氨基酸的測定

1、氨基酸測定 047312120趙璐璐 047312117王夢園 氨基酸的定義 它是含有氨基和 羧基的一類有機化合 物的通稱。大分子蛋 白質的基本組成單位， 是構成動物營養(yǎng)所需 蛋白質的基本物質。 是含有一個堿性氨基 和一個酸性羧基的有 機化合物。氨基連在 -碳上的為-氨基 酸。組成蛋白質的氨 基酸均為-氨基酸。 食品中蛋白質的氨基酸組成 蛋白質是由氨基酸組成的高分子化合物，目前各種 氨基酸已達175種以上，但是構成蛋白質的氨基酸主 要是其中的20種，按照-氨基酸側鏈R基團的結構可 分為： 脂肪族類：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異 亮氨酸。 羥基類：絲氨酸、蘇氨酸 酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨

2、酸 堿性氨基酸：賴氨酸、精氨酸、組氨酸 酰胺類：天冬酰胺、谷氨酰胺 含硫類：半胱氨酸、蛋氨酸 芳香族類：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸 亞氨基酸：脯氨酸 在構成構成蛋白質的氨基酸中，亮氨酸、異亮氨 酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和 纈氨酸等8種氨基酸在人體中不能合成，必須依靠從 食品攝入，故被稱為必需氨基酸，它們對人體有著極 其重要的生理功能。 限制氨基酸：是指食物蛋白質中一種或幾種必需 氨基酸缺少或數(shù)量不足，就會使食物蛋白質合成為機 體蛋白質的過程受到限制，亦即限制了此種蛋白質的 營養(yǎng)價值，這類氨基酸就稱為限制氨基酸。 評價某種蛋白質的營養(yǎng)價值包括兩個方面：一是 各種必需氨基酸含量是

3、否豐富，二是必需氨基酸的構 成是否符合一定比例。 食品中蛋白質的氨基酸組成 測定意義 隨著食品科學的發(fā)展和營養(yǎng)知識的普及，食物蛋白質中必 需氨基酸含量的高低及氨基酸的構成，愈來愈得到人們的重 視。為提高蛋白質的生理效價而進行食品氨基酸互補和強化 的理論，對食品加工工藝的改革，對保健食品的開發(fā)及合理 配膳等工作都具有積極的指導作用。因此，食品及其原料中 氨基酸的分離、鑒定和定量也就具有極其重要的意義。 鑒于食品中氨基酸成分的復雜性，在一般的常規(guī)檢驗中多 測定樣品中的氨基酸總量，通常采用酸堿滴定法測定。 色譜技術的發(fā)展則為各種氨基酸的分離、鑒定及定量提供 了有力的工具，近年世界上已出現(xiàn)多種氨基酸分

4、析儀，這使 得快速鑒定和定量氨基酸的理想成為現(xiàn)實。 氨基酸的定性測定 個別氨基酸的顯色反應氨基酸的一般顯色反應 a)茚三酮法 b)吲哚醌法 c)鄰苯二甲醛法 a)精氨酸（坂口反應） b)胱氨酸和半胱氨酸 c)甘氨酸 d)脯氨酸 e)絲氨酸和羥賴氨酸 f)羥脯氨酸 g)色氨酸 h)酪氨酸 i)酪氨酸和組氨酸（Pauly 反應） 氨基酸的定量測定 個別氨基酸的定量測定氨基酸的一般定量測定 a)甲醛滴定法 b)電位滴定法 c)茚三酮比色法 d)非水溶液滴定法 e)鄰苯二甲醛法 f)三硝基苯磺酸法 g)乙酰丙酮和甲醛熒光法 a)賴氨酸 b)色氨酸 c)苯丙氨酸 d)酪氨酸 e)脯氨酸 f)羥脯氨酸 g

5、)胱氨酸 h)谷氨酸 氨基酸的分離及測定 a)薄層色譜法 b)氨基酸自動分析儀法 c)氣相色譜法 d)高效液相色譜法 茚三酮法 （以測定蜂蜜及果葡糖漿中的氨基酸含量為例） 雙語例句 反應原理 氨基酸在一定pH條件下與茚三酮起反應，生成藍紫色化合物，可 比色(570nm)定量。 注意：茚三酮受陽光、溫度、濕度、空氣等影響易被氧化呈淡紅或深 紅色，使用前要進行純化,方法如下： 取10g茚三酮容于40ml熱水中，加1克活性炭，搖勻靜置30分鐘， 過濾，將濾液放入 冰箱中，即出現(xiàn)藍色結晶，過 濾，用2ml冷水洗滌結晶，置 干燥皿中干燥，裝瓶備用。 茚三酮法 （以測定蜂蜜及果葡糖漿中的氨基酸含量為例）

6、雙語例句 1.材料與方法：葵花蜜、洋槐蜜等； 茚三酮、谷氨酸、磷酸氫二鈉、磷 酸二氫鉀、硼酸等。7200可見分光 光度計等 2.實驗方法 2.1氨基酸標準曲線的繪制 準確稱取100mg谷氨酸(純度不低 于99% )，溶于100 mL水中，即母 液。用此母液及磷酸緩沖液配制終 質量濃度分別為0，20 , 40 , 60 , 80 ,100 ,150 g/mL的標準溶液。 取5 mL標準溶液，加入1.0 mL 5 mg/mL茚三酮溶液，沸水加熱5 min，冷卻后加水定容至10mL ,于 570 nm處測定吸光度，繪制谷氨 酸標準曲線 。 2.2回收率及精密度實驗 用去離子水將谷氨酸和果葡糖漿 配制

7、成谷氨酸含量分別為 50,25,12.5 , 6.25 g/mL的果葡 糖漿樣品。以未加谷氨酸的果葡 糖漿為空白，采用茚三酮法測定 其中的氨基酸含量。計算回收率 和相對標準偏差(RSD ) 。 2.3果葡糖漿中氨基酸含量的測 定 ：取13份不同的果葡糖漿樣 品各5g，編號分別為HFCS1至 HFCS13，采用茚三酮法測定每 個樣品的氨基酸含量。 2.4蜂蜜中氨基酸含量的測定取 冬蜜、拎蜜、洋槐蜜、葵花蜜、 龍眼蜜，采用茚三酮法測定每個 樣品的氨基酸含量。 茚三酮法 （以測定蜂蜜及果葡糖漿中的氨基酸含量為例） 雙語例句 2.5蜂蜜與果葡糖漿混合物中 氨基酸含量的測定 根據(jù)1.3.3節(jié)測定結果，分

8、別 用氨基酸含量最低和最高的果 葡糖漿將冬蜜、葵花蜜、洋槐 蜜按不同比例混合成果葡糖漿 含量為0 , 20% , 40% ,60% , 80%的蜂蜜樣品，采用茚三酮 顯色法測定每個樣品的氨基酸 含量。 2.6數(shù)據(jù)處理方法 每個實驗做3次平行試驗，實 驗結果用平均值表示。平均值 及其他統(tǒng)計參數(shù)(標準差及相 對標準偏差)的計算采用excel 軟件處理。 結論 1)采用茚三酮顯色法測定的 蜂蜜及果葡糖漿的氨基酸含 量在0150 g/mL范圍，該 法具有線性好、準確性及精 密度高等特點。 2)蜂蜜與果葡糖漿混合物中 的氨基酸含量和果葡糖漿摻 入量呈良好的負線性關系。 采用茚三酮顯色法測定蜂蜜 樣品的氨

9、基酸含量，可以快 速判斷蜂蜜中是否摻入了果 葡糖漿。 甲醛滴定法 雙語例句 反應原理原理 將酸度計的玻璃電極及甘汞 電極同時插入被測液中構成電 池，用氫氧化鈉標準溶液滴定 到酸度計指示的pH值為8.2為 終點，記下所用的氫氧化鈉的 體積數(shù)V1,此時滴定的是游離酸, 根據(jù)氨基酸的兩性作用,再加入 甲醛以固定氨基的堿性，使羧 基顯示出酸性，繼續(xù)用氫氧化 鈉標準溶液滴定到酸度計指示 的pH值為9.2為終點,此時滴定 的是氨基酸。 雙指示劑： 40%中性甲醛溶液： 以百里酚酞作指示劑，用氫氧化 鈉將40%甲醛中和至淡藍色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液， （9.410.6） 0.1%中性紅 50%乙醇溶液

10、，（6.88.0） 0.1 mol/L 氫氧化鈉標準溶液。 操作：取相同兩份樣品20 30mg分別于250ml三角瓶各 加50ml蒸餾水 一份加中性紅 3滴用0.1mol/L NaOH滴定終 點（由紅變琥珀色），記錄用量， 另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中 性甲醛20ml搖勻用0.1mol/L NaOH 滴至淡藍色。分別記錄兩 次所消耗的堿液ml數(shù)。 （以測定氨杞精口服液中的氨基酸含量為例） 甲醛滴定法 計算： 氨基酸態(tài)氮= c（V2-V1） 0.014100） /W100 V1用中性紅為指示劑 時，堿液所消耗的體積 V2用百里酚酞乙醇液 為指示劑時標液消耗量 應用： 氨杞精口服液是由天然原料提

11、 取的氨基酸粉(含20多種氨基酸)， 加上構祀子、黃精煎煮液配制而 成的口服液。其中氨基酸為主要 有效成份， 采用甲醛滴定法測定 氨基酸的總量做為質量控制方法， 操作簡便 。 醬油的檢測也可用此法。 （以測定氨杞精口服液中的氨基酸含量為例） 電位滴定法 雙語例句 反應原理 將酸度計的玻璃電極及甘 汞電極同時插入被測液中構成 電池，用氫氧化鈉標準溶液滴 定到酸度計指示的pH值為8.2 為終點，記下所用的氫氧化鈉 的體積數(shù)V1,此時滴定的是游離 酸,根據(jù)氨基酸的兩性作用,再加 入甲醛以固定氨基的堿性，使 羧基顯示出酸性，繼續(xù)用氫氧 化鈉標準溶液滴定到酸度計指 示的pH值為9.2為終點,此時滴 定的

12、是氨基酸。 儀器 附磁力攪拌器的酸度計;25mL酸式 滴定管; 10mL胖肚吸管。 （以測定醬油中的氨基酸含量為例） 電位滴定法 （以測定醬油中的氨基酸含量為例） 操作方法： （1）樣品處理：先測出待測醬油的比重，然后吸取醬油5.00mL于 100mL容量瓶中,加水定容。吸取定容液20.00mL于250mL燒杯中, 加水60mL，放入磁力轉子，開動磁力攪拌器使轉速適當。用 pH6.18的標準緩沖液校正好酸度計，然后將電極清洗干凈，再插 入到上述醬油液中，用NaOH標準溶液滴定至酸度計指示pH8.2,記 下消耗的NaOH溶液體積。 （2）氨基酸的滴定：在上述滴定至pH8.2的溶液中加入10.00

13、mL 的中性甲醛溶液，再用NaOH標準溶液滴定至pH9.2,記下消耗的 NaOH溶液體積。 （3）空白滴定：吸取80mL蒸餾水于250mL的燒杯中，用NaOH 標準溶液滴定至pH8.2,然后加入10.00mL中性甲醛溶液，再用 NaOH標準溶液滴定至pH9.2,記下加入甲醛后消耗的NaOH溶液體 積。 100 10020m 014. 0CVV % 21 ）（ 氨基酸態(tài)氮 薄層色譜法 原理： 取一定量經水解的樣品溶 液，滴在制好的薄層板上， 在溶劑系統(tǒng)中進行雙向上行 法展開，樣品各組分在薄層 板上經過多次的被吸附、解 吸、交換等作用，同一物質 具有相同的Rf值，不同成分 則有不同的Rf值，因而各

14、種 混合物可達到彼此被分離的 目的。然后用茚三酮顯色， 與標準氨基酸進行對比，鑒 別各種氨基酸種類，從顯色 斑點顏色的深淺 可以大致確定其 含量。 （以測定味精中的氨基酸含量為例） a b 樣點樣點 溶劑前沿溶劑前沿 點樣原點點樣原點 Rf = a / b 薄層色譜法 操作方法： 薄層板制備 樣品液制備 點樣：距薄板底端2cm處， 用針畫一標記作為原點。再以點 樣距扳子寬窄可點幾個點同時 展 開，點與點之間間隔12cm。 可用毛細玻璃管、微量吸管或 微量注射器。注意要等一個點干 了再點另一個點。 展開：點樣完了，放入密閉容 器中（展開槽），傾斜一定角度 1030，下端浸入展開劑1cm， 千萬別

15、讓溶劑浸過了樣點。到離 頂端一部分，取出樣板、晾干、 顯色。 （以測定味精中的氨基酸含量為例） 顯色： a.噴適當?shù)娜芤?，使斑點顯色， 即噴霧顯色。 b.噴有熒光反應的物質，在紫 外光下觀察斑點。 c.將涂有熒光指示劑的薄層板 放在紫外燈下觀察。 （涂板時把熒光指示劑加入 到固體吸附劑中） 氨基酸自動分析儀法 雙語例句 樣品的處理 取含蛋白20 mg的各種樣 品于水解管中，加12 mL的6 mol/L鹽酸，滴入幾滴苯酚， 充氮后封管，置于1100C烘箱 中保持22 h，冷卻后經濾紙過 濾到50 mL容量瓶中，用超純 水反復沖洗水解管及濾紙，最 后定容至刻度。 取1 mL的樣液于蒸發(fā)皿中在蒸 氣

16、浴上蒸干，加超純水重復三 次，殘留物用0.02mo1/L HCl 定容至10 ml。 0.45m濾膜過 濾，備用上機。 標準曲線繪制 精確吸取經脯氨酸標準溶液0 mL, 0.5 mL,1.0 mL,1.5 mL, 2.0 mL, 2.SmL, 3.0 mL分別加入到100 mL容量瓶中，用水稀釋到刻度， 進氨基酸分析儀分析，以峰面積 和濃度繪制標準曲線如圖。 （乳制品中羥脯氨酸） 氨基酸自動分析儀法 雙語例句 樣品的檢測與分析 分別取市售不同的膠原蛋白 粉、明膠、奶粉等樣品，按上 述樣品處理方法進行處理后進 樣，測定不同樣品中17種水解 氨基酸和經脯氨酸的含量。 若樣品中檢出有經脯氨酸，則 說

17、明有膠原蛋白的存在，可作 為乳粉中是否添加動物膠原水 解蛋白的依據(jù)。 該方法樣品處理簡便易操 作，可以對羥脯氨酸直接進行 分析，避免了衍生產物的多樣 性，也不涉及樣品中氨基酸衍 生不徹底等問題，能快速、準 確地判斷乳制品中是否添加了 動物膠原水解蛋白。 （乳制品中羥脯氨酸） 氣相色譜法 雙語例句 （辨別燕窩的真?zhèn)危?1. 氨基酸標準溶液的配制 2.樣品液的制備 2.1樣品水解：稱取約50mg 研碎的樣品(如為燕窩飲品，則 過濾，將固形物供干、研碎后 稱取)，放于l 0ml容量瓶中，加 入5一7mL6N鹽酸，用高純氮 氣排走空氣，蓋緊塞子，放于 145C烘箱中水解4小時，冷卻， 加氫氧化鈉中和，

18、如懸濁，則 離心后取5m1澄清液做下一步 處理。 反應原理： 一定量的氣體或液體分析物 被注入到柱一端的進樣口中。 當分析物在載氣帶動下通過 色譜柱時，分析物的分子會 受到柱壁或柱中填料的吸附， 使通過柱的速度降低。由于 每一種類型的分子都有自己 的通過速率，分析物中的各 種不同組分就會在不同的時 間到達柱的末端，從而得到 分離。檢測器用于檢測柱的 流出流，從而確定每一個組 分到達色譜柱末端的時間以 及每一個組分的含量。通過 物質流出柱的順序和它們在 柱中的保留時間來表征不同 的物質。 氣相色譜法 雙語例句 （辨別燕窩的真?zhèn)危?2.2水解液凈化：取5m1水 解液倒入裝有陽離子交換樹脂 的玻璃柱中，以0. 5mL/min 的流速過柱，然后用蒸餾水洗 柱，直至用硝酸銀溶液檢不出 氯離子為止，再依次用 5mL2N氨水溶液和25mL蒸 餾水將氨基酸洗脫出來，合并 洗脫液，真空蒸發(fā)溶液至近干， 用少量0. 1N鹽酸將殘液轉移 到微量反應瓶做下一步處理。 2.3氨基酸衍生化：將上述 溶液轉移于微量反應瓶中，在 100砂浴中用氮氣吹干，加 入。 5mL二氯甲烷，再置砂浴， 繼續(xù)吹入氮氣，使殘存的水分 共沸吹出。 吹干后，加入1. 5mL3N鹽酸一正 丁醇溶液，在超聲