植物基因工程中的λ噬菌體載體

1、植物基因工程中的植物基因工程中的 噬菌體載體噬菌體載體 20132013年年6 6月月2929日日 載體（載體（vectorvector）是把一個有用的目的）是把一個有用的目的DNADNA片段通過片段通過 重組重組DNADNA技術(shù)，送進受體細胞中去進行繁殖和表達的技術(shù)，送進受體細胞中去進行繁殖和表達的 工具。工具。 植物基因工程技術(shù)中尤為重要的植物基因工程技術(shù)中尤為重要的是載體，不同目的是載體，不同目的 基因需要采用不同的載體?；蛐枰捎貌煌妮d體。 組成植物組成植物基因工程載體系統(tǒng)常見的幾種載體有：基因工程載體系統(tǒng)常見的幾種載體有： 質(zhì)粒質(zhì)粒 噬菌體噬菌體 柯斯質(zhì)?？滤官|(zhì)粒(cosmid(

2、cosmid) ) m13m13單鏈?zhǔn)删w。單鏈?zhǔn)删w。 噬菌體是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋噬菌體是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋 體等微生物的細菌病毒，結(jié)構(gòu)簡單、基因體等微生物的細菌病毒，結(jié)構(gòu)簡單、基因 數(shù)少，是分子生物學(xué)與基因工程的良好實數(shù)少，是分子生物學(xué)與基因工程的良好實 驗系統(tǒng)。驗系統(tǒng)。 噬菌體有嚴(yán)格的宿主特異性，只寄居在易噬菌體有嚴(yán)格的宿主特異性，只寄居在易 感宿主菌體內(nèi)。感宿主菌體內(nèi)。 噬菌體具有高效率的感染性和自主復(fù)制繁噬菌體具有高效率的感染性和自主復(fù)制繁 殖性能，使它能高效導(dǎo)入受體細胞，并能殖性能，使它能高效導(dǎo)入受體細胞，并能 使攜帶的外源基因在受體細胞中高效擴增，使攜帶的外源

3、基因在受體細胞中高效擴增， 所以噬菌體被開發(fā)成基因工程的有用載體。所以噬菌體被開發(fā)成基因工程的有用載體。 噬菌體噬菌體(bacteriophage(bacteriophage，phage)phage)簡介簡介 噬菌體分類噬菌體分類 毒性噬菌體（毒性噬菌體（virulent phagevirulent phage） ：吸附、穿入、生物合成、成熟、：吸附、穿入、生物合成、成熟、 釋放釋放 溫和噬菌體（溫和噬菌體（temperate phagetemperate phage） ：轉(zhuǎn)導(dǎo)、溶：轉(zhuǎn)導(dǎo)、溶源源性轉(zhuǎn)換性轉(zhuǎn)換 噬菌體噬菌體 溫和噬菌體可有三種存在狀態(tài)：溶菌周期的具有感染溫和噬菌體可有三種存在狀態(tài)

4、：溶菌周期的具有感染 性的游離噬菌體顆粒；溶源周期的前噬菌體；宿主菌性的游離噬菌體顆粒；溶源周期的前噬菌體；宿主菌 細胞質(zhì)內(nèi)的游離噬菌體核酸。細胞質(zhì)內(nèi)的游離噬菌體核酸。 DNADNA重組技術(shù)一般需要重組技術(shù)一般需要噬菌體進入溶菌狀態(tài)。噬菌體進入溶菌狀態(tài)。 目前用于基因克隆的噬菌體載體及其衍生載體有：目前用于基因克隆的噬菌體載體及其衍生載體有： 單鏈單鏈M13M13噬菌體載體；噬菌體載體； 噬菌體載體；噬菌體載體； P1P1噬菌體載體；噬菌體載體； 噬菌粒載體；噬菌粒載體； 等等。等等。 其中使用最多的是入噬菌體。其中使用最多的是入噬菌體。 噬菌體噬菌體 噬菌體是溫和噬菌體，屬長尾噬菌體科，頭殼

5、為直徑約噬菌體是溫和噬菌體，屬長尾噬菌體科，頭殼為直徑約50nm50nm的二的二 十面體，其內(nèi)包裹一長線狀雙鏈?zhǔn)骟w，其內(nèi)包裹一長線狀雙鏈DNADNA分子（分子（46500bp46500bp）。）。 左臂：從左臂：從A到到J長約長約 20kb，其中的基因編，其中的基因編 碼構(gòu)成頭部、尾部、碼構(gòu)成頭部、尾部、 尾絲對組裝完整噬菌尾絲對組裝完整噬菌 體所需要的蛋白質(zhì)。體所需要的蛋白質(zhì)。 中段：從中段：從J到到N長約長約 20kb，是，是DNA整合整合 和切出，溶原生長所和切出，溶原生長所 需的序列需的序列 ，但非溶菌但非溶菌 生長所必需生長所必需 右臂：長約右臂：長約10kb，控，控 制溶菌和溶原

6、生長最重制溶菌和溶原生長最重 要的調(diào)控基因和序列、要的調(diào)控基因和序列、 以及以及DNA復(fù)制起始均復(fù)制起始均 在這區(qū)域內(nèi)。在這區(qū)域內(nèi)。 基因組長約基因組長約50kb 50kb ，至少包括，至少包括6161個基因，除少數(shù)例外，大多數(shù)編碼基因均是按功能的相似個基因，除少數(shù)例外，大多數(shù)編碼基因均是按功能的相似 性成簇排列。性成簇排列。左右臂包含左右臂包含DNA復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生 長所需全部序列；對溶菌生長來說，中段是非必需的。長所需全部序列；對溶菌生長來說，中段是非必需的。 在在DNA雙鏈分子的兩個雙鏈分子的兩個5 端各有端

7、各有12個核苷酸單鏈的互補個核苷酸單鏈的互補 粘性末端，粘性末端，且兩者的核苷酸序列互補，當(dāng)且兩者的核苷酸序列互補，當(dāng)噬菌體噬菌體感染宿感染宿 主細胞后主細胞后，其，其DNA可迅速通過粘性末端配對而成雙鏈環(huán)狀可迅速通過粘性末端配對而成雙鏈環(huán)狀 DNA分子，這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)域稱為分子，這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)域稱為cos 位點。位點。 cos位點位點 （cohesive end site） 如果將左右臂和中段都去除，僅留下如果將左右臂和中段都去除，僅留下DNADNA而端包裝而端包裝 噬菌體所必需的噬菌體所必需的coscos序列，再加上質(zhì)粒的復(fù)制序列、序列，再加上質(zhì)粒的復(fù)制序列

8、、 標(biāo)志基因、多克隆位點等，就可構(gòu)成標(biāo)志基因、多克隆位點等，就可構(gòu)成coscos質(zhì)粒或稱為質(zhì)?；蚍Q為 粘粒的載體。粘?？刹迦胝沉５妮d體。粘?？刹迦?5kb45kb長的外源長的外源DNADNA，然后，然后 用用噬菌體外殼蛋白包裝成噬菌體，感染大腸桿菌噬菌體外殼蛋白包裝成噬菌體，感染大腸桿菌 后，粘粒的后，粘粒的DNADNA能以質(zhì)粒的形式在細菌中繁殖而被克能以質(zhì)粒的形式在細菌中繁殖而被克 隆。所以粘粒主要用于隆。所以粘粒主要用于DNADNA文庫的構(gòu)建。文庫的構(gòu)建。 當(dāng)噬菌體感染宿主細胞后, 雙鏈DNA 分子通過cos 而成環(huán)狀。 在感染早期, 環(huán)狀DNA 分子進行轉(zhuǎn)錄。在此期間, 噬 菌體有兩條復(fù)

9、制途徑可供選擇: 一是裂解生長。環(huán)狀 DNA 分子在宿主細胞里復(fù)制若干次, 合成了大量的 噬菌體基因產(chǎn)物, 形成子代噬菌體顆粒, 成熟后使細 菌裂解, 釋放出許多新的有感染能力的病毒顆粒。另 一是溶源性生長。噬菌體DNA 整合進宿主菌的基因 組,然后像細菌染色體上的基因一樣進行復(fù)制, 并傳 遞給下一代細菌。 由于噬菌體頭部包裝容量的限制，重組-DNA分子 大小只能在3952kb之間。 噬菌體的繁殖方式噬菌體的繁殖方式 在感染的細胞內(nèi)在感染的細胞內(nèi), , 噬菌體有兩條復(fù)制途徑噬菌體有兩條復(fù)制途徑: : 1 1、裂解生長、裂解生長 2 2、溶源性生長、溶源性生長 DNADNA重組技術(shù)一般需要重組技

10、術(shù)一般需要噬菌體進入溶菌狀態(tài)。噬菌體進入溶菌狀態(tài)。 噬菌體載體的構(gòu)建噬菌體載體的構(gòu)建 構(gòu)建方式：構(gòu)建方式： 1 1、插入型。只具有一個限制酶位點，可便于外源、插入型。只具有一個限制酶位點，可便于外源 DNADNA插入，這種載體叫插入型載體（插入，這種載體叫插入型載體（insertion insertion vectorsvectors）。）。 2 2、置換型。含有二個限制酶切點，在兩個位點之間、置換型。含有二個限制酶切點，在兩個位點之間 的的DNADNA區(qū)段可以被外源區(qū)段可以被外源DNADNA片段所取代。這種載體片段所取代。這種載體 叫置換型載體（叫置換型載體（replacement vect

11、orsreplacement vectors）。）。 至今已用噬菌體開發(fā)出許多插入型和置換型載體至今已用噬菌體開發(fā)出許多插入型和置換型載體 插入型載體插入型載體: ZAP,ZAP, gt10,gt11: ZAP,ZAP, gt10,gt11等等 置換型載體置換型載體: GEM-11, GEM-12,EMBL3,EMBL4: GEM-11, GEM-12,EMBL3,EMBL4等等 構(gòu)建過程構(gòu)建過程 野生型野生型噬菌體噬菌體DNA必須經(jīng)過改造才能成為理想必須經(jīng)過改造才能成為理想 的載體，其構(gòu)建過程主要有：的載體，其構(gòu)建過程主要有：刪除基因組中非刪除基因組中非 必需區(qū)，建立外源必需區(qū)，建立外源DN

12、A片段的替換點，增加承載片段的替換點，增加承載 外源外源DNA片段的容量。片段的容量。在非必需區(qū)內(nèi)插入或替在非必需區(qū)內(nèi)插入或替 換選擇的標(biāo)記基因和目的基因。換選擇的標(biāo)記基因和目的基因。建立重組建立重組 DNA分子的體外包裝系統(tǒng)，使之有效地感染受分子的體外包裝系統(tǒng)，使之有效地感染受 體細胞。簡而言之，將目的基因插入或替換進入體細胞。簡而言之，將目的基因插入或替換進入 病毒基因組的可替代區(qū)，再利用病毒的侵染性，病毒基因組的可替代區(qū)，再利用病毒的侵染性， 將目的基因?qū)胧荏w細胞，這就是病毒作為將目的基因?qū)胧荏w細胞，這就是病毒作為“分分 子運輸車子運輸車”的基本機理。的基本機理。 噬菌體載體的應(yīng)用噬

13、菌體載體的應(yīng)用 一、建立一、建立cDNA文庫文庫 噬菌體載體系統(tǒng)是在噬菌體載體系統(tǒng)是在eDNAeDNA文庫構(gòu)建中最早使用的載體文庫構(gòu)建中最早使用的載體 系統(tǒng)，其主要優(yōu)點是插入片段的裝載容量大，適合于系統(tǒng)，其主要優(yōu)點是插入片段的裝載容量大，適合于 全長的全長的eDNAeDNA克隆，不僅質(zhì)量高、代表性好，而且重組克隆，不僅質(zhì)量高、代表性好，而且重組 噬菌體顆粒的感染活性在噬菌體顆粒的感染活性在44環(huán)境中極其穩(wěn)定，非常環(huán)境中極其穩(wěn)定，非常 適合于適合于eDNAeDNA文庫的長期保存。文庫的長期保存。 cDNA與載體重組，或經(jīng)體外包裝成噬菌體顆粒后與載體重組，或經(jīng)體外包裝成噬菌體顆粒后轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 導(dǎo)導(dǎo)宿主細

14、胞，或不經(jīng)體外包裝直接宿主細胞，或不經(jīng)體外包裝直接轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染宿主細胞，但宿主細胞，但 轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率較高。轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率較高。 DNADNA作為外源基因的克隆載體作為外源基因的克隆載體 基因組中間部分占基因組中間部分占30% 30% 的的DNA(DNA(包括重組和溶源化基因包括重組和溶源化基因) )并并 不是噬菌體裂解生長所必需的，裂解生長所需的基因都在基不是噬菌體裂解生長所必需的，裂解生長所需的基因都在基 因組的左側(cè)和右側(cè)，而典型的因組的左側(cè)和右側(cè)，而典型的克隆載體在部分或全部非必克隆載體在部分或全部非必 需基因的兩側(cè)含有限制酶位點，這就賦予了需基因的兩側(cè)含有限制酶位點，這就賦予了載體克隆大片載體克隆

15、大片 段的能力，外源基因插入到限制酶位點之間，在體外包裝成段的能力，外源基因插入到限制酶位點之間，在體外包裝成 噬菌體，雖然包裝效率僅達噬菌體，雖然包裝效率僅達10%10%，但一經(jīng)包裝，在大腸桿菌，但一經(jīng)包裝，在大腸桿菌 中形成噬菌斑的效率可達中形成噬菌斑的效率可達100% 100% 。目前由。目前由衍生的許多載體衍生的許多載體 被廣泛地應(yīng)用于基因克隆中，尤其是在構(gòu)建基因文庫中的應(yīng)被廣泛地應(yīng)用于基因克隆中，尤其是在構(gòu)建基因文庫中的應(yīng) 用產(chǎn)生了非常好的效果。用產(chǎn)生了非常好的效果。 二、克隆外源目的序列二、克隆外源目的序列 為了使外源基因能有效轉(zhuǎn)錄，將其插入為了使外源基因能有效轉(zhuǎn)錄，將其插入DNA

16、DNA的的PLPL 啟動子或啟動子或PRPR啟動子的有效轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)。啟動子的有效轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)。 噬菌體載體的克隆原理和步驟噬菌體載體的克隆原理和步驟 （1）通過裂解過程增殖載體）通過裂解過程增殖載體 通過噬菌體的增殖，從中提取噬菌體通過噬菌體的增殖，從中提取噬菌體DNA 噬菌體載體均含有與裂解生長所必須的基噬菌體載體均含有與裂解生長所必須的基 因片斷，不同的載體采用不同的大腸桿菌因片斷，不同的載體采用不同的大腸桿菌 宿主菌來增殖。宿主菌來增殖。 經(jīng)過裂解生長獲得噬菌體經(jīng)過裂解生長獲得噬菌體 顆粒，再經(jīng)過分級分離分化，可用于提取顆粒，再經(jīng)過分級分離分化，可用于提取 噬菌體噬菌體DNA。 （2） 載體與

17、外源片斷的酶切載體與外源片斷的酶切 插入型載體來說，載體被酶切后，很容易插入型載體來說，載體被酶切后，很容易 自身連接，一般對載體的進行去磷酸化。自身連接，一般對載體的進行去磷酸化。 置換型載體，切割后形成左臂、填充片斷、置換型載體，切割后形成左臂、填充片斷、 右臂，填充片斷的存在會影響連接效率，右臂，填充片斷的存在會影響連接效率， 必須純化左臂和右臂。必須純化左臂和右臂。 （3）外源片斷與載體的連接）外源片斷與載體的連接 通過載體的粘性末端，將載體連接成多聯(lián)通過載體的粘性末端，將載體連接成多聯(lián) 體，以利于將兩個體，以利于將兩個cos位點之間的片斷裝入位點之間的片斷裝入 噬菌體顆粒噬菌體顆粒

18、（4）重組噬菌體的體外包裝，形成有感染力）重組噬菌體的體外包裝，形成有感染力 的噬菌體顆粒的噬菌體顆粒 利用特殊材料，制備噬菌體包裝蛋白利用特殊材料，制備噬菌體包裝蛋白 連接產(chǎn)物與包裝蛋白混合時，就可完成包連接產(chǎn)物與包裝蛋白混合時，就可完成包 裝反應(yīng)，形成有感染力的噬菌體顆粒裝反應(yīng)，形成有感染力的噬菌體顆粒 包裝蛋白對所包裝的包裝蛋白對所包裝的DNA大小有高度選擇大小有高度選擇 性，性， 范圍：范圍：DNA分子的分子的75105 噬菌體的改造噬菌體的改造 設(shè)計去除設(shè)計去除DNA上的多余序列和一些限制性酶切點：因為上的多余序列和一些限制性酶切點：因為 DNA較大，序列中的限制性酶切點過多，妨礙其應(yīng)用。較大，序列中的限制性酶切點過多，妨礙其應(yīng)用。 在中段非必需區(qū)，替換或插入某