豬傳染性胸膜肺炎血清學(xué)診斷方法研究進(jìn)展

1、豬傳染性胸膜肺炎血清學(xué)診斷方法研究進(jìn)展2011第5期養(yǎng)豬SWINEPRODUCTION105豬傳染性胸膜肺炎血清學(xué)診斷方法研究進(jìn)展王斌(四川省畜牧科學(xué)研究院獸藥研究所,四川成都610066)中圖分類號(hào):$858.285.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號(hào):10021957(2011)05010503摘要:豬傳染性胸膜肺炎是國(guó)際上公認(rèn)的危害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的五大疾病之一.在我國(guó),其血清陽(yáng)性率呈上升趨勢(shì),研究快速,科學(xué),準(zhǔn)確的診斷方法對(duì)于本病的監(jiān)測(cè)和控制具有很大的意義.本文就該病的血清學(xué)診斷技術(shù)研究進(jìn)展作一綜述,重點(diǎn)介紹ELISA檢測(cè)方法的進(jìn)展.關(guān)鍵詞:豬傳染性胸膜肺炎;診斷;ELISA豬傳染性胸膜肺炎(Porc

2、inecontagiouspleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌ctinobacillusHeuropneumoniae,APP)引起的豬呼吸系統(tǒng)的一種嚴(yán)重接觸性傳染病.自Pattison1957年報(bào)道該病以來(lái),英國(guó),德國(guó),瑞士,丹麥,澳大利亞,加拿大等國(guó)家均有發(fā)生,目前此病已呈世界性分布,給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大損失【lJ.隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)集約化程度的提高,從國(guó)外引進(jìn)豬種的增加,該病也隨之傳入我國(guó),其發(fā)生和流行目趨嚴(yán)重嘲.因此對(duì)PCP進(jìn)行快速,準(zhǔn)確的診斷具有十分重大的意義,但是PCR,熒光抗體染色法等方法由于試驗(yàn)條件,人員能力等原因還不可能在基層廣泛使用,血清學(xué)方法仍然是PC

3、P診斷的主要手段.本文就該病目前的血清學(xué)診斷技術(shù)研究進(jìn)展作一綜述.1補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(ComplementFixationTest,CFr)CFI是用來(lái)檢測(cè)APP的最早的血清學(xué)方法,它由Nicolet于1971年建立后很快成為APP分型的標(biāo)準(zhǔn)方法.Gunnarss0nr3q979年比較全細(xì)胞抗原,高壓處理抗原,混合抗原和酚水抗原在CFT上的效果發(fā)現(xiàn),全細(xì)胞抗原同時(shí)具有種和型的特異性,而酚水抗原型特異性最好.CFT的特異性比間接血凝試驗(yàn)(IHA)高,能夠?qū)⒏比苎允妊獥U菌(Haemophilusparahaemoelyticus)與APP區(qū)別開(kāi);但敏感性低,而且有時(shí)會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果,加上操作復(fù)雜,只

4、適合實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用,難以推廣.2間接血凝試驗(yàn)(IndirectHemagg1ntinati0nAssay,IHA)1983年,Mittal等41用鹽浸,煮沸和高壓處理3種方法提取APP抗原,建立了APP的IHA用于檢測(cè)和分型,發(fā)現(xiàn)煮沸法獲取的抗原在APP1型,3型,5型的檢測(cè)中具有比鹽浸法提取抗原更高的特異收稿日期:201l-0829作者簡(jiǎn)介:王斌(1981一),男,四川成都人,助理研究員,碩士,主要從事動(dòng)物疾病的診斷和治療.Email:binwang_555163.corn性.APP2型與異源血清交叉反應(yīng)嚴(yán)重,尤其是用高壓處理的抗原更明顯.不過(guò)它能將4型和7型分開(kāi),這是其它一些檢測(cè)方法難以達(dá)到的

5、.為克服交叉反應(yīng)的問(wèn)題,B1ackatl(1990)在應(yīng)用本方法時(shí),將待檢血清按倍比稀釋后,可消除大多數(shù)非特異性反應(yīng),但仍不能將APP一6和APP一8,APP一9和APP一11分開(kāi).我國(guó)逯忠新等同以APP超聲波處理抗原和鹽浸抗原致敏綿羊紅細(xì)胞,建立了IHA.超聲波處理抗原具有種特異性,能與APP110型的高免兔血清發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng),與豬瘟,豬肺疫等類似癥狀疾病呈陰性反應(yīng).鹽浸抗原具有型特異性,筆者用此法對(duì)我國(guó)4個(gè)省的APP血清型進(jìn)行了調(diào)查,主要為2,3,7型.由于此方法操作簡(jiǎn)便,耗時(shí)少,目前已成為我國(guó)主要的檢測(cè)和分型方法.3乳膠凝集試驗(yàn)(LatexAgglutinationTest,LAT)Mit

6、ui等1981年建立乳膠凝集法檢測(cè)APP抗體,其特異性和敏感性與試管凝集試驗(yàn),補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn),瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)相當(dāng).不同血清型之間有較小的交叉反應(yīng),但異種血清無(wú)交叉反應(yīng).1995年,Inzana6對(duì)LAT進(jìn)行改進(jìn),以莢膜缺陷株對(duì)同型血清進(jìn)行吸附,除去非莢膜抗體,從而得到純度較高的莢膜抗體,包被乳膠顆粒,檢測(cè)APP莢膜多糖.此法具有很高的特異性,與豬放線桿菌,豬巴氏桿菌,副豬嗜血桿菌無(wú)交叉反應(yīng),只與APP同型的的菌株反應(yīng).4瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(GelImmunodiffusion,GID)Gunnarss0nn1979年以酚水法提取5個(gè)APP血清型的抗原建立APP的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)表明,酚水抗原具有型特異性,與

7、異種血清型無(wú)交叉反應(yīng).國(guó)內(nèi)李開(kāi)玉等閻報(bào)道用酚水抗原檢測(cè)血清,特異性最高,但仍不能區(qū)分血清型1和9,血清型3,6和8.不同血清型之間的交叉反應(yīng)可通過(guò)菌體吸收法除去.該法耗時(shí)較長(zhǎng),但操作簡(jiǎn)便,試劑易得,結(jié)果判定簡(jiǎn)單,適宜基層應(yīng)用.106養(yǎng)豬SWINEPRODUCTION(5)20115酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosobentassay,ELISA)5.1種特異性ELISASehaller等911999年發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了ApxIV毒素,任何APP血清型都能在感染豬體內(nèi)分泌該毒素,但在體外不分泌.目前,國(guó)內(nèi)外已成功實(shí)現(xiàn)了ApxIV毒素的體外表達(dá).Dreyfus等n12004年以A

8、pxiv重組蛋白建立了ADXIVELISA,特異性和敏感性分別達(dá)到100%D93.8%.此外,Apx11也可作為一種很好的診斷抗原,除血清型10外,在生物I型的所有血清型中均可分泌,利用ADx作為診斷抗原,理論上可以對(duì)除10型外的其它生物I型的感染作出診斷.Leiner等【和徐曉娟等I先后利用克隆表達(dá)的Apx作為診斷抗原,建立ELISA診斷方法,與CFr和IHA比較,具有更高的特異性和敏感性.盡管ADx毒素具有很高的免疫原性,并產(chǎn)生很高的抗體滴度,但也存在缺陷,除Apxlgr,ApxI,Apx,ApxIlI在其它放線桿菌屬的細(xì)菌也可分泌,如林氏放線桿菌和豬放線桿菌等,因此,在利用ADxI,作抗

9、原進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果.5-2型特異性ELISAAPP的血清分型是根據(jù)莢膜多糖(CPS)和脂多糖(LPS)抗原性的不同.對(duì)APP型的鑒定,需依靠型特異性的CPS和LPS.Nielsen等(1991)利用煮沸法抽提APP2型的LPS和CPS作為包被抗原,以兔抗APP2血清作為阻斷劑建立阻斷ELISA,對(duì)感染APP2型養(yǎng)殖場(chǎng)的96份血清樣品進(jìn)行檢測(cè),陽(yáng)性率達(dá)到90%,與CFT相比具有更高的特異性和敏感性.Klausen等(2001)利用純化的APP6型LPS作包被抗原,以兔抗APP6血清作為阻斷劑建立阻斷ELISA,特異性和敏感性分別達(dá)到97%H100%.Andresen等用與K1au

10、sen相同的方法建立APP12型的阻斷ELISA,敏感性和特異性分別達(dá)到77%和100%.APP的LPS在血清型1,9,11,3,6,8,4,7之間有相似的抗原決定簇16,17,理論上利用LPS建立的ELISA檢測(cè)方法在對(duì)以上血清型進(jìn)行鑒定時(shí)存在交叉反應(yīng),Nielsen(1993)_l7J提取APP8型的LPs建立阻斷ELISA,阻斷劑多克隆抗APP8的血清在使用前用3型和6型的全菌體吸附,目的在于除去3,6,8型LPS共有的抗原決定簇,避免交叉反應(yīng),試驗(yàn)結(jié)果也表明,此方法具有型的特異性,與3型和6型無(wú)交叉.而Klausen用同樣方法建立的APP6型阻斷ELISA,結(jié)果仍發(fā)現(xiàn)與APP3型和AP

11、P8型有交叉反應(yīng)現(xiàn)象.在生物I型的12個(gè)血清型中,只有2,5,10,12血清型LPS具有唯一的重復(fù)寡糖結(jié)構(gòu)和組成成分,理論上針對(duì)這些型的LPS建立的ELISA具有型的特異性.此外,LPS與其他非致病性的放線桿菌也存在交叉反應(yīng),因此,利用LPS建立的ELISA并不能對(duì)所有血清型進(jìn)行鑒定.Boss6等(1990)191提取APP1型,5型,7型,2型的CPS建立ELISA血清學(xué)診斷方法,臨床檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1,5,7型只與相應(yīng)APP的抗血清呈陽(yáng)性反應(yīng),而2型則與5型血清有很大的交叉反應(yīng),且與豬放線桿菌(A刪is)感染的血清交叉反應(yīng)也大,1型和5型與A舢is只有輕微的交叉反應(yīng),7型與A.suis無(wú)交叉反應(yīng).

12、因此,1型,5型,7型的CPSELISA可有效用于抗體監(jiān)測(cè),而2型的CPSELISA因交叉反應(yīng)太大,結(jié)果不確實(shí).Inzana等(2001)將生物素與CPS偶聯(lián)后作為包被抗原建立ELISA檢測(cè)方法,1型和5型的特異性達(dá)到100%,7型為94.5%,1型和7型的敏感性達(dá)到100%,5型為94.5%.國(guó)內(nèi)外已有許多關(guān)于型特異性ELISA診斷方法的報(bào)道,但臨床上APP的感染并非單一的血清型,甚至存在一頭豬感染多種血清型的報(bào)道,如果選取的型特異性診斷方法與豬感染的血清型不符合,那么則會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果,造成誤診,若用多種血清型的血清學(xué)診斷方法對(duì)樣品逐個(gè)進(jìn)行排除診斷,既費(fèi)時(shí)又增加檢測(cè)成本.國(guó)外的Boss6等

13、(1993)211以APP1,5,7型的型特異性多糖作包被抗原建立混合ELISA,敏感性和特異性分別達(dá)到96%*I199.5%.Hansen等(2003)以純化的APP2,6,12血清型的長(zhǎng)鏈LPS建立混合ELISA,臨床檢測(cè)只與APP3型和8型出現(xiàn)交叉反應(yīng),具有很高的特異性和敏感性,并成功用于豬場(chǎng)的免疫監(jiān)控.6展望臨床APP感染情況的監(jiān)測(cè),對(duì)控制APP發(fā)生具有重要意義.ApxIV被認(rèn)為是種特異性最好的抗原,表達(dá)純化ApxlV建立ELISA是檢測(cè)APP并區(qū)別于其它病原的最好方法.APP血清型眾多,各型問(wèn)交叉反應(yīng)嚴(yán)重,這給血清型的診斷帶來(lái)很大困難.借鑒國(guó)外診斷試劑盒研發(fā)經(jīng)驗(yàn),根據(jù)我國(guó)APP主要流

14、行的血清型,研制型特異性ELISA試劑盒或MIXELISA試劑盒,可解決臨床上大多數(shù)的APP血清型的鑒定,將有力推動(dòng)我國(guó)豬傳染性胸膜肺炎的診斷和防控水平.參考文獻(xiàn):1】宣長(zhǎng)和.豬病學(xué)M】.第2版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2003:119122.2】許如蘇,沈燁,蔡雄丹,等.中國(guó)獸醫(yī)雜志J】,2003,39(2):23.3GunnarssonAAmJVetRest,1979,40(11):15641567.41MittalKR,HigginsR,LariviereS.JClinMicrobiolJ,1983,17f51:787790.5逯忠新,魯炳義,趙萍,等.中國(guó)獸醫(yī)科技【JJ,1999

15、,290)i30-31.2011第5期養(yǎng)豬SWINEPRODUCTION107幾種抗茵藥物對(duì)豬傳染性胸膜肺炎的臨床療效試驗(yàn)陸江寧,張秀英,許貴新,齊幫若(1.黑龍江農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系,黑龍江佳木斯154007;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,哈爾濱150030:3.黑龍江省嫩江縣九三局紅五月農(nóng)場(chǎng),黑河161446)中圖分類號(hào):$858.285.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號(hào):10021957(2011)05一-010702摘要:本試驗(yàn)分別以佳木斯市周邊地區(qū)10個(gè)規(guī)模化生豬養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)經(jīng)確診為豬傳染性胸膜肺炎的病豬為給藥對(duì)象,進(jìn)行抗菌藥物單獨(dú)使用與聯(lián)合使用療效比較試驗(yàn).每場(chǎng)選擇(80+6)頭豬,隨機(jī)

16、分為4組,3個(gè)試驗(yàn)組每組20頭,其余為對(duì)照組,進(jìn)行藥敏試驗(yàn)并根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選取敏感藥物進(jìn)行治療試驗(yàn).藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,試驗(yàn)動(dòng)物對(duì)氟苯尼考和鹽酸多西環(huán)素敏感.臨床治療試驗(yàn)結(jié)果表明,在給藥方案中氟苯尼考和鹽酸多西環(huán)素聯(lián)合用藥組對(duì)豬傳染性胸膜肺炎治愈率顯著高于其單獨(dú)用藥組(P<O.05),治療效果好.關(guān)鍵詞:豬傳染性胸膜肺炎;敏感藥物;臨床療效豬傳染性胸膜肺炎是一種嚴(yán)重的呼吸道傳染病,是當(dāng)今大型養(yǎng)豬場(chǎng)的三大呼吸道傳染病之一.近年來(lái)隨著我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,豬傳染性胸膜肺炎在我國(guó)多省流行蔓延開(kāi)來(lái),呈現(xiàn)暴發(fā)式流行,嚴(yán)重威脅著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,已成為危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一11.商品豬免疫預(yù)防

17、由于血清型較多,各血清型交叉保護(hù)性不強(qiáng)以及成本較高在臨床中不易實(shí)現(xiàn),因而及時(shí)有效的藥物防治對(duì)豬傳染性胸膜肺炎有著極為重要的臨床意義團(tuán).本試驗(yàn)以體外抑菌試驗(yàn)篩選的敏感藥物氟苯尼考和鹽酸多西環(huán)素為試驗(yàn)藥物,研究藥物單獨(dú)使用及聯(lián)合使用對(duì)豬傳染性胸膜肺炎的治療效果.收稿日期:2011-0830作者簡(jiǎn)介:陸江寧(1972一),女,吉林梨樹(shù)人,副教授,研究方向?yàn)榛A(chǔ)獸醫(yī)學(xué).Email:hnzylujiangning126mm通訊作者:張秀英,博士生導(dǎo)師,教授.E一-maf1.zxy51hotmaflJ2om1材料與方法1.1試驗(yàn)材料病料于2010年3月采集佳木斯市周邊地區(qū)10個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)內(nèi),經(jīng)臨床診斷為豬

18、傳染性胸膜肺炎病死豬的氣管分泌物,肺臟,肝臟,.腎臟等組織.試驗(yàn)藥品使用浙江伊科拜克動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn)的氟苯尼考,商品名伊克立康(成分為1C%氟甲砜霉素預(yù)混劑,批號(hào)2009X035365)和齊魯動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn)的鹽酸多西環(huán)素(成分為10%鹽酸多西環(huán)素預(yù)混劑,批號(hào)2007150256011),以上藥物均購(gòu)于哈爾濱獸藥大市場(chǎng).1.2試驗(yàn)方法1.2.1試驗(yàn)動(dòng)物的選擇與分組分別對(duì)佳木斯市周邊地區(qū)10個(gè)規(guī)模化生豬養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)疑似發(fā)生豬傳染性胸膜肺炎的病豬進(jìn)行篩選,經(jīng)臨床檢查,病理剖檢,實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)確診為豬傳染性胸膜肺炎的病豬為6】InzanaTJ-JClinMicrobiolJ,1995,33(9)

19、:22972303.【7】GunnarssonAAmJVetResJl,1979,40(4):469一-472.【8李開(kāi)玉,朱士盛,杜華宏,等.中國(guó)獸醫(yī)科技J】,1991,21(1):3739.9SehallerA,KuhnR,KuhnertP,.eta/.MicrobiologyJ,1999,145(8):2105-2116.10】DreyfusA,challerA,NivolletSet.VetMicrobiolJ.,2004.,99(3-4).227-.238.11LeinerG,.FFanzB,StrutzbergK,et.CJinDiagnLabImmunolJ,1999.,6(4):630-632.1ZI徐曉娟,何啟蓋,徐高原,等.中國(guó)獸醫(yī)J】,2004,24(4):335-337.13SehallerA,KuhnertP,delaPuen