第3章DNA的復(fù)制

1、第三章第三章 DNA的復(fù)制的復(fù)制 本章重點介紹遺傳中心法則和本章重點介紹遺傳中心法則和DNA的半的半 保留復(fù)制以及逆轉(zhuǎn)錄的過程和機理，對保留復(fù)制以及逆轉(zhuǎn)錄的過程和機理，對DNA 的損傷和修復(fù)、突變和重組作一般介紹。的損傷和修復(fù)、突變和重組作一般介紹。 思考思考 DNA是絕大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，繼是絕大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，繼 1953年年Watson 2;2引物酶既可以利用核糖核苷酸，而引物酶既可以利用核糖核苷酸，而 RNARNA聚合酶只能利用核糖核苷酸聚合酶只能利用核糖核苷酸;3;3引物酶只在復(fù)引物酶只在復(fù) 制起點處合成制起點處合成RNARNA引物而引發(fā)引物而引發(fā)DNADNA的復(fù)制

2、，而的復(fù)制，而RNARNA聚聚 合酶則是啟動合酶則是啟動DNADNA轉(zhuǎn)錄合成轉(zhuǎn)錄合成RNARNA從而將遺傳信息由從而將遺傳信息由 DNADNA傳遞到傳遞到RNARNA。但在單鏈?zhǔn)删w。但在單鏈?zhǔn)删wM13DNAM13DNA和質(zhì)粒和質(zhì)粒 Co1E1DNACo1E1DNA復(fù)制時，引物的合成是由復(fù)制時，引物的合成是由RNARNA聚合酶催化聚合酶催化 的。噬菌體的。噬菌體T7T7的的Gene4Gene4蛋白，蛋白，T4T4的的Gene41Gene41和和6161蛋白蛋白 等也具有引物酶的活性和具有大腸桿菌引物酶相似等也具有引物酶的活性和具有大腸桿菌引物酶相似 的功能。的功能。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科

3、學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 DNADNA在細(xì)胞內(nèi)往往以超螺旋狀態(tài)存在，在細(xì)胞內(nèi)往往以超螺旋狀態(tài)存在， DNADNA拓?fù)涿复呋煌負(fù)涿复呋籇NADNA分子不同超螺分子不同超螺 旋狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)變。旋狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)變。DNADNA拓?fù)洚悩?gòu)酶有拓?fù)洚悩?gòu)酶有 兩類，大腸桿菌的兩類，大腸桿菌的蛋白蛋白(MW-110000)(MW-110000) 就是一種典型的拓?fù)洚悩?gòu)酶就是一種典型的拓?fù)洚悩?gòu)酶.它的作它的作 用是暫時切斷一條用是暫時切斷一條DNADNA鏈，形成酶鏈，形成酶-DNA-DNA 共價中間物而使超螺旋共價中間物而使超螺旋DNADNA松弛化，然松弛化，然 后再將切斷的單鏈后再

4、將切斷的單鏈DNADNA連接起來，而不連接起來，而不 需要任何輔助因子。而大腸桿菌中的需要任何輔助因子。而大腸桿菌中的 DNADNA旋轉(zhuǎn)酶旋轉(zhuǎn)酶(DNA gyrase)(DNA gyrase)則是典型的拓則是典型的拓 撲異構(gòu)酶撲異構(gòu)酶，能將負(fù)超螺旋引入，能將負(fù)超螺旋引入DNADNA分分 子，該酶能暫時性地切斷和重新連接子，該酶能暫時性地切斷和重新連接 雙鏈雙鏈DNADNA，同時需要，同時需要ATPATP水解為水解為ADPADP以供以供 能。能。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白(SSBP) 螺旋酶沿復(fù)制叉方向向前推進產(chǎn)生了一

5、段單鏈區(qū)，但是這種單鏈螺旋酶沿復(fù)制叉方向向前推進產(chǎn)生了一段單鏈區(qū)，但是這種單鏈 DNADNA不會長久存在，會很快重新配對形成雙鏈不會長久存在，會很快重新配對形成雙鏈DNADNA或被核酸酶降解或被核酸酶降解 。在細(xì)胞內(nèi)有大量單鏈。在細(xì)胞內(nèi)有大量單鏈DNADNA結(jié)合蛋白能很快地和單鏈結(jié)合蛋白能很快地和單鏈DNADNA結(jié)合，防結(jié)合，防 止其重新配對形成雙鏈止其重新配對形成雙鏈DNADNA或被核酸酶降解。一個或被核酸酶降解。一個SSBPSSBP四聚體結(jié)四聚體結(jié) 合于單鏈合于單鏈DNADNA上可以促進其他上可以促進其他SSBPSSBP四聚體現(xiàn)相鄰的單鏈四聚體現(xiàn)相鄰的單鏈DNADNA結(jié)合，結(jié)合， 這個過程

6、稱為協(xié)同結(jié)合這個過程稱為協(xié)同結(jié)合(cooperative binding)(cooperative binding)，SSBPSSBP結(jié)合到單結(jié)合到單 鏈鏈DNADNA上后，使其呈伸展?fàn)顟B(tài)，沒有彎曲和結(jié)節(jié)，有利于單鏈上后，使其呈伸展?fàn)顟B(tài)，沒有彎曲和結(jié)節(jié)，有利于單鏈DNADNA 作為模板。作為模板。SSBPSSBP可以重復(fù)使用，當(dāng)新生的可以重復(fù)使用，當(dāng)新生的DNADNA鏈合成到某一位置鏈合成到某一位置 時，該處的時，該處的SSBPSSBP便會脫落，并被重復(fù)利用。便會脫落，并被重復(fù)利用。 螺旋酶（螺旋酶（helicasehelicase）可以促使）可以促使DNADNA在復(fù)制叉處打在復(fù)制叉處打 開雙

7、鏈。螺旋酶可以和單鏈開雙鏈。螺旋酶可以和單鏈DNADNA結(jié)合，并且與結(jié)合，并且與 ATPATP結(jié)合，利用結(jié)合，利用ATPATP分解成分解成ADPADP時產(chǎn)生的能量沿時產(chǎn)生的能量沿 DNADNA鏈向前運動促使鏈向前運動促使DNADNA雙鏈打開。目前，大腸雙鏈打開。目前，大腸 桿菌中發(fā)現(xiàn)有兩種螺旋酶參與這個過程，一種桿菌中發(fā)現(xiàn)有兩種螺旋酶參與這個過程，一種 稱為螺旋酶稱為螺旋酶或螺旋酶或螺旋酶，與前導(dǎo)鏈的模板，與前導(dǎo)鏈的模板DNADNA 結(jié)合沿結(jié)合沿5353方向運動方向運動; ;第二種稱為第二種稱為RepRep蛋白，蛋白， 和前導(dǎo)鏈的模板和前導(dǎo)鏈的模板DNADNA結(jié)合沿結(jié)合沿3535方向運動。方向

8、運動。 DNA聚合酶催化的鏈延長反應(yīng)聚合酶催化的鏈延長反應(yīng) 5 RNA引物引物 子鏈 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 模板鏈 DNA聚合酶聚合酶(DNA Polymerase) 共同性質(zhì)共同性質(zhì) 1以脫氧核苷酸三磷酸以脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為前體催化合成為前體催化合成 DNA; 2需要模板和引物的存在需要模板和引物的存在; 3不能起始合成新的不能起始合成新的DNA鏈鏈; 4催化催化dNTP加到生長中的加到生長中的DNA鏈的鏈的3-OH末端末端; 5催化催化DNA合成的方向是合成的方向是53。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 大腸桿菌三種

9、大腸桿菌三種DNA聚合酶比較聚合酶比較 DNA 聚合酶聚合酶 分子量分子量 每個細(xì)胞的分子統(tǒng)計數(shù)每個細(xì)胞的分子統(tǒng)計數(shù) 5 -3 聚合酶作用聚合酶作用 3 -5 核酸外切酶作用核酸外切酶作用 5 -3 核酸外切酶作用核酸外切酶作用 轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率 DNA 聚合酶聚合酶 109，000 400 + + + 1 120，000 100 + + - 0 .05 400，000 10-20 + + - 50 比較項目比較項目 DNA 聚合酶聚合酶 切除引物切除引物 修復(fù)修復(fù) 修復(fù)修復(fù) 復(fù)制復(fù)制 功能功能 1999年發(fā)現(xiàn)聚合酶年發(fā)現(xiàn)聚合酶 和和，它們涉及，它們涉及DNA的錯誤傾的錯誤傾 向修復(fù)（向修復(fù)（er

10、ror-prone repair） 大腸桿菌DNA聚合酶 (DNA pol ) 大腸桿菌每個細(xì)胞中只有大腸桿菌每個細(xì)胞中只有10-2010-20個個DNA pol 分子，分子， 該酶對模板的要求與該酶對模板的要求與DNADNA聚合酶聚合酶相同，最適模板相同，最適模板 也是鏈也是鏈DNADNA中間有空隙的單鏈中間有空隙的單鏈DNADNA，單鏈結(jié)合蛋白可，單鏈結(jié)合蛋白可 以提高該酶催化單鏈以提高該酶催化單鏈DNADNA模板的模板的DNADNA聚合作用。聚合作用。DNA DNA pol pol 也有也有3535和和5353外切酶活性，但是外切酶活性，但是 3535外切酶活性的最適底物是單鏈外切酶活性

11、的最適底物是單鏈DNADNA，只產(chǎn)生，只產(chǎn)生 5-5-單核苷酸，不會產(chǎn)生二核苷酸，即每次只能從單核苷酸，不會產(chǎn)生二核苷酸，即每次只能從 33端開始切除一個核苷酸。端開始切除一個核苷酸。5353外切酶活性也要外切酶活性也要 求有單鏈求有單鏈DNADNA為起始作用底物，但一旦開始后，便為起始作用底物，但一旦開始后，便 可作用于雙鏈區(qū)?？勺饔糜陔p鏈區(qū)。 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶(DNApol) 1970年發(fā)現(xiàn)了DNA pol 。此酶MW為120 KD，每 個細(xì)胞內(nèi)約有100個酶分子，但活性只有DNA pol 的5%。 (1)(1)聚合作用聚合作用: :該酶催化該酶催化DNADNA的聚合，但

12、是對模板的聚合，但是對模板 有特殊的要求。該酶的最適模板是雙鏈有特殊的要求。該酶的最適模板是雙鏈DNADNA而中間而中間 有空隙有空隙(gap)(gap)的單鏈的單鏈DNADNA部份，而且該單鏈空隙部份部份，而且該單鏈空隙部份 不長于不長于100100個核苷酸。對于較長的單鏈個核苷酸。對于較長的單鏈DNADNA模板區(qū)該模板區(qū)該 酶的聚合活性很低。酶的聚合活性很低。 (2)(2)該酶具有該酶具有3535外切酶活性，但無外切酶活性，但無5353外切外切 酶活性。酶活性。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 (3)該酶對作用底物的選擇性較強，一般只能將該酶對作用底

13、物的選擇性較強，一般只能將2 脫氧核苷酸摻入到脫氧核苷酸摻入到DNA鏈中。鏈中。 (4)該酶不是復(fù)制的主要聚合酶，因為此酶缺陷的該酶不是復(fù)制的主要聚合酶，因為此酶缺陷的 大腸桿菌突變株的大腸桿菌突變株的DNA復(fù)制都正常?？赡茉趶?fù)制都正常。可能在DNA 的損傷修復(fù)中該酶起到一定的作用。的損傷修復(fù)中該酶起到一定的作用。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶 這 是 1 9 5 6 年 由 A r t h u r Kornberg首先發(fā)現(xiàn)的DNA聚合 酶，又稱Kornberg酶。此酶研 究得清楚而且代表了其他DNA 聚合酶的基本特

14、點。 DNA Pol在空間結(jié)構(gòu)上近似球體，直徑約6.5 nm。 在酶的縱軸上有一個約20A的深溝(cleft)，帶有正電 荷，這是該酶的活性中心位置，在此位置上至少有6 個結(jié)合位點: 1 模板DNA結(jié)合位點; 2 DNA生長鏈 或引物結(jié)合位點; 3 引物末端結(jié)合位點，用以專一引 物或DNA生長鏈的3-OH; 4 脫氧核苷三磷酸結(jié)合位 點; 5 53外切酶活性位點，用以結(jié)合生長鏈前方 的5-端脫氧核苷酸并切除之; 6 35外切酶活性位 點，用以結(jié)合和切除生長鏈上未配對的 1聚合作用 在引物RNA3-OH末端，以dNTP為底物，按模板 DNA上的指令由DNA pol逐個將核苷酸加上去， 就是DNA

15、 pol的聚合作用。酶的專一性主要表現(xiàn) 為新進入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時才有 催化作用。dNTP進入結(jié)合位點后，可能使酶的構(gòu)象 發(fā)生變化，促進3-OH與5-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵 。若是錯誤的核苷酸進入結(jié)合位點，則不能與模板 配對，無法改變酶的構(gòu)象而被3-5外切酶活性位點 所識別并切除之。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 235外切酶活性校對作用 這種酶活性的主要功能是從35方向識別和切除 不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 353外切酶活性切除修復(fù)作用 從53方向水解D

16、NA生長鏈前方的DNA鏈，主 要產(chǎn)生5-脫氧核苷酸。這種酶活性只對DNA上配對 部分(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用。每次能切除 10個核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激53外切 酶活力達(dá)10倍以上。因此，這種酶活性在DNA損傷 的修復(fù)中可能起著重要作用。對岡崎片段5末端DNA 引物的去除依賴此種外切酶活性。 4焦磷酸解作用 DNA pol 的這種活性可以催化3末端焦磷酸解 DNA分子。這種作用就是無機焦磷酸分解DNA生 長鏈，可以認(rèn)為是DNA聚合作用的逆反應(yīng)，而且這 種水解DNA鏈作用需要有模板DNA的存在。 (dNMP)n+XPPi (dNMP)n-x+X(dNPPP)DNA 5焦磷酸交換

17、作用 催化dNTP末端的PPi同無機焦磷酸的交換反應(yīng)。反 應(yīng)式為32P32Pi+dNPPPdNP32P32P+PPiDNA （4、5兩種作用，都要求有較高濃度的PPi，因此 ，在體內(nèi)由于沒有足夠高的PPi而無重要意義。 ） DNA pol的DNA聚合酶活性和53外切酶活 性協(xié)同作用，可以使DNA鏈上的切口向前推進 ，即沒有新的DNA合成，只有核苷酸的交換。 這種反應(yīng)叫缺口平移(Nick translation)。當(dāng)雙鏈 DNA上某個磷酸二酯鍵斷裂產(chǎn)生切口時，DNA pol I能從切口開始合成新的NDA鏈，同時切 除原來的舊鏈。這樣，從切口開始合成了一條 與被取代的舊鏈完全相同的新鏈。如果新?lián)饺?/p>

18、 的脫氧核苷酸三磷酸為-32P-dNTP，則重新合成 的新鏈即為帶有同位素標(biāo)記的DNA分子，可以 用作探針進行分子雜交實驗。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶 全酶的結(jié)構(gòu)和功能全酶的結(jié)構(gòu)和功能 延長因子延長因子 DNADNA聚合酶聚合酶 兩個兩個 亞基夾住亞基夾住DNADNA DNADNA聚合酶聚合酶異二聚體異二聚體 核心酶核心酶 校對校對 引物的結(jié)引物的結(jié) 合和識別合和識別 促使核心促使核心 酶二聚化酶二聚化 連連 接接 酶酶 連連 接接 切切 口口 Mg2+ 連接酶連接酶 ATP或或NAD AMP+PPi或或NMN+

19、AMP A TC G P TT PPP A A CCT GA P AC PPPP OH TG G A TC G P TT PPP A A CCT GA P AC PPP TG G P 缺口 3 35 5 5 53 3 模板鏈模板鏈 模板鏈模板鏈 DNA連接酶利用NAD或ATP 中的能量催化兩個核酸鏈之 間形成磷酸二酯鍵。 (1)NAD(1)NAD+ +或或ATPATP將其腺苷酰基轉(zhuǎn)移將其腺苷?；D(zhuǎn)移 到到DNADNA連接酶的一個賴氨酸殘基連接酶的一個賴氨酸殘基 的的氨基上形成共價的酶氨基上形成共價的酶- -腺腺 苷酸中間物，同時釋放出煙酰胺苷酸中間物，同時釋放出煙酰胺 單核苷酸單核苷酸(NMN

20、)(NMN)或焦磷酸。或焦磷酸。 (2)(2)將酶將酶- -腺苷酸中間物上的腺苷腺苷酸中間物上的腺苷 ?；俎D(zhuǎn)移到?；俎D(zhuǎn)移到DNADNA的的5-5-磷酸基端磷酸基端 ，形成一個焦磷酰衍生物，即，形成一個焦磷酰衍生物，即 DNA-DNA-腺苷酸腺苷酸; ; (3)(3)這個被激活的這個被激活的5-5-磷?；丝闪柞；丝?以和以和DNADNA的的3-OH3-OH端反應(yīng)合成磷酸端反應(yīng)合成磷酸 二酯鍵，同時釋放出二酯鍵，同時釋放出AMPAMP。 環(huán)狀環(huán)狀 DNA復(fù)制時復(fù)制時 所形成的所形成的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 起始點起始點 復(fù)制叉的推進復(fù)制叉的推進 復(fù)制叉復(fù)制叉 起始點起始點 起始點起始點 起始點起始點 復(fù)

21、制叉復(fù)制叉 復(fù)制叉復(fù)制叉 未復(fù)制未復(fù)制DNA 單向復(fù)制單向復(fù)制 雙向復(fù)制雙向復(fù)制 DNA的的雙向和單向復(fù)制雙向和單向復(fù)制 定點起始，復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的（等速進行或定點起始，復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的（等速進行或 異速進行），形成兩個復(fù)制叉，少數(shù)是單向復(fù)制，異速進行），形成兩個復(fù)制叉，少數(shù)是單向復(fù)制， 形成一個復(fù)制叉。形成一個復(fù)制叉。 復(fù)制方向復(fù)制方向 用放射自顯影實驗判斷DNA的復(fù)制方向及速度 DNA的幾種復(fù)制方式的幾種復(fù)制方式 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 DNA的幾種復(fù)制方式的幾種復(fù)制方式 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系

22、范樹國范樹國 親代雙鏈（或單鏈）親代雙鏈（或單鏈）DNADNA的一條鏈在的一條鏈在DNADNA復(fù)制復(fù)制 起點處被切開，其起點處被切開，其55端游離出來。端游離出來。DNADNA聚合聚合 酶酶便可以將脫氧核糖核苷酸聚合在便可以將脫氧核糖核苷酸聚合在3-OH3-OH 端。當(dāng)復(fù)制向前進行時，親代端。當(dāng)復(fù)制向前進行時，親代DNADNA上被切斷上被切斷 的的55端繼續(xù)游離下來，并且很快被單鏈結(jié)合端繼續(xù)游離下來，并且很快被單鏈結(jié)合 蛋白所結(jié)合。因為蛋白所結(jié)合。因為55端從環(huán)上向下解鏈的同端從環(huán)上向下解鏈的同 時伴有環(huán)狀雙鏈時伴有環(huán)狀雙鏈DNADNA環(huán)繞其軸不斷的旋轉(zhuǎn)，環(huán)繞其軸不斷的旋轉(zhuǎn)， 而且以而且以3-

23、OH3-OH端為引物的端為引物的DNADNA生長鏈則不斷地生長鏈則不斷地 以另一條環(huán)狀以另一條環(huán)狀DNADNA鏈為模板向前延伸，因而鏈為模板向前延伸，因而 稱為滾環(huán)稱為滾環(huán)(Rolling circle)復(fù)制。復(fù)制。 在這種復(fù)制方式中，在這種復(fù)制方式中，DNA的延伸可以一直進行的延伸可以一直進行 下去，產(chǎn)生的下去，產(chǎn)生的DNA鏈可以是親代鏈可以是親代DNA單位長度單位長度 的許多倍。這么長的的許多倍。這么長的DNA鏈?zhǔn)侨绾无D(zhuǎn)變?yōu)閱挝绘準(zhǔn)侨绾无D(zhuǎn)變?yōu)閱挝?長度的長度的DNA分子的，目前尚不清楚。可能是由分子的，目前尚不清楚?？赡苁怯?特異的內(nèi)切酶切開產(chǎn)生單位長度的子代特異的內(nèi)切酶切開產(chǎn)生單位長度的

24、子代DNA。 這些這些DNA可自身環(huán)繞，或保持線性分子狀態(tài)?？勺陨憝h(huán)繞，或保持線性分子狀態(tài)。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 雙鏈環(huán)在固定點解開進行復(fù)制，但兩條鏈的雙鏈環(huán)在固定點解開進行復(fù)制，但兩條鏈的 合成是高度不對稱的，一條鏈先復(fù)制，另一合成是高度不對稱的，一條鏈先復(fù)制，另一 條鏈保持單鏈而被取代，在電鏡下可以看到條鏈保持單鏈而被取代，在電鏡下可以看到 呈呈D D環(huán)形狀。待一條鏈復(fù)制到一定程度，露環(huán)形狀。待一條鏈復(fù)制到一定程度，露 出另一鏈的復(fù)制起點，另一條鏈才開始復(fù)制出另一鏈的復(fù)制起點，另一條鏈才開始復(fù)制 。這表明復(fù)制起點是以一條鏈為摸板起始合。這

25、表明復(fù)制起點是以一條鏈為摸板起始合 成成DNADNA的一段序列；兩條鏈的起點并不總在的一段序列；兩條鏈的起點并不總在 同一點上，當(dāng)兩條鏈的起點分開一定距離時同一點上，當(dāng)兩條鏈的起點分開一定距離時 就產(chǎn)生就產(chǎn)生D D環(huán)（環(huán)（D-loopD-loop）復(fù)制。）復(fù)制。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 多復(fù)制叉復(fù)制多復(fù)制叉復(fù)制 第一輪復(fù)制尚未完成，復(fù)制起點就開始第二第一輪復(fù)制尚未完成，復(fù)制起點就開始第二 輪的復(fù)制。輪的復(fù)制。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 不需要不需要RNA引物的引物的DNA復(fù)制復(fù)制 有些病毒的基因組是線

26、性有些病毒的基因組是線性DNADNA，在原核細(xì)胞和真核，在原核細(xì)胞和真核 細(xì)胞中復(fù)制時不需要細(xì)胞中復(fù)制時不需要RNARNA引物。目前了解最清楚的引物。目前了解最清楚的 是腺病毒是腺病毒DNADNA和枯草桿菌噬菌體和枯草桿菌噬菌體29DNA29DNA的復(fù)制。的復(fù)制。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 在這些在這些DNADNA復(fù)制時，從一端開始，只能利用一條復(fù)制時，從一端開始，只能利用一條DNADNA鏈作為模鏈作為模 板，即以板，即以3535鏈為模板。這樣，新合成的鏈為模板。這樣，新合成的DNADNA鏈便將原來的鏈便將原來的 親代親代DNADNA鏈取代子鏈。原

27、來的親代鏈取代子鏈。原來的親代DNADNA鏈鏈( (從合成起始端看是從合成起始端看是 5353鏈鏈) )作為單鏈從雙螺旋中釋放出來。這條鏈自身的作為單鏈從雙螺旋中釋放出來。這條鏈自身的55和和 33可以互補配對，然后在可以互補配對，然后在33端開始以此鏈為模板重新合成另端開始以此鏈為模板重新合成另 一條子鏈。這樣，一條子鏈。這樣，DNADNA復(fù)制即完成。產(chǎn)生兩個與親代復(fù)制即完成。產(chǎn)生兩個與親代DNADNA完成完成 一樣的子代一樣的子代DNADNA。 DNA聚合酶不能從頭開始合成聚合酶不能從頭開始合成DNA鏈，需要有引物鏈，需要有引物 才能聚合核苷酸生成才能聚合核苷酸生成DNA鏈。那么，腺病毒和

28、鏈。那么，腺病毒和 29DNA等沒有等沒有RNA引物是怎樣啟動其引物是怎樣啟動其DNA復(fù)制的復(fù)制的 呢呢?研究發(fā)現(xiàn)，所有的腺病毒研究發(fā)現(xiàn)，所有的腺病毒DNA生長鏈上都有一生長鏈上都有一 個特異的蛋白質(zhì)分子附著在其個特異的蛋白質(zhì)分子附著在其5末端的胞嘧啶核苷末端的胞嘧啶核苷 酸上。在酸上。在DNA復(fù)制開始之前，該末端蛋白質(zhì)通過共復(fù)制開始之前，該末端蛋白質(zhì)通過共 價鍵與價鍵與dCMP的的5磷酸基相連。胞嘧啶通過堿基配磷酸基相連。胞嘧啶通過堿基配 對與腺病毒對與腺病毒DNA模板模板3末端的鳥嘌呤核苷酸配對結(jié)末端的鳥嘌呤核苷酸配對結(jié) 合，然后由病毒本身編碼的合，然后由病毒本身編碼的DNA聚合酶以此末端

29、蛋聚合酶以此末端蛋 白白-dCMP復(fù)合物為引物連續(xù)合成腺病毒整個基因組復(fù)合物為引物連續(xù)合成腺病毒整個基因組 的的36000個核苷酸，在個核苷酸，在DNA復(fù)制過程中，由于復(fù)制過程中，由于DNA 鏈被置換而產(chǎn)生了扭曲張力鏈被置換而產(chǎn)生了扭曲張力(torsional strain)，但細(xì)，但細(xì) 胞內(nèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶胞內(nèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶可以消除張力。病毒自身編碼的可以消除張力。病毒自身編碼的 72KD的單鏈結(jié)合蛋白可能也同時具有螺旋酶的功的單鏈結(jié)合蛋白可能也同時具有螺旋酶的功 能促進能促進DNA雙鏈的解開。雙鏈的解開。 DNA的復(fù)制是在起始階段進行控制的，一旦復(fù)制起的復(fù)制是在起始階段進行控制的，一旦復(fù)制起 始，它

30、就會繼續(xù)下去直到整個始，它就會繼續(xù)下去直到整個復(fù)制子復(fù)制子完成復(fù)制。完成復(fù)制。 復(fù)制起點復(fù)制起點是以一條鏈為模板起始是以一條鏈為模板起始DNA合成的一段序合成的一段序 列。有時，兩條鏈的復(fù)制起點并不總是在同一點上列。有時，兩條鏈的復(fù)制起點并不總是在同一點上 （如（如D環(huán)復(fù)制）。環(huán)復(fù)制）。 在一個完整的細(xì)胞周期中，每一個復(fù)制起點只使用在一個完整的細(xì)胞周期中，每一個復(fù)制起點只使用 一次，完成一次復(fù)制過程。一次，完成一次復(fù)制過程。 多數(shù)生物的復(fù)制起點，都是多數(shù)生物的復(fù)制起點，都是DNA呼吸作用強烈（甲呼吸作用強烈（甲 醛變性實驗）的區(qū)段，即經(jīng)常開放的區(qū)段，富含醛變性實驗）的區(qū)段，即經(jīng)常開放的區(qū)段，富

31、含A T。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 復(fù)制子復(fù)制子(Replicon)：Genome能獨立進行復(fù)制的單位，每能獨立進行復(fù)制的單位，每 個復(fù)制子都含有一個復(fù)制起點。個復(fù)制子都含有一個復(fù)制起點。 原核生物的染色體和質(zhì)粒、真核生物的細(xì)胞器原核生物的染色體和質(zhì)粒、真核生物的細(xì)胞器DNA都是都是 環(huán)狀雙鏈分子，它們都是單復(fù)制子，都在一個固定的起環(huán)狀雙鏈分子，它們都是單復(fù)制子，都在一個固定的起 點開始復(fù)制，復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的，少數(shù)是單向復(fù)點開始復(fù)制，復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的，少數(shù)是單向復(fù) 制。多數(shù)是對稱復(fù)制，少數(shù)是不對稱復(fù)制（一條鏈復(fù)制制。多數(shù)是對稱復(fù)制，少

32、數(shù)是不對稱復(fù)制（一條鏈復(fù)制 后才進行另一條鏈的復(fù)制）。后才進行另一條鏈的復(fù)制）。 環(huán)狀環(huán)狀DNA的復(fù)制眼象的復(fù)制眼象，稱，稱形復(fù)制。形復(fù)制。 真核生物的染色體真核生物的染色體DNA是線形雙鏈分子，含有許多復(fù)制是線形雙鏈分子，含有許多復(fù)制 起點，因此是多復(fù)制子，每個復(fù)制子約有起點，因此是多復(fù)制子，每個復(fù)制子約有100-200Kbp。 人體細(xì)胞平均每個染色體含有人體細(xì)胞平均每個染色體含有1000個復(fù)制子。個復(fù)制子。 病毒病毒DNA多種多樣，環(huán)狀或線形，雙鏈或單鏈，但都是多種多樣，環(huán)狀或線形，雙鏈或單鏈，但都是 單復(fù)制子。單復(fù)制子。 用遺傳學(xué)和生物化學(xué)的方法可以確定大腸桿菌染色體用遺傳學(xué)和生物化學(xué)的

33、方法可以確定大腸桿菌染色體DNADNA的復(fù)制的復(fù)制 起點起點oriCoriC在基因圖譜上的位置。在一個生長的群體中幾乎所有的在基因圖譜上的位置。在一個生長的群體中幾乎所有的 染色體都在復(fù)制過程中，因此離復(fù)制起點越近的基因出現(xiàn)頻率越染色體都在復(fù)制過程中，因此離復(fù)制起點越近的基因出現(xiàn)頻率越 高，越遠(yuǎn)的基因出現(xiàn)頻率越低。將大腸桿菌提取出來的高，越遠(yuǎn)的基因出現(xiàn)頻率越低。將大腸桿菌提取出來的DNADNA切成切成 大約大約1 1染色體長度的片段，通過分子雜交的方法測定各基因片染色體長度的片段，通過分子雜交的方法測定各基因片 段的頻率，結(jié)果表明段的頻率，結(jié)果表明oriCoriC位于基因圖譜的位于基因圖譜的i

34、lvilv位點處。一旦復(fù)制位點處。一旦復(fù)制 開始以后，復(fù)制叉向兩側(cè)以相等速度向前移動，兩個復(fù)制又在起開始以后，復(fù)制叉向兩側(cè)以相等速度向前移動，兩個復(fù)制又在起 點點180180的的trptrp位點處位點處(33(33分附近分附近) )相會合。相會合。 大腸桿菌復(fù)制起點成串排列的重復(fù)序列大腸桿菌復(fù)制起點成串排列的重復(fù)序列 GATCTNTTNTTT 成串排列的成串排列的 三個三個13 bp序序 列列 共有序列共有序列共有序列共有序列 TTATCCACA DnaA蛋白結(jié)合位點蛋白結(jié)合位點 四個四個9 bp序列序列 DnaADnaB (解螺旋酶解螺旋酶) SSB 大腸桿菌大腸桿菌DNA復(fù)制起點在起始階段

35、的結(jié)構(gòu)模型復(fù)制起點在起始階段的結(jié)構(gòu)模型 原核細(xì)胞DNA 的半不連續(xù)復(fù) 制復(fù)制過程 復(fù)制叉的復(fù)制叉的 移動方向移動方向 解旋酶解旋酶 DNA聚聚 合酶合酶III 解鏈酶解鏈酶 RNA引物引物 引物體引物體 DNA聚聚 合酶合酶I SSB 3 3 5 前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈 隨后鏈隨后鏈 3 5 復(fù)制的復(fù)制的起始起始（引發(fā)）（引發(fā)） DNADNA鏈的鏈的延長延長 DNADNA鏈鏈終止終止 5 RNA引物引物 3 3 DNA復(fù)制 動畫1、2 DNADNA新生鏈的合成由新生鏈的合成由DNADNA聚合酶聚合酶所催化，然而，所催化，然而，DNADNA必須由螺必須由螺 旋酶在復(fù)制叉處邊移動邊解開雙鏈。這樣就產(chǎn)生了一種

36、拓?fù)鋵W(xué)旋酶在復(fù)制叉處邊移動邊解開雙鏈。這樣就產(chǎn)生了一種拓?fù)鋵W(xué) 上的問題上的問題: :由于由于DNADNA的解鏈，在的解鏈，在DNADNA雙鏈區(qū)勢必產(chǎn)生正超螺旋，雙鏈區(qū)勢必產(chǎn)生正超螺旋， 在環(huán)狀在環(huán)狀DNADNA中更為明顯，當(dāng)達(dá)到一定程度后就會造成復(fù)制叉難中更為明顯，當(dāng)達(dá)到一定程度后就會造成復(fù)制叉難 再繼續(xù)前進，從而終止再繼續(xù)前進，從而終止DNADNA復(fù)制。有兩種機制可以防止這種現(xiàn)復(fù)制。有兩種機制可以防止這種現(xiàn) 象發(fā)生象發(fā)生:1 DNA:1 DNA在生物細(xì)胞中本身就是超螺旋，當(dāng)在生物細(xì)胞中本身就是超螺旋，當(dāng)DNADNA解鏈而解鏈而 產(chǎn)生正超螺旋時，可以被原來存在的負(fù)超螺旋所中和產(chǎn)生正超螺旋時，可

37、以被原來存在的負(fù)超螺旋所中和;2 DNA;2 DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶可以打開一條鏈，使正超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變成松弛狀可以打開一條鏈，使正超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變成松弛狀 態(tài)，而態(tài)，而DNADNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶(旋轉(zhuǎn)酶旋轉(zhuǎn)酶) )可以在可以在DNADNA解鏈前方不停地繼解鏈前方不停地繼 續(xù)將負(fù)超螺旋引入雙鏈續(xù)將負(fù)超螺旋引入雙鏈DNADNA。 在在DNA復(fù)制叉處要能由兩套復(fù)制叉處要能由兩套DNA聚合酶聚合酶在同一時在同一時 間分別進行復(fù)制間分別進行復(fù)制DNA前導(dǎo)鏈和滯后鏈。如果滯后鏈前導(dǎo)鏈和滯后鏈。如果滯后鏈 模板環(huán)繞模板環(huán)繞DNA聚合酶聚合酶全酶，并通過全酶，并通過DNA聚合酶聚合酶 ，然后再折向與

38、未解鏈的雙鏈，然后再折向與未解鏈的雙鏈DNA在同一方向上，在同一方向上， 則則滯后鏈的合成可以和前導(dǎo)鏈的合成在同一方向上滯后鏈的合成可以和前導(dǎo)鏈的合成在同一方向上 進行進行。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 這樣，當(dāng)這樣，當(dāng)DNA聚合酶聚合酶沿著滯后鏈模板移動時，沿著滯后鏈模板移動時， 由特異的引物酶催化合成的由特異的引物酶催化合成的RNA引物即可以由引物即可以由 DNA聚合酶聚合酶所延伸。當(dāng)合成的所延伸。當(dāng)合成的DNA鏈到達(dá)前一鏈到達(dá)前一 次合成的岡崎片段的位置時，滯后鏈模板及剛合次合成的岡崎片段的位置時，滯后鏈模板及剛合 成的岡崎片斷便從成的岡崎片斷

39、便從DNA聚合酶聚合酶上釋放出來。這上釋放出來。這 時，由于復(fù)制叉繼續(xù)向前運動，便產(chǎn)生了又一段時，由于復(fù)制叉繼續(xù)向前運動，便產(chǎn)生了又一段 單鏈的滯后鏈模板，它重新環(huán)繞單鏈的滯后鏈模板，它重新環(huán)繞DNA聚合酶聚合酶全全 酶，并通過酶，并通過DNA聚合酶聚合酶開始合成新的滯后鏈岡開始合成新的滯后鏈岡 崎片段。通過這樣的機制，前導(dǎo)鏈的合成不會超崎片段。通過這樣的機制，前導(dǎo)鏈的合成不會超 過滯后鏈太多過滯后鏈太多(最后只有一個岡崎片段的長度最后只有一個岡崎片段的長度)。而。而 且，這樣引發(fā)體在且，這樣引發(fā)體在DNA鏈上和鏈上和DNA聚合酶聚合酶以同以同 一速度移動。一速度移動。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命

40、科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 按上述按上述DNA復(fù)制的機制，在復(fù)制叉附近，形成了以復(fù)制的機制，在復(fù)制叉附近，形成了以 兩套兩套DNA聚合酶聚合酶全酶分子、引發(fā)體和螺旋構(gòu)成的全酶分子、引發(fā)體和螺旋構(gòu)成的 類似核糖體大小的復(fù)合體，稱為類似核糖體大小的復(fù)合體，稱為DNA復(fù)制體復(fù)制體 (replisome)。復(fù)制體在。復(fù)制體在DNA前導(dǎo)鏈模板和滯后鏈模前導(dǎo)鏈模板和滯后鏈模 板上移動時便合成了連續(xù)的板上移動時便合成了連續(xù)的DNA前導(dǎo)鏈和由許多岡前導(dǎo)鏈和由許多岡 崎片段組成的滯后鏈。在崎片段組成的滯后鏈。在DNA合成延伸過程中主要合成延伸過程中主要 是是DNA聚合酶聚合酶的作用。當(dāng)岡崎

41、片段形成后，的作用。當(dāng)岡崎片段形成后，DNA 聚合酶聚合酶通過其通過其53外切酶活性切除岡崎片段上外切酶活性切除岡崎片段上 的的RNA引物，同時，利用后一個岡崎片段作為引物引物，同時，利用后一個岡崎片段作為引物 由由53合成合成DNA。最后兩個岡崎片段由。最后兩個岡崎片段由DNA連接連接 酶將其接起來，形成完整的酶將其接起來，形成完整的DNA滯后鏈。滯后鏈。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 復(fù)制的引發(fā)復(fù)制的引發(fā)(Priming)階段包括階段包括DNA復(fù)制起點雙鏈復(fù)制起點雙鏈 解開，通過轉(zhuǎn)錄激活步驟合成解開，通過轉(zhuǎn)錄激活步驟合成RNA分子，分子，RNA引引

42、 物的合成，物的合成，DNA聚合酶將第一個脫氧核苷酸加到聚合酶將第一個脫氧核苷酸加到 引物引物RNA的的3-OH末端復(fù)制引發(fā)的關(guān)鍵步驟就是末端復(fù)制引發(fā)的關(guān)鍵步驟就是 前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈DNA的合成，一旦前導(dǎo)鏈的合成，一旦前導(dǎo)鏈DNA的聚合作用的聚合作用 開始，滯后鏈上的開始，滯后鏈上的DNA合成也隨著開始。合成也隨著開始。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 DNADNA復(fù)制開始時，復(fù)制開始時，DNADNA螺旋酶首螺旋酶首 先在復(fù)制起點處將雙鏈先在復(fù)制起點處將雙鏈DNADNA解解 開，然后單鏈開，然后單鏈DNADNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì) 結(jié)合在被解開的鏈上。由復(fù)制

43、結(jié)合在被解開的鏈上。由復(fù)制 因子因子X(nX(n蛋白蛋白) )，復(fù)制因子，復(fù)制因子Y(nY(n 蛋白蛋白) )，nn蛋白，蛋白，i i蛋白，蛋白，dnaBdnaB 蛋白和蛋白和dnaCdnaC蛋白等蛋白等6 6種蛋白質(zhì)種蛋白質(zhì) 組成的引發(fā)前體組成的引發(fā)前體 (preprimosome)(preprimosome)，在單鏈，在單鏈DNADNA 結(jié)合蛋白的作用下與單鏈結(jié)合蛋白的作用下與單鏈DNADNA 結(jié)合生成中間物，這是一種前結(jié)合生成中間物，這是一種前 引發(fā)過程。引發(fā)前體進一步與引發(fā)過程。引發(fā)前體進一步與 引物酶引物酶(primase)(primase)組裝成引發(fā)組裝成引發(fā) 體體(primoso

44、me)(primosome)。引發(fā)體可以。引發(fā)體可以 在單鏈在單鏈DNADNA上移動，在上移動，在dnaBdnaB亞亞 基的作用下識別基的作用下識別DNADNA復(fù)制起點復(fù)制起點 位置。位置。 首先在前導(dǎo)鏈上由引物酶催化合成一段首先在前導(dǎo)鏈上由引物酶催化合成一段RNARNA引物，引物， 然后，引發(fā)體在滯后鏈上沿然后，引發(fā)體在滯后鏈上沿5353方向不停的移方向不停的移 動動( (這是一種相對移動，也可能是滯后鏈模板在移這是一種相對移動，也可能是滯后鏈模板在移 動動) )，在一定距離上反復(fù)合成，在一定距離上反復(fù)合成RNARNA引物供引物供DNADNA聚合酶聚合酶 合成岡崎片段使用，引發(fā)體中許多蛋白因

45、子的合成岡崎片段使用，引發(fā)體中許多蛋白因子的 功能尚不清楚。但是，這些成份必須協(xié)同工作才功能尚不清楚。但是，這些成份必須協(xié)同工作才 能使引發(fā)體在滯后鏈上移動，識別合適的引物合能使引發(fā)體在滯后鏈上移動，識別合適的引物合 成位置，并將核苷酸在引發(fā)位置上聚合成成位置，并將核苷酸在引發(fā)位置上聚合成RNARNA引物引物 。由于引發(fā)體在滯后鏈模板上的移動方向與其合。由于引發(fā)體在滯后鏈模板上的移動方向與其合 成引物的方向相反，所以在滯后鏈上所合成的成引物的方向相反，所以在滯后鏈上所合成的RNARNA 引物非常短，一般只有引物非常短，一般只有3-53-5個核苷酸長。而且，在個核苷酸長。而且，在 同一種生物體細(xì)

46、胞中這些引物都具有相似的序列同一種生物體細(xì)胞中這些引物都具有相似的序列 ，表明引物酶要在，表明引物酶要在DNADNA滯后鏈模板上比較特定的位滯后鏈模板上比較特定的位 置置( (序列序列) )上才能合成上才能合成RNARNA引物。引物。 為什么需要有為什么需要有RNA引物來引發(fā)引物來引發(fā)DNA復(fù)制呢復(fù)制呢?這可這可 能盡量減少能盡量減少DNA復(fù)制起始處的突變有關(guān)。復(fù)制起始處的突變有關(guān)。DNA復(fù)復(fù) 制開始處的幾個核苷酸最容易出現(xiàn)差錯，因此，制開始處的幾個核苷酸最容易出現(xiàn)差錯，因此， 用用RNA引物即使出現(xiàn)差錯最后也要被引物即使出現(xiàn)差錯最后也要被DNA聚合酶聚合酶 切除，提高了切除，提高了DNA復(fù)制

47、的準(zhǔn)確性。復(fù)制的準(zhǔn)確性。RNA引物形引物形 成后，由成后，由DNA聚合酶聚合酶催化將第一個脫氧核苷酸催化將第一個脫氧核苷酸 按堿基互補原則加在按堿基互補原則加在RNA引物引物3-OH端而進入端而進入 DNA鏈的延伸階段。鏈的延伸階段。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 聚合酶聚合酶III 核心酶核心酶 大腸桿菌復(fù)制大腸桿菌復(fù)制 體結(jié)構(gòu)示意圖體結(jié)構(gòu)示意圖 聚合酶聚合酶I 聚合酶聚合酶III 核心酶核心酶 滯后鏈滯后鏈 前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈 解螺旋酶解螺旋酶 引物合成酶引物合成酶 RNA引物引物 引發(fā)體引發(fā)體 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶II -夾子夾子 -聚體聚體 -夾子夾

48、子 -復(fù)合物復(fù)合物 RNA引物引物 單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白 （SSB） 大腸桿菌染色體復(fù)制的終止大腸桿菌染色體復(fù)制的終止 oric 復(fù)制叉復(fù)制叉2 復(fù)制叉復(fù)制叉1 終止復(fù)制叉終止復(fù)制叉2終止復(fù)制叉終止復(fù)制叉1 復(fù)制叉復(fù)制叉1 復(fù)制叉復(fù)制叉2 完成復(fù)制完成復(fù)制 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 連鎖染色體連鎖染色體 復(fù)制叉處前導(dǎo)鏈和隨后鏈同時合成的工作模型復(fù)制叉處前導(dǎo)鏈和隨后鏈同時合成的工作模型 聚合酶聚合酶III 全酶全酶 引物引物 聚合酶聚合酶III 全酶全酶 引物引物 引物體引物體 引物體引物體 解旋酶解旋酶 解旋酶解旋酶 DNA復(fù)制過程是一個高度精確的過程，據(jù)估復(fù)制過程是一個高度精確的過程，

49、據(jù)估 計，大腸桿菌計，大腸桿菌DNA復(fù)制復(fù)制5 109堿基對僅出現(xiàn)一個誤堿基對僅出現(xiàn)一個誤 差，保證復(fù)制忠實性的原因主要有以下三點差，保證復(fù)制忠實性的原因主要有以下三點: DNA聚合酶的高度專一性（嚴(yán)格遵循堿基聚合酶的高度專一性（嚴(yán)格遵循堿基 配對原則，但錯配率為配對原則，但錯配率為10-410-5） DNA聚合酶的校對功能聚合酶的校對功能（錯配堿基被（錯配堿基被3 -5 外切酶切除）外切酶切除） 起始時以起始時以RNA作為引物作為引物 DNA聚合酶的校對功能聚合酶的校對功能 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 DNA聚合酶的校對功能聚合酶的校對功能 聚合酶

50、聚合酶 錯配鹼基錯配鹼基 復(fù)制方向復(fù)制方向 正正 確確 核苷酸核苷酸 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 切除錯配切除錯配 核苷酸核苷酸 起始時以起始時以RNARNA作為引物的作用作為引物的作用 DNADNA復(fù)制為什么要合成一個復(fù)制為什么要合成一個RNARNA引物，而后又把這引物，而后又把這 個引物消除呢？這是保證個引物消除呢？這是保證DNADNA聚合過程高度精確的又一措施。聚合過程高度精確的又一措施。 已知已知DNA DNA 聚合酶具有聚合酶具有3 35 5外切酶功能校對復(fù)制過程中外切酶功能校對復(fù)制過程中 的核苷酸的核苷酸，也就是說聚合酶在開始形成一個新的磷酸二酯，也就是說聚合酶

51、在開始形成一個新的磷酸二酯 鍵前，總是檢查前一個堿基是否正確，這就決定了它不能鍵前，總是檢查前一個堿基是否正確，這就決定了它不能 從頭開始合成。因此先合成一條低忠實性的多核苷酸來開從頭開始合成。因此先合成一條低忠實性的多核苷酸來開 始始DNADNA的合成，并以核糖核苷酸來表示是的合成，并以核糖核苷酸來表示是“暫時暫時”的，當(dāng)?shù)模?dāng) DNADNA開始聚合以后再以開始聚合以后再以5 53 3外切酶的功能切除，以高忠外切酶的功能切除，以高忠 實性的脫氧核苷酸取而代之，確保復(fù)制的忠實性。實性的脫氧核苷酸取而代之，確保復(fù)制的忠實性。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國

52、 真核細(xì)胞真核細(xì)胞DNA復(fù)制的特點復(fù)制的特點 多個起點復(fù)制多個起點復(fù)制 起起 點點 起起 點點 起起 點點 起起 點點 起起 點點 起起 點點 真核生物的真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶 端粒（端粒（telemeretelemere）復(fù)制）復(fù)制 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶 DNA 聚合酶聚合酶 分子量分子量 亞基數(shù)亞基數(shù) 細(xì)胞內(nèi)分布細(xì)胞內(nèi)分布 酶活力百分比酶活力百分比 外切酶活力外切酶活力 DNA 聚合酶聚合酶 110-23，000 多個多個 細(xì)胞核細(xì)胞核 80% 無無 120，000 一個一個 細(xì)胞核和線粒體細(xì)胞核和線粒體 2 % 15% 無無- 400，000 一個一個 細(xì)胞

53、核細(xì)胞核+ 10 % 25% 5-3 外切外切 酶酶 DNA 聚合酶聚合酶 DNA 聚合酶聚合酶 45，000 一個一個 細(xì)胞核細(xì)胞核 10 % 15% 無無 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 端粒酶（端粒酶（telomerase） DNA復(fù)制需要引物，但在線形復(fù)制需要引物，但在線形DNA分子末端不可能分子末端不可能 通過正常的機制在引物被降解后合成相應(yīng)的片段通過正常的機制在引物被降解后合成相應(yīng)的片段.如果沒如果沒 有特殊的機制合成末端序列，染色體就會在細(xì)胞傳代中有特殊的機制合成末端序列，染色體就會在細(xì)胞傳代中 變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得

54、到了變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得到了 澄清，澄清，端粒酶端粒酶是一種含是一種含RNA的蛋白復(fù)合物，實質(zhì)上是一的蛋白復(fù)合物，實質(zhì)上是一 種逆轉(zhuǎn)錄酶，它能催化互補于種逆轉(zhuǎn)錄酶，它能催化互補于RNA模板的模板的DNA片段的合片段的合 成，使復(fù)制以后的線形成，使復(fù)制以后的線形DNA分子的末端保持不變。分子的末端保持不變。 初步研究表明，人體中生殖細(xì)胞的端初步研究表明，人體中生殖細(xì)胞的端 粒長度保持不變，而體細(xì)胞的端粒長度粒長度保持不變，而體細(xì)胞的端粒長度 則隨個體的老化而逐步縮短。對此的一則隨個體的老化而逐步縮短。對此的一 個推論是：人的生殖細(xì)胞具端粒酶的活個推論是：人的生殖細(xì)胞具端粒

55、酶的活 力，體細(xì)胞則否。這一問題的解決無疑力，體細(xì)胞則否。這一問題的解決無疑 會有助于對生命衰老的認(rèn)識會有助于對生命衰老的認(rèn)識。 5 3 AAAACCCCAAAACCC C C C A 端粒酶端粒酶 端粒合成的一種模型端粒合成的一種模型 3 5 TTTTGGGGTTTTG 5 3 AAAACCCCAAAACCC C C C A AA 3 5 TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG 5 3 AAAACCCCAAAACCC C C C A AA T T G G G T G G G T 3 5 AA TTTTG 5 3 AAAACCCCAAAACCC C C C A GTTTTG 整合和整合和

56、雜交雜交 移位和移位和 再雜交再雜交 端粒合成的完成端粒合成的完成 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGTTTT 5 3 n AA 3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT 5 3 T T CCCCT n AA3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT 5 3 T T AAAACCCC AAAACCCC AAAACCCCT n 進一步加工進一步加工 繼續(xù)繼續(xù) 延伸延伸 動畫動畫 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 真核和原核真核和原核DNA細(xì)胞復(fù)制比較細(xì)胞復(fù)制比較 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)

57、與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 第二節(jié) 某些物理化學(xué)因子，如紫外線、電離輻射和化學(xué)誘某些物理化學(xué)因子，如紫外線、電離輻射和化學(xué)誘 變劑等，都有引起生物突變和致死的作用，其機理是作變劑等，都有引起生物突變和致死的作用，其機理是作 用于用于DNA，造成，造成DNA結(jié)構(gòu)和功能的破壞，稱為結(jié)構(gòu)和功能的破壞，稱為DNA的損的損 傷傷。DNA的修復(fù)主要有以下類型的修復(fù)主要有以下類型: 暗修復(fù)暗修復(fù) 四、四、誘導(dǎo)修復(fù)誘導(dǎo)修復(fù)（SOS修復(fù)）修復(fù)） 一、一、回復(fù)修復(fù)回復(fù)修復(fù) 二二、切除修復(fù)切除修復(fù) 三、三、重組修復(fù)重組修復(fù) 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 DNA損傷的原因損傷

58、的原因 （一）（一）DNA分子的自發(fā)性損傷分子的自發(fā)性損傷 1、DNA復(fù)制中的錯誤 校正后的錯配率仍約在 10-10左右 。 2、DNA的自發(fā)性化學(xué)變化 堿基的異構(gòu)互變 DNA中的4種堿基各自的異 構(gòu)體間都可以自發(fā)地相互變化（例如烯醇式與 酮式堿基間的互變），這種變化就會使堿基配 對間的氫鍵改變，可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、 胸腺嘧啶能配上鳥嘌呤等，如果這些配對發(fā)生 在DNA復(fù)制時，就會造成子代DNA序列與親代 DNA不同的錯誤性損傷。 堿基的脫氨基作用:堿基的環(huán)外氨基有時會自發(fā) 脫落，從而胞嘧啶會變成尿嘧啶、腺嘌呤會變成次 黃嘌呤（H）、鳥嘌呤會變成黃嘌呤（X）等，遇 到復(fù)制時，U與A配對、H和

59、X都與C配對就會導(dǎo)致 子代DNA序列的錯誤變化。胞嘧啶自發(fā)脫氨基的 頻率約為每個細(xì)胞每天190個。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 脫嘌呤與脫嘧啶 自發(fā)的水解可使嘌呤和嘧啶從 DNA鏈的核糖磷酸骨架上脫落下來。一個哺乳類 細(xì)胞在37條件下，20 h內(nèi)DNA鏈上自發(fā)脫落的 嘌呤約1000個、嘧啶約500個；估計一個長壽命不 復(fù)制繁殖的哺乳類細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞）在整個生 活期間自發(fā)脫嘌呤數(shù)約為108，這占細(xì)胞DNA中總 嘌呤數(shù)約3%。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 堿基修飾與鏈斷裂 細(xì)胞呼吸的副產(chǎn)物O2-、H2O2 等

60、會造成DNA損傷，能產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲 基尿嘧啶等堿基修飾物，還可能引起DNA單鏈斷裂 等損傷，每個哺乳類細(xì)胞每天DNA單鏈斷裂發(fā)生的 頻率約為5萬次。此外，體內(nèi)還可以發(fā)生DNA的甲 基化，結(jié)構(gòu)的其他變化等，這些損傷的積累可能導(dǎo) 致老化。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹國范樹國 （二）物理因素引起的（二）物理因素引起的DNA損傷損傷 1、紫外線引起的DNA損傷 DNA分子損傷最早就是 從研究紫外線的效應(yīng)開始的。當(dāng)DNA受到最易被其 吸收波長（260 nm）的紫外線照射時，主要是使 同一條DNA鏈上相鄰的嘧啶以共價鍵連成二聚體， 相鄰的兩個T、或兩個C、或C