DNA加合物誘導(dǎo)DNA損傷產(chǎn)生激酶DNA-PK、ATM和ATR對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控信通路分析課件

1、DNA加合物誘導(dǎo)DNA損傷產(chǎn)生激酶 DNA-PK、ATM和ATR對(duì)細(xì)胞周期 調(diào)控信號(hào)通路分析1 DNA加合物誘導(dǎo)加合物誘導(dǎo)DNA損傷產(chǎn)生激損傷產(chǎn)生激 酶酶DNA-PK、ATM和和ATR對(duì)細(xì)胞周對(duì)細(xì)胞周 期調(diào)控信號(hào)通路分析期調(diào)控信號(hào)通路分析 DNA加合物誘導(dǎo)DNA損傷產(chǎn)生激酶 DNA-PK、ATM和ATR對(duì)細(xì)胞周期 調(diào)控信號(hào)通路分析2 立項(xiàng)依據(jù)立項(xiàng)依據(jù) l環(huán)境、致癌物、化療藥物、生物病毒等可誘導(dǎo)哺乳動(dòng) 物細(xì)胞內(nèi)DNA損傷。DNA損傷時(shí)機(jī)體可通過(guò)自身的修 復(fù)系統(tǒng)進(jìn)行損傷修復(fù)。細(xì)胞內(nèi)通過(guò)延長(zhǎng)基因關(guān)卡和阻 止細(xì)胞周期進(jìn)程來(lái)為修復(fù)系統(tǒng)作用時(shí)間。其中涉及多 條信號(hào)通路和多種細(xì)胞周期蛋白、輔助因子及相關(guān)調(diào)

2、控蛋白?？梢酝ㄟ^(guò)提取哺乳細(xì)胞核提取物和用苯并蓖 二醇環(huán)氧化物（BPDE）等加和物處理的質(zhì)粒DNA在 體外實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證激酶DNA-PK和ATM對(duì)細(xì)胞周期的調(diào) 控。 DNA加合物誘導(dǎo)DNA損傷產(chǎn)生激酶 DNA-PK、ATM和ATR對(duì)細(xì)胞周期 調(diào)控信號(hào)通路分析3 研究背景研究背景 l精確的DNA加成物對(duì)引起細(xì)胞內(nèi)DNA損傷關(guān)卡反應(yīng)的 機(jī)制還不清楚。對(duì)酵母、爪蟾卵提取物、哺乳動(dòng)物細(xì) 胞等模式系統(tǒng)的研究表明：在DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中 DNA和RNA聚合酶在大量NDA堿基加合物存在時(shí)停止 運(yùn)動(dòng)，誘導(dǎo)DNA損傷關(guān)卡反應(yīng)。相似的，大量DNA加 成物存在時(shí)在下游DNA合成過(guò)程中使新引物越過(guò)損傷 缺口繼續(xù)復(fù)制，也可

3、能作為DNA損傷反應(yīng)的激活信號(hào)。 此外，在核苷酸切除修復(fù)過(guò)程中大量DNA加成物移除 產(chǎn)生短的ssDNA缺口也可能激活DNA損傷反應(yīng)。 DNA加合物誘導(dǎo)DNA損傷產(chǎn)生激酶 DNA-PK、ATM和ATR對(duì)細(xì)胞周期 調(diào)控信號(hào)通路分析4 自我假設(shè)自我假設(shè) l基于上述的信息，可以設(shè)想一個(gè)模型：在親代 ssDNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)阻滯過(guò)程中具有共同 中間體的位點(diǎn)作為DNA損傷關(guān)卡激活的靶點(diǎn)。 通過(guò)這一模型，ssDNA結(jié)合蛋白R(shí)PA快速與 ssNDA結(jié)合，然后通過(guò)ATR相關(guān)蛋白ATRIP直 接與ATR連接（ATRIP含有RPA亞基70KDa的 RAP1），ATR可以募集DNA損傷位點(diǎn)起始 DNA損傷信號(hào)通路。

4、 DNA加合物誘導(dǎo)DNA損傷產(chǎn)生激酶 DNA-PK、ATM和ATR對(duì)細(xì)胞周期 調(diào)控信號(hào)通路分析5 研究目的研究目的 l然而，還存在其它的可選擇機(jī)制來(lái)起始由DNA損傷引 起的DNA損傷修復(fù)反應(yīng)。例如，在只有ATR或者與激 酶激活伴侶蛋白TopBP1結(jié)合來(lái)識(shí)別起始信號(hào)通路。相 似的，ATR同核苷酸切除和錯(cuò)配修復(fù)因子的相互作用 也許控制不同形式DNA堿基損傷的DNA損傷修復(fù)。為 此，我們?cè)O(shè)計(jì)無(wú)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，她包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞核提 取物、損傷DNA和關(guān)卡靶蛋白基質(zhì)。這個(gè)體外系統(tǒng)可 以強(qiáng)烈的誘導(dǎo)關(guān)卡反應(yīng)包括對(duì)關(guān)卡反應(yīng)重要的關(guān)卡蛋 白P53、Chk1、RPA的磷酸化。通過(guò)次實(shí)驗(yàn)，我們發(fā) 現(xiàn)大量DNA加成物直接

5、激活蛋白激酶DNA-PK、ATR 和ATM，他們可以磷酸化多個(gè)關(guān)卡靶蛋白。 DNA加合物誘導(dǎo)DNA損傷產(chǎn)生激酶 DNA-PK、ATM和ATR對(duì)細(xì)胞周期 調(diào)控信號(hào)通路分析6 研究方案設(shè)計(jì)研究方案設(shè)計(jì) l1 取CHO細(xì)胞系A(chǔ)A8和V3進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培 養(yǎng)過(guò)后提取細(xì)胞核內(nèi)溶物。 l2 蛋白質(zhì)、激酶提純。在提純過(guò)程中用氮基三 乙酸鎳瓊脂糖（Ni-NTA agarose)純化，谷胱 甘肽轉(zhuǎn)移酶示蹤。BL21細(xì)胞系表達(dá)P53使用谷 胱甘肽凝膠樹(shù)脂提純。購(gòu)買(mǎi)凈化的NDAPK， HEK細(xì)胞系表達(dá)ATM激酶，用特異抗體親和層 析提純。 l3 化學(xué)試劑配制和相關(guān)抗體的制備。 DNA加合物誘導(dǎo)DNA損傷產(chǎn)生激酶 D

6、NA-PK、ATM和ATR對(duì)細(xì)胞周期 調(diào)控信號(hào)通路分析7 l4 細(xì)胞核提取物DNA-PK、ATM、ATR消耗量的測(cè)定。 用特異性抗體與提取物反應(yīng)，然后在谷胱甘肽樹(shù)脂層 析柱過(guò)濾，與HPLC聯(lián)用檢測(cè)信號(hào)在計(jì)算機(jī)上顯示。 以此來(lái)模擬細(xì)胞核提取物的消耗。 l5 制備DNA加合物BPDE與PUC19DNA耦合。 l6 激酶實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞核提取物與細(xì)胞關(guān)卡蛋白提取 物體外實(shí)驗(yàn)，過(guò)后Western Blotting驗(yàn)證關(guān)卡蛋白是否 磷酸化。 DNA加合物誘導(dǎo)DNA損傷產(chǎn)生激酶 DNA-PK、ATM和ATR對(duì)細(xì)胞周期 調(diào)控信號(hào)通路分析8 預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果 DNA加合物誘導(dǎo)DNA損傷產(chǎn)生激酶 DNA-PK

7、、ATM和ATR對(duì)細(xì)胞周期 調(diào)控信號(hào)通路分析9 研究條件研究條件 l1 CHO細(xì)胞系、 BL21細(xì)胞系、 HEK細(xì)胞系 l2 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽凝膠層析、 HPLC層析、 Western Blotting l3 PUC19提純物、加合物BPDE DNA加合物誘導(dǎo)DNA損傷產(chǎn)生激酶 DNA-PK、ATM和ATR對(duì)細(xì)胞周期 調(diào)控信號(hào)通路分析10 注釋及說(shuō)明注釋及說(shuō)明 l1 DNA加合物(DNA adduct )：DNA分子與化 學(xué)誘變劑間反應(yīng)形成的一種共價(jià)結(jié)合的產(chǎn)物。 這種結(jié)合激活了DNA的修復(fù)過(guò)程。如果這種修 復(fù)不是發(fā)生在DNA復(fù)制前，會(huì)導(dǎo)致核苷酸的替 代、缺失和染色體的重排。 l2 DN

8、A-PK、ATM、ATR屬于磷酸肌醇-3-激酶 相關(guān)蛋白激酶，可以起始DNA損傷反應(yīng)(DDR). DNA加合物誘導(dǎo)DNA損傷產(chǎn)生激酶 DNA-PK、ATM和ATR對(duì)細(xì)胞周期 調(diào)控信號(hào)通路分析11 l3 由于小組成員水平有限，在翻譯文章過(guò)程難 免有不當(dāng)之處。歡迎老師、同學(xué)交流指正。原 文鏈接： DNA加合物誘導(dǎo)DNA損傷產(chǎn)生激酶 DNA-PK、ATM和ATR對(duì)細(xì)胞周期 調(diào)控信號(hào)通路分析12 引用引用 l細(xì)胞生物學(xué)第三版，翟中和，王喜忠，丁 明孝主編 lAddress correspondence to: Aziz Sancar,Department of Biochemistry and Biophysics, Campus Box7260, University of North Carolina School of Medicine, Chapel Hill, N