熒光素酶報告基因檢測

1、熒光素酶報告基因檢測熒光素酶報告基因檢測原則熒光素酶檢測系統(tǒng)，可用裂解液來溫和而快速地提取真核細胞中的熒光素酶，用其底物來檢測熒光素酶活性。檢測步驟如下：1)加裂解緩沖液裂解轉(zhuǎn)染的細胞。2)將上述裂解物轉(zhuǎn)移入微孔板或者試管中（根據(jù)檢測的需要選擇所用器材類型）。3)加入含有所有酶反應成分（必須包括底物熒光素），使化學發(fā)光反應開始。4)用熒光儀或者液閃計數(shù)儀檢測所發(fā)射的熒光。特點敏感度和檢測范圍：5 fg熒光素酶發(fā)射光的線性范圍：10 fg10 ng確切的檢測限依檢測儀器而定。特異性：本文介紹的熒光素酶報告基因系統(tǒng)的操作步驟，通常用來檢測轉(zhuǎn)染了螢火蟲熒光素酶基因的真核細胞中熒光素酶表達的活性。不適

2、用于對細菌熒光素酶進行檢測。器材和試劑器材在微孔板或試管中，用自動或手動熒光儀、液閃計數(shù)儀或者攝影膠片都可以檢測到熒光素酶活性，而且高度敏感。當用微孔板時可以是白色，也可為黑色。試劑1)熒光素酶檢測試劑：熒光素酶檢測試劑包括熒光素、atp、coa、以及一些添加劑，這些試劑可以啟動酶反應。這種熒光酶檢測試劑的混合物可穩(wěn)定保存在在-60以下12個月，-15- 25一個月，28只能保存一周。避免反復凍融。應避光保存，因為熒光素在光照下會發(fā)生氧化。2)裂解緩沖液：下面將加以介紹。基本操作步驟下面的操作步驟適用于培養(yǎng)的真核細胞。提取物必須立刻檢測，否則必須在-15-25儲存大約一個月。不要反復凍融以避免

3、酶活性的降低。1)將熒光素酶報告基因與-gal對細胞進行共轉(zhuǎn)染，按實驗計劃進行處理。2)徹底吸去培養(yǎng)皿（60mm）中的細胞培養(yǎng)液，用冰預冷的磷酸鹽緩沖液（pbs，無鈣和鎂離子）小心沖洗細胞3次，徹底去除剩余的pbs。10pbs緩沖液：nacl 100g，kcl 2.5g，na2hpo414.4g，kh2po42.5g，用三蒸水定容至1000 ml。3)加入最小體積的triton/甘氨酰甘氨酸裂解緩沖液蓋過細胞，例如60 mm的培養(yǎng)皿用360 l裂解液，35毫米的培養(yǎng)板用150 l裂解液。用橡皮刮將細胞刮離培養(yǎng)皿。將裂解物轉(zhuǎn)移到微量離心管中。triton/甘氨酰甘氨酸裂解緩沖液：1%（v/v）t

4、riton x-100，25mmol/l甘氨酰甘氨酸（ph7.8），15mmol/l mgso4，4mmol/l egta，1mmol/l dtt（臨用前加入）4)在漩渦混合器上輕輕振蕩細胞裂解液，以最大速度4離心以去除細胞碎片。將上清轉(zhuǎn)移到另一個微量離心管中，置于冰上以備分析。5)在開始化學發(fā)光反應之前，將100 l的細胞提取物轉(zhuǎn)移到熒光儀或者液閃計數(shù)儀所用的檢測器皿中（我們建議用96孔板）。加入360 l熒光素酶分析緩沖液。熒光素酶分析緩沖液：25m mol/l甘氨酰甘氨酸（ph 7.8），15mmol/l mgso4，4mmol/l egta，2mmol/l atp，1mmol/ l d

5、tt（臨用前加入）6)用25mmol/l（ph7.8）的甘氨酰甘氨酸稀釋熒光素至200mol/l。熒光素貯液：1mmol/l d-熒光素（合成晶體蛋白，sigma），25mmol/l甘氨酰甘氨酸（ph 7.8），10mmol/l dtt。（分成1ml小份，-70保存在避光盒中幾個月）7)樣品中加入200 l稀釋的熒光素液。熒光素在光照下迅速發(fā)生氧化，因此丟棄未用完的熒光素稀釋液。在562nm條件下進行檢測。注意事項：1)熒光素酶檢測試劑需在15-25的條件預平衡后再進行反應，而后依據(jù)具體條件進行自動或手動檢測。當用液閃計數(shù)儀時，加入熒光素酶檢測試劑后立即輕輕混勻。.加入熒光素酶檢測試劑0.5-

6、10秒內(nèi)開始檢測發(fā)射光1-5秒，持續(xù)發(fā)光20秒后，產(chǎn)生光強度降低，其半衰期為5分鐘。2)如果細胞裂解后不能立即對提取物進行檢測，樣品可以在冰上保存大約5個小時，在-70可保存數(shù)月。3)利用上述方法檢測冷的樣品時，其信號強度將下降5-15%。4)在熒光素酶活性較高的情況下，導致信號超出線性范圍（信號溢出），可用裂解液將樣品進行稀釋。5)我們建議不要儲存稀釋過的樣品。如果必須保存，要在稀釋的樣品中加入bsa至終濃度為2.5mg/ml，這樣可以保持樣品的穩(wěn)定性。6)如果樣品中的熒光素酶的活性較高，應盡可能減少所用來檢測的樣品的體積。在這種情況下，按照標準操作，可以相應減少所使用的熒光素酶檢測試劑（熒光素酶試劑體積/樣品體積=100l/20-50l），這樣對檢測結(jié)果沒有影響。7)一些熒光儀在進行檢測前需要1-2秒的穩(wěn)定，因此，我們建議在開機后過一段時間再進行檢測操作。8)有一些熒光儀需要在不改變樣品體積的條件下加入更多的檢測試劑（如30