenzymereactor.goodlinearrelationships(=0.990and0.991)betweentheconcentration(102000nmol/l)ofachandchinjectedontothecolumnandpeakheightwerefound.thelevelsofachandchwerefoundthehigh

5、estdudngthepedodofwakefuiness,andbecameincreasinglylowerduringanesthetizedperiodsduetotheincreasedconcentrationsofinhaledisoflurane.goodcorrelationbetweenthedecreaseinconcentrati0nofachinhippocampusandfrontalcortexofratsandtheconcentrationofinhaledisofluranewasfoundfp<0.05).theresultsindicatethat

6、isofluraneinducedadosedependentdecreaseinconcentrationofachintherathippocampusandfrontalcortex.keywords:highperformanceliquidchromatography;microborecolumn;immobilizedenzymereactor:acetylcholine;choline乙酰膽堿(ach)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性遞質(zhì)之一,參與調(diào)節(jié)多種神經(jīng)功能,如意識,學(xué)習(xí)和記憶等.研究表明,中樞膽堿功能的異常可導(dǎo)致多種疾病,如老年癡呆癥等.此外,全身麻醉藥對乙酰膽堿系統(tǒng)的影響是

7、其產(chǎn)生麻醉作用的機理之一.但是ach從突觸前膜分泌后,就迅速地被膽堿酯酶分解,導(dǎo)致細(xì)胞外液中ach的含量極低,而且由于ach和膽堿(ch,它既是合成ach的前體,也是ach的代謝產(chǎn)物)分子中都沒有生色基團(tuán),熒光基團(tuán)和電活性基團(tuán),所以對它們的分析檢測很困難.過去1o年間,文獻(xiàn)報道了多種檢測ach的方法,但靈敏度令人不甚滿意一.微柱電化學(xué)檢測法是一種靈敏度較高的方法,用其來檢測ach可以獲得滿意的結(jié)果.本文報道了我們所建立的微柱高效液相色譜(hplc)一柱后固定化酶反應(yīng)器(imer)一電化學(xué)檢測(ed)法,并將其用于測定用不同濃度異氟收稿日期:2oo3ll3作者簡介:賈興元,男,助理研究員,碩士,

8、主要研究方向為分子生物學(xué)和藥物學(xué),tel:(010)85231375,e-mail:jxingyuan163?corn?34?色譜第22卷醚麻醉前后的大鼠不同腦區(qū)微透析液中ach和ch的濃度.1實驗部分1.1儀器和試劑hplc儀為美國beckman公司產(chǎn)品,帶p一125泵,六通進(jìn)樣閥,接20l進(jìn)樣環(huán).微型actvch多聚分析柱(530mm1mmi.d.,顆粒大小10m)及柱后imer(55mm1mmi.d.,顆粒大小10m,含有乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶,多聚材料作為載體)由美國bas公司提供.檢測器為美國bas公司lc-4c安培型電化學(xué)檢測器,鉑金工作電極,ag/agc1參比電極.數(shù)據(jù)的采集,

9、儲存,處理和打印均在色譜工作站(色譜資料分析軟件為beckman公司提供的goldnouveauchromatographydatasystemversion1.7)上完成.微透析所用的主要儀器有:立體定位儀(美國bas公司),微量注射泵(cma/102,瑞典cma/microdialysis公司),微透析探針(cma/10,瑞典cma/microdialysis公司)(透析內(nèi)徑0.05mm,長1mm,能通過最大分子的相對分子質(zhì)量為20000),冷藏自動收集器(cma/170,瑞典cma/microdialysis公司).標(biāo)準(zhǔn)品ach鹽酸鹽(achc1),標(biāo)準(zhǔn)品ch鹽酸鹽(chc1)和防腐劑p

10、roclin由bas公司提供,乙二胺四乙酸(edta)等其他試劑為國產(chǎn)分析純.1.2色譜條件等度洗脫的流動相組成為含有0.005%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))proclin,50mmol/lnail,po,0.5mmol/lna2edta的溶液,用naoh調(diào)ph至8.50,流速為130l/min.參比電極的電位設(shè)置為+500mv,靈敏度為5nafs.色譜分析在室溫(25)下進(jìn)行.1.3標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制精確稱取achc135.3mg,chc127.9mg,分別溶于100.00ml含0.005%proclin的0.05mol/l乙酸標(biāo)準(zhǔn)稀釋液(用稀naoh調(diào)ph值為5.3)中.再從中分別取1.00ml,均用標(biāo)準(zhǔn)稀

11、釋液稀釋至50.00ml,制成各自的標(biāo)準(zhǔn)儲備液(40mol/l).1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備將10.o0ml的ach標(biāo)準(zhǔn)儲備液與l0.00ml的ch標(biāo)準(zhǔn)儲備液混合(濃度為20mol/l),精確加入前述標(biāo)準(zhǔn)稀釋液,配成10,40,100,400nmol/l和2mol/l的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列,分別用0.22m濾膜過濾,進(jìn)樣10l.1.5微透析液樣品的采集將體重為300350g的5只雄性spraguedawley大鼠用異氟醚麻醉后,固定在鼠立體定位儀上,并繼續(xù)令其吸入2%(體積分?jǐn)?shù),以下同此)異氟醚.以大鼠囪門為零點植入微透析導(dǎo)引管,插入大鼠大腦皮層的坐標(biāo)為:往前1.5mm,往右2.0mm,深度1.0m

12、m;插入其海馬的坐標(biāo)為:往后8.5mm,往右4.5mm,深度3.0mm.術(shù)后第3天開始實驗.實驗時將微透析探針插入到導(dǎo)引管中,灌注ringer氏液(組成為nac1147mmol/l,kc14.0mmol/l,cac122.2mmol/l,內(nèi)含新斯的明10mol/l),流速為2l/min.平衡2h后用冷藏自動收集器(4oc)收集樣品.對每只自由活動大鼠,每間隔20min收集一次,每次持續(xù)l0min,共收集3次.將3次測定的結(jié)果取平均值作為基礎(chǔ)值:然后,再將這5只大鼠用異氟醚麻醉后,調(diào)整其吸入異氟醚的濃度依次為0.6%,1.0%和1.4%,每一濃度下平衡20min后各收集一管.停止吸入異氟醚1h后

13、再各收集一管.取樣后立即進(jìn)樣10l測定:2結(jié)果與討論(1)有關(guān)微柱hplc一柱后imered法分析ach和ch詳細(xì)的機理和適宜條件已有報道.:樣品中的ach和ch經(jīng)前述分析柱分離后,在含有乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶的imer中,ach被水解為ch,水解產(chǎn)生的ch和樣品中原有的ch先后被氧化生成過氧化氫后在檢測池中被檢測,用外標(biāo)法進(jìn)行定量.圖1為標(biāo)樣和樣品中ach和ch的色譜圖.由圖1可知幾乎沒有其他雜質(zhì)峰的干擾(2)以乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶的濃度l,分別對其峰高進(jìn)行線性回歸,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在濃度為102000nmol/l時,ach的回歸方程為y=5.23510x(r=0.990),ch的回歸方程為

14、y=5.35410.x(r=0.991).最低檢測限(以信噪比為3計)均可達(dá)5nmol/l.用該方法分析ach和ch,其靈敏度明顯高于生物分析法,放射免疫分析法,氣相色譜火焰離子檢測法,氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法和常規(guī)柱的hplced法.常規(guī)柱hplced法分析ach和ch的檢測限也只達(dá)到50fmol/l(在進(jìn)樣20l的條件下):.(3)imer中乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶的活性都比較高,能充分轉(zhuǎn)變底物成過氧化氫,因此本實驗可在室溫條件下進(jìn)行.對于一個新的酶柱而言,提高柱溫作用不大,但當(dāng)酶柱接近失效期時,提高柱溫至3537可以延長它的有效時間.由于細(xì)菌產(chǎn)生的酶可以使過氧化氫很快被清除,因此在整個分析過

15、程中,要始終注意除菌和防止細(xì)菌的生長,第1期賈興元等:微柱高效液相色譜法測定大鼠腦微透析液中的乙酰膽堿和膽堿?35?以免因細(xì)菌的繁殖而影響檢測結(jié)果.該方法重復(fù)性良好,我們在室溫條件下5次進(jìn)樣l0nmol/l的ach和ch標(biāo)準(zhǔn)溶液,測得的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)分別為6.9%和6.7%;而5次進(jìn)樣100nmol/l的ach和ch標(biāo)準(zhǔn)溶液,測得的rsd分別為2.4%和2.1%.微透析探針在室溫條件下,對體外ach和ch的回收率(:5)分別為(71.33.7)%和(64.54.6)%.用不同濃度異氟醚麻醉大鼠后,其大腦皮層和海馬微透析液中ach和ch的變a12a/l,1ool5,/min化測試結(jié)果見表

16、1.在本實驗條件下測得的自由活動大鼠的ach和ch的清醒基礎(chǔ)值與前人在相近條件下所得的結(jié)果基本一致.大鼠海馬和大腦皮層微透析液中ach和ch的水平在自由活動狀態(tài)下明顯高于異氟醚麻醉狀態(tài)下的水平,并且隨吸入異氟醚濃度的增加而逐漸降低,在停止吸入1h后逐漸恢復(fù),但未恢復(fù)至基礎(chǔ)水平.本研究表明,異氟醚麻醉劑抑制大鼠大腦皮層和海馬中ach的釋放程度與其劑量有關(guān).o0l52o,/min圖1乙酰膽堿和膽堿的色譜圖fig.1chromatogramsofacetylcholine(ach)andcholine(cha.mixturestandards;b.micr0dialysatefromanesthet

17、izedrats.iach:2.ch.表1被不同濃度異氟醚麻醉的大鼠的大腦皮層和海馬微透析液中ach和ch的變化(均值標(biāo)準(zhǔn)差)(n:6)table1contentsofachandchinmicrodialysatesfromhippocampusandfrontalcortexofratsanesthetizedbydifferentconcentrationsofisoflnrane(meansd)(n=6)nmol/l參考文獻(xiàn):2345tsaith.jchromatogr,b:biomedsciappl,2000,747(1?2):1】yeweiling,maxiaofeng,meizh

18、entong.chinesejournalofchromatography(葉惟泠,馬曉峰.梅鎮(zhèn)彤色譜),1998,l6(5):375tsaith.chencf.neuroscilett.1994,l66(2):l75yasumatsum,yazawat,otokawam,kuwasawak,hasegawah.iiharay.compbiochemphysiol,parta:molintegrphysio1.1998.12la(1):l3carteraj,kehrj.jchromatogr,b:biomedsciappl,l997.692(1):207678910shiyl,chenwybrainres,l999.850(12):l73marrosuf.porlasc,masciams,casuma.fam.gi?agheddum.imperatoa,gessagl,brainr