細(xì)菌分離與鑒定方課件

1、細(xì)菌分離與鑒定方課件 細(xì)菌分離與鑒定方法細(xì)菌分離與鑒定方法 嗜水氣單胞菌分離鑒定嗜水氣單胞菌分離鑒定 分離方法分離方法 細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況觀察 氧化酶試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn) AHM鑒別培養(yǎng)鑒別培養(yǎng) 吲哚試驗(yàn)吲哚試驗(yàn) 革蘭氏染色法革蘭氏染色法 糖發(fā)酵試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn) 脫脂奶平板試驗(yàn)（酪蛋白胨化試驗(yàn)）脫脂奶平板試驗(yàn)（酪蛋白胨化試驗(yàn)） 細(xì)菌分離與鑒定方課件 分離方法分離方法 用途用途: 在檢查含兩種或兩種以上的待檢材料（如肝、脾、腎、在檢查含兩種或兩種以上的待檢材料（如肝、脾、腎、 心、肌肉等）中的某種細(xì)菌時(shí)，須先將待檢材料進(jìn)行心、肌肉等）中的某種細(xì)菌時(shí)，須先將待檢材料進(jìn)行 分離培養(yǎng)。常用的分離

2、培養(yǎng)方法是瓊脂平皿分區(qū)劃線分離培養(yǎng)。常用的分離培養(yǎng)方法是瓊脂平皿分區(qū)劃線 法，是借劃線將混雜的細(xì)菌在瓊脂平皿表面分散開來，法，是借劃線將混雜的細(xì)菌在瓊脂平皿表面分散開來， 使個(gè)別的細(xì)菌能固定在某一點(diǎn)，經(jīng)培養(yǎng)生長(zhǎng)繁殖后形使個(gè)別的細(xì)菌能固定在某一點(diǎn)，經(jīng)培養(yǎng)生長(zhǎng)繁殖后形 成單個(gè)菌落，以達(dá)到分離獲得純種細(xì)菌的目的。成單個(gè)菌落，以達(dá)到分離獲得純種細(xì)菌的目的。 細(xì)菌分離與鑒定方課件 分離方法分離方法 具體操作方法如下：具體操作方法如下： 點(diǎn)燃酒精燈，右手執(zhí)筆式握持接種環(huán)（見圖點(diǎn)燃酒精燈，右手執(zhí)筆式握持接種環(huán)（見圖1），在酒精燈火焰上燒灼接種環(huán)，），在酒精燈火焰上燒灼接種環(huán)， 待冷，取待測(cè)菌液一環(huán)。待冷，取

3、待測(cè)菌液一環(huán)。 左手抓握瓊脂培養(yǎng)基平皿，用手掌將平皿的底固定，用手指將平皿的蓋略抬左手抓握瓊脂培養(yǎng)基平皿，用手掌將平皿的底固定，用手指將平皿的蓋略抬 起一些，進(jìn)行接種（見圖起一些，進(jìn)行接種（見圖2）。或者，將平皿的蓋留在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，盡量直立平）?；蛘撸瑢⑵矫蟮纳w留在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，盡量直立平 皿靠近酒精燈火焰，右手持接種環(huán)在瓊脂表面的一端（即皿靠近酒精燈火焰，右手持接種環(huán)在瓊脂表面的一端（即1區(qū)，約占整個(gè)平皿區(qū)，約占整個(gè)平皿 的的1/61/5）涂布，劃線時(shí)，接種環(huán)與瓊脂表面呈）涂布，劃線時(shí)，接種環(huán)與瓊脂表面呈 3040的角度輕輕接的角度輕輕接 觸，利用腕力動(dòng)作，切忌劃破瓊脂表面。燒灼接種環(huán)，待冷后，將

4、接種環(huán)通觸，利用腕力動(dòng)作，切忌劃破瓊脂表面。燒灼接種環(huán)，待冷后，將接種環(huán)通 過過1區(qū)劃線數(shù)次，在區(qū)劃線數(shù)次，在2區(qū)作連續(xù)劃線，各線條間隔要小，但不能重疊。劃滿平區(qū)作連續(xù)劃線，各線條間隔要小，但不能重疊。劃滿平 皿的皿的1/51/4區(qū)域，劃完區(qū)域，劃完2區(qū)不需燒灼接種環(huán)，繼續(xù)通過區(qū)不需燒灼接種環(huán)，繼續(xù)通過2區(qū)數(shù)次，在區(qū)數(shù)次，在3區(qū)作連區(qū)作連 續(xù)劃線，如此反復(fù)至劃完整個(gè)平皿（如圖續(xù)劃線，如此反復(fù)至劃完整個(gè)平皿（如圖3）。）。 細(xì)菌分離與鑒定方課件 圖1 接種環(huán)的握持方法 圖2 平皿的握持方法 1區(qū) 4區(qū)3區(qū) 2區(qū) 圖3 劃線分離的方法 左：分區(qū) 右：培養(yǎng)后的結(jié)果 細(xì)菌分離與鑒定方課件 分離方法分離

5、方法 接種完畢，蓋好平皿蓋，在平皿底玻璃上用記號(hào)接種完畢，蓋好平皿蓋，在平皿底玻璃上用記號(hào) 筆注明標(biāo)本名稱、接種時(shí)間、接種者等。然后將筆注明標(biāo)本名稱、接種時(shí)間、接種者等。然后將 平皿的底朝上，放置在平皿的底朝上，放置在37孵箱內(nèi)孵育孵箱內(nèi)孵育24h。 取出后觀察瓊脂表面的菌落分布情況（見圖取出后觀察瓊脂表面的菌落分布情況（見圖3），）， 注意觀察最后注意觀察最后12區(qū)內(nèi)是否分離出單個(gè)菌落，并區(qū)內(nèi)是否分離出單個(gè)菌落，并 觀察記錄菌落特征（如菌落大小、形狀、透明度、觀察記錄菌落特征（如菌落大小、形狀、透明度、 色素等情況）。色素等情況）。 細(xì)菌分離與鑒定方課件 爛鰓病病原菌平板劃線分離：爛鰓病病原

6、菌平板劃線分離： 取病魚鰓絲一小塊，置于滴有無菌水的載玻片 的邊緣，10分鐘，用接種環(huán)蘸水，在胰胨瓊脂培養(yǎng) 基上劃線。 腸炎病病原菌劃線分離：腸炎病病原菌劃線分離： 用70%酒精棉球擦拭魚體，無菌條件下，取病 魚的肝或脾或腎或心于普通營養(yǎng)瓊脂基劃線分離。 赤皮病病原菌劃線分離赤皮病病原菌劃線分離： 用刀片刮除病灶腐爛部分后用接種環(huán)掛取病料， 在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上平板劃線。28培養(yǎng)24h。 細(xì)菌分離與鑒定方課件 細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況觀察 原理原理 細(xì)菌于適宜條件下在不同的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)細(xì)菌于適宜條件下在不同的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其生長(zhǎng) 狀態(tài)不同。不同細(xì)菌在同一種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，生長(zhǎng)特

7、點(diǎn)狀態(tài)不同。不同細(xì)菌在同一種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，生長(zhǎng)特點(diǎn) 也不相同。這些區(qū)別稱之為培養(yǎng)特征，是鑒別細(xì)菌和細(xì)也不相同。這些區(qū)別稱之為培養(yǎng)特征，是鑒別細(xì)菌和細(xì) 菌分類的依據(jù)之一。菌分類的依據(jù)之一。 把細(xì)菌接種在固體培養(yǎng)基上，在適宜的條件下經(jīng)過把細(xì)菌接種在固體培養(yǎng)基上，在適宜的條件下經(jīng)過 一定時(shí)間的培養(yǎng)，在培養(yǎng)基表面（或內(nèi)部）形成肉眼可一定時(shí)間的培養(yǎng)，在培養(yǎng)基表面（或內(nèi)部）形成肉眼可 見的有一個(gè)細(xì)菌大量繁殖后而成的集團(tuán)，稱之為菌落。見的有一個(gè)細(xì)菌大量繁殖后而成的集團(tuán)，稱之為菌落。 不同細(xì)菌的菌落大小、光濁度、色澤均有其特征。不同細(xì)菌的菌落大小、光濁度、色澤均有其特征。 細(xì)菌分離與鑒定方課件 普通瓊脂平板

8、牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g 氯化氯化鈉（NaCL） 5.0g 磷酸二氫鉀（KH2PO4） 1.0g 瓊脂 15.0g 蒸餾水 1000mL 混勻，加熱溶解，調(diào)PH至7.6分裝，112kPa高壓滅菌15min， 冷卻至45傾注滅菌平板。直徑90cm平皿每皿傾入1520ml培 養(yǎng)基，培養(yǎng)基過少，劃線分離時(shí)細(xì)菌的營養(yǎng)較少，菌落生長(zhǎng)過小， 菌落形態(tài)不易觀察，培養(yǎng)基也易于干燥，不易在數(shù)天內(nèi)對(duì)菌落形 態(tài)進(jìn)行觀察。 細(xì)菌分離與鑒定方課件 含糖培養(yǎng)基滅菌條件115，1015分鐘 一般培養(yǎng)基滅菌條件121，1520分鐘 細(xì)菌分離與鑒定方課件 細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況觀察 在無菌平皿中，倒入溶化

9、后在無菌平皿中，倒入溶化后50普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每 皿約皿約 20毫升，水平靜置待凝固。用接種環(huán)挑去待分離菌毫升，水平靜置待凝固。用接種環(huán)挑去待分離菌 株分區(qū)劃線，株分區(qū)劃線，28培養(yǎng)培養(yǎng)24h。 菌落形態(tài)觀察：菌落形態(tài)觀察： 大?。阂院撩子?jì)。大?。阂院撩子?jì)。 形狀：圓形、不規(guī)則形、放射狀等。形狀：圓形、不規(guī)則形、放射狀等。 表面：光滑、粗糙、圓環(huán)狀、乳突狀等。表面：光滑、粗糙、圓環(huán)狀、乳突狀等。 邊緣：整齊、波形、鋸齒狀等。邊緣：整齊、波形、鋸齒狀等。 色素：有顏色，顏色，是否可溶等。色素：有顏色，顏色，是否可溶等。 透明度：透明、半透明、不透明。透明度：透明、半透明

10、、不透明。 嗜水氣單胞菌菌落為光滑、微凸、圓整、無色或淡嗜水氣單胞菌菌落為光滑、微凸、圓整、無色或淡 黃色，有特殊芳香氣味。黃色，有特殊芳香氣味。 細(xì)菌分離與鑒定方課件 氧化酶試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn) 原理原理 氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng) 的終末呼吸酶，系由細(xì)胞色素的終末呼吸酶，系由細(xì)胞色素a和和a3所組成，一般僅存于需所組成，一般僅存于需 氧菌和兼性厭氧菌中，它使細(xì)菌能利用氧作為氫的最終受體，氧菌和兼性厭氧菌中，它使細(xì)菌能利用氧作為氫的最終受體， 使分子氧還原為過氧化氫，過氧化氫的積累會(huì)有毒性，固本使分子氧還原為過氧化氫，過氧化氫的積累

11、會(huì)有毒性，固本 試驗(yàn)的陽性菌，不僅需氧而且能產(chǎn)生過氧化氫酶。氧化酶并試驗(yàn)的陽性菌，不僅需氧而且能產(chǎn)生過氧化氫酶。氧化酶并 不是直接與試劑起反應(yīng)，而是先使細(xì)胞色素不是直接與試劑起反應(yīng)，而是先使細(xì)胞色素c氧化，然后此氧化，然后此 氧化型細(xì)胞色素氧化型細(xì)胞色素c再使對(duì)苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)，因而再使對(duì)苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)，因而 本試驗(yàn)實(shí)際也是測(cè)定細(xì)胞色素本試驗(yàn)實(shí)際也是測(cè)定細(xì)胞色素c是否存在。是否存在。 細(xì)菌分離與鑒定方課件 氧化酶試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn) 試劑試劑 1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺水溶液或鹽酸二甲基對(duì)苯二胺水溶液或1%二鹽酸四甲基對(duì)苯二胺水溶二鹽酸四甲基對(duì)苯二胺水溶 液。液。 方法方法 在干凈的培

12、養(yǎng)皿中放一張濾紙，滴上二甲基對(duì)本二胺的在干凈的培養(yǎng)皿中放一張濾紙，滴上二甲基對(duì)本二胺的1%水溶水溶 液，僅使濾紙濕潤(rùn)即可，不可過濕。用白金絲接種環(huán)（不可用鎳液，僅使濾紙濕潤(rùn)即可，不可過濕。用白金絲接種環(huán)（不可用鎳 鉻絲）取鉻絲）取1824小時(shí)的菌苔，涂抹在濕潤(rùn)的濾紙上，在小時(shí)的菌苔，涂抹在濕潤(rùn)的濾紙上，在10s內(nèi)涂?jī)?nèi)涂 抹菌苔現(xiàn)紅色者這為陽性，抹菌苔現(xiàn)紅色者這為陽性，(四甲基對(duì)本二胺呈藍(lán)色四甲基對(duì)本二胺呈藍(lán)色)，1060s 現(xiàn)紅色者為延遲反應(yīng)，現(xiàn)紅色者為延遲反應(yīng)，60s以上現(xiàn)紅色者不計(jì)，按陰性處理。以上現(xiàn)紅色者不計(jì)，按陰性處理。 嗜水氣單胞菌為陽性。嗜水氣單胞菌為陽性。 細(xì)菌分離與鑒定方課件

13、氧化酶試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn) 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 二甲基對(duì)本二胺溶液易于氧化，一般于冰箱中儲(chǔ)存兩周。二甲基對(duì)本二胺溶液易于氧化，一般于冰箱中儲(chǔ)存兩周。 如溶液顏色轉(zhuǎn)紅褐色，則不宜使用。如溶液顏色轉(zhuǎn)紅褐色，則不宜使用。 鐵、鎳等金屬可催化二甲基對(duì)苯二胺呈紅色，故不宜用以鐵、鎳等金屬可催化二甲基對(duì)苯二胺呈紅色，故不宜用以 上材料取菌苔。如無白金絲，可用玻棒或滅菌牙簽取菌苔上材料取菌苔。如無白金絲，可用玻棒或滅菌牙簽取菌苔 涂抹。涂抹。 在濾紙上滴加試液已剛剛濕潤(rùn)為宜。如濾紙過濕，妨礙空在濾紙上滴加試液已剛剛濕潤(rùn)為宜。如濾紙過濕，妨礙空 氣與菌苔接觸，延長(zhǎng)顯色時(shí)間，造成假陰性。氣與菌苔接觸，延長(zhǎng)顯色時(shí)間，造成

14、假陰性。 細(xì)菌分離與鑒定方課件 AHM鑒別培養(yǎng)鑒別培養(yǎng) AHM為Aeromonas Hydrophila Medium 的縮寫。 用于可疑氣單胞菌菌落的鑒定。用于可疑氣單胞菌菌落的鑒定。 AHM鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基 成分成分 蛋白胨 5.0g 酵母提取物 3.0g 胰蛋白胨 10.0g L-鹽酸鳥氨酸 5.0g 甘露醇 1.0g 肌醇 10.0g 硫代硫酸鈉（Na2S2O35H2O） 0.4g 枸椽酸鐵胺 0.5g 溴甲酚紫 0.02g 瓊脂 3.0g 蒸餾水 1000mL 制法制法 將各種成分（除溴甲酚紫外）溶化于1升水中，調(diào)pH6.7，加入溴甲酚紫，混 勻煮沸。分裝于13100mm試管，每

15、管 5.0ml，于121，滅菌15分鐘。 （溴甲酚紫的有效pH范圍5.26.8，顏色變化：黃紫） 細(xì)菌分離與鑒定方課件 AHM鑒別培養(yǎng)鑒別培養(yǎng) 方法方法 以接種針挑取可疑菌落，穿刺接種達(dá)于管底，置以接種針挑取可疑菌落，穿刺接種達(dá)于管底，置352 培養(yǎng)培養(yǎng)1824h，如反應(yīng)不肯定，可繼續(xù)培養(yǎng)，如反應(yīng)不肯定，可繼續(xù)培養(yǎng)1824h。 氣單胞菌典型反應(yīng)為培養(yǎng)基管底部為變黃，在接近于試管氣單胞菌典型反應(yīng)為培養(yǎng)基管底部為變黃，在接近于試管 頂部有紫色帶出現(xiàn)。此表明反因?yàn)楦事洞缄栃?，肌醇陰性，頂部有紫色帶出現(xiàn)。此表明反因?yàn)楦事洞缄栃?，肌醇陰性?鳥氨酸脫羧酶陰性（鳥氨酸脫羧產(chǎn)生腐胺，可使培養(yǎng)基由鳥氨酸脫羧酶

16、陰性（鳥氨酸脫羧產(chǎn)生腐胺，可使培養(yǎng)基由 酸變堿）。有時(shí)僅在試管頂端部有輕微變黑，此表明是因酸變堿）。有時(shí)僅在試管頂端部有輕微變黑，此表明是因 分解半胱氨酸產(chǎn)生硫化氫所致。沿穿刺線全部呈混濁狀，分解半胱氨酸產(chǎn)生硫化氫所致。沿穿刺線全部呈混濁狀， 表明該菌具有動(dòng)力。表明該菌具有動(dòng)力。 細(xì)菌分離與鑒定方課件 吲哚試驗(yàn)吲哚試驗(yàn) 原理原理 細(xì)菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚細(xì)菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚(靛基質(zhì)靛基質(zhì))，經(jīng)，經(jīng) 與試劑中的與試劑中的 對(duì)二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚對(duì)二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚 而呈紅色。而呈紅色。 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 1%蛋白胨水水溶液：調(diào)蛋白胨水水溶液：調(diào)p

17、H7.27.6，分裝于，分裝于1/3 1/4試管，試管，115蒸汽滅菌蒸汽滅菌30分鐘。分鐘。 Kovacs 試劑試劑 對(duì)二甲基氨基苯甲醛對(duì)二甲基氨基苯甲醛 5.0g 戊醇戊醇 75g（ml） 濃鹽酸濃鹽酸 25ml 細(xì)菌分離與鑒定方課件 吲哚試驗(yàn)吲哚試驗(yàn) 方法方法 將新鮮的菌種接種與上述培養(yǎng)基中，將新鮮的菌種接種與上述培養(yǎng)基中，28培養(yǎng)培養(yǎng)24 h。 沿管壁緩緩加入沿管壁緩緩加入35mm高的高的Kovacs試劑于培養(yǎng)液試劑于培養(yǎng)液 表面，在液層界面發(fā)生紅色，即為陽性反應(yīng)。若顏表面，在液層界面發(fā)生紅色，即為陽性反應(yīng)。若顏 色不明顯，可加色不明顯，可加45滴乙醚至培養(yǎng)基，搖動(dòng)，使乙滴乙醚至培養(yǎng)基

18、，搖動(dòng)，使乙 醚分散于液體中，將培養(yǎng)液靜置片刻，待乙醚浮至醚分散于液體中，將培養(yǎng)液靜置片刻，待乙醚浮至 液面后，在加吲哚試劑。如培養(yǎng)液中有吲哚時(shí)，吲液面后，在加吲哚試劑。如培養(yǎng)液中有吲哚時(shí)，吲 哚可被提取在乙醚層中，濃縮的吲哚和試劑反應(yīng)，哚可被提取在乙醚層中，濃縮的吲哚和試劑反應(yīng)， 則顏色明顯。則顏色明顯。 嗜水氣單胞菌吲哚試驗(yàn)陽性嗜水氣單胞菌吲哚試驗(yàn)陽性 細(xì)菌分離與鑒定方課件 革蘭氏染色法革蘭氏染色法 由丹麥病理學(xué)家Christain Gram創(chuàng)立，用 于細(xì)菌分類學(xué)研究。 革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家 Christain Gram氏創(chuàng)立的，用于細(xì)菌分類學(xué) 研究。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)

19、中最重要的 鑒別染色法。 革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭 氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩 大類。 細(xì)菌分離與鑒定方課件 革蘭氏染色法基本原理革蘭氏染色法基本原理 用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料 和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷， 能和帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。酸性染料的離子帶負(fù) 電荷，能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。中性染料是前 兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料，如伊紅美藍(lán)、伊紅 天青等。 因細(xì)菌蛋白質(zhì)等電點(diǎn)較低，當(dāng)它生長(zhǎng)于中性、堿 性或弱酸性的溶液中時(shí)常帶負(fù)電荷，所以通常采 用堿性染料（如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅或孔雀 綠等）使其著色。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基 pH下降時(shí)，細(xì)菌

20、所帶正電荷增加，因此易被伊紅、 酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。 細(xì)菌分離與鑒定方課件 革蘭氏染色原理革蘭氏染色原理 革蘭氏染色過程革蘭氏染色過程：（結(jié)晶紫）初染：（結(jié)晶紫）初染 （碘液）（碘液） 媒染媒染 （95%乙醇）乙醇） 脫色脫色 （番紅花紅）（番紅花紅） 復(fù)染。復(fù)染。 初染：初染：當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，所有細(xì)菌都被染成初染劑當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，所有細(xì)菌都被染成初染劑 的藍(lán)紫色。的藍(lán)紫色。 媒染：媒染：碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫一碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫一 碘的復(fù)合物，從而增強(qiáng)了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。碘的復(fù)合物，從而增強(qiáng)了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。 脫色：脫色：當(dāng)用脫色劑處

21、理時(shí)，兩類細(xì)菌的脫色效果是不當(dāng)用脫色劑處理時(shí)，兩類細(xì)菌的脫色效果是不 同的。革蘭氏陽性細(xì)菌結(jié)晶紫同的。革蘭氏陽性細(xì)菌結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物不易被洗脫碘的復(fù)合物不易被洗脫 而保留在細(xì)胞內(nèi)，革蘭氏陰性菌結(jié)晶紫而保留在細(xì)胞內(nèi)，革蘭氏陰性菌結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物比碘的復(fù)合物比 較容易被洗脫出來。較容易被洗脫出來。 復(fù)染：復(fù)染：革蘭氏陽性細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色，呈紫色。革蘭氏陽性細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色，呈紫色。 革蘭氏陰性菌呈紅色。革蘭氏陰性菌呈紅色。 細(xì)菌分離與鑒定方課件 革蘭氏染色法原理革蘭氏染色法原理 革蘭氏染色法之所以能將細(xì)菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰革蘭氏染色法之所以能將細(xì)菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰 性

22、，是由這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。性，是由這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。 細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu) G菌：菌：細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，細(xì)胞細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，細(xì)胞 壁厚，結(jié)構(gòu)致密，類脂質(zhì)含量低，用脫色劑處理后，肽聚壁厚，結(jié)構(gòu)致密，類脂質(zhì)含量低，用脫色劑處理后，肽聚 糖脫水而孔徑縮小，通透性降低，故革蘭氏染色后細(xì)菌仍糖脫水而孔徑縮小，通透性降低，故革蘭氏染色后細(xì)菌仍 保留初染時(shí)的顏色，呈紫色。保留初染時(shí)的顏色，呈紫色。 G菌：菌：其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄，交聯(lián)度低，類脂含量高，其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄，交聯(lián)度低，類脂含量高， 故脫色時(shí)，類脂質(zhì)

23、被乙醇故脫色時(shí)，類脂質(zhì)被乙醇(或丙酮或丙酮)溶解，細(xì)胞壁透性增大，溶解，細(xì)胞壁透性增大， 使結(jié)晶紫使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用番紅花紅碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用番紅花紅 復(fù)染后，細(xì)菌被染上復(fù)染劑的顏色，即紅色。復(fù)染后，細(xì)菌被染上復(fù)染劑的顏色，即紅色。 細(xì)菌分離與鑒定方課件 革蘭氏染色法革蘭氏染色法 材料材料 嗜水氣單胞菌，葡萄球菌嗜水氣單胞菌，葡萄球菌 革蘭氏染色液；載玻片；顯微鏡等。革蘭氏染色液；載玻片；顯微鏡等。 方法方法 涂片：涂片： （1）取載玻片一張，試凈。）取載玻片一張，試凈。 （2）用滅菌的接種環(huán)取生理鹽水一滴，放于載玻片的中央（如被檢材料是液體，可）用滅菌的

24、接種環(huán)取生理鹽水一滴，放于載玻片的中央（如被檢材料是液體，可 不加生理鹽水）。不加生理鹽水）。 （3）左手斜持菌種管，右手將菌種管棉塞稍加轉(zhuǎn)動(dòng)，以便拔下。）左手斜持菌種管，右手將菌種管棉塞稍加轉(zhuǎn)動(dòng)，以便拔下。 （4）右手持接種環(huán)，經(jīng)火焰滅菌后，用右手小指拔開菌種管棉塞，管口通過火焰，）右手持接種環(huán)，經(jīng)火焰滅菌后，用右手小指拔開菌種管棉塞，管口通過火焰， 用接種環(huán)取少量菌（切不可過多）。用接種環(huán)取少量菌（切不可過多）。 （5）管口再通過火焰，塞好棉塞。）管口再通過火焰，塞好棉塞。 （6）將接種環(huán)上的細(xì)菌加到載玻片的水滴內(nèi)，磨勻，涂成直徑約）將接種環(huán)上的細(xì)菌加到載玻片的水滴內(nèi)，磨勻，涂成直徑約1厘

25、米大小的薄薄厘米大小的薄薄 菌膜。菌膜。 干燥：干燥：將玻片置于空氣中，使其自然干燥。將玻片置于空氣中，使其自然干燥。 固定固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜）次固定（以不燙手為宜） 干燥后將涂片在火焰上緩緩?fù)ㄟ^三次，其目的是使細(xì)菌粘于玻片上，染色和沖水時(shí)干燥后將涂片在火焰上緩緩?fù)ㄟ^三次，其目的是使細(xì)菌粘于玻片上，染色和沖水時(shí) 不易脫落；且細(xì)菌為蛋白質(zhì)，被熱凝固后可保持完整形態(tài)。不易脫落；且細(xì)菌為蛋白質(zhì)，被熱凝固后可保持完整形態(tài)。 固定時(shí)通過火焰固定時(shí)通過火焰12次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。次即可，不可過熱，以載玻片不

26、燙手為宜。 細(xì)菌分離與鑒定方課件 革蘭氏染色法革蘭氏染色法 染色：染色：初染初染 媒染媒染 脫色脫色 復(fù)染復(fù)染 初染：初染：加草酸結(jié)晶紫染液于標(biāo)本上，使其覆滿標(biāo)本，染加草酸結(jié)晶紫染液于標(biāo)本上，使其覆滿標(biāo)本，染12分鐘，水洗。分鐘，水洗。 媒染：媒染：滴加碘液沖去殘水，并保持碘液覆蓋滴加碘液沖去殘水，并保持碘液覆蓋1分鐘，水洗。分鐘，水洗。 脫色：脫色：加加95%酒精于玻片上來回流動(dòng)，傾去酒精。如此重復(fù)酒精于玻片上來回流動(dòng)，傾去酒精。如此重復(fù)23次（約次（約30 秒）。水洗。秒）。水洗。 或用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加或用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背

27、景下，用滴管流加95 的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色。約的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色。約2030秒鐘，立即用水沖凈酒精立秒鐘，立即用水沖凈酒精立 即水洗。即水洗。 復(fù)染：復(fù)染：加番紅花紅（沙黃液、稀釋復(fù)紅等），染約加番紅花紅（沙黃液、稀釋復(fù)紅等），染約1分鐘。水洗、干燥。分鐘。水洗、干燥。 鏡檢：鏡檢：干燥后用顯微鏡觀察。革蘭氏陰性菌成紅色。革蘭氏陽性均呈紫色。干燥后用顯微鏡觀察。革蘭氏陰性菌成紅色。革蘭氏陽性均呈紫色。 以分散開的細(xì)菌革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)。過于密集的細(xì)菌染色后常常呈假陽性。以分散開的細(xì)菌革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)。過于密集的細(xì)菌染色后常常呈假陽性。 同法在同一載玻片上以大腸桿菌和

28、葡萄球菌混合紙片，作革蘭氏染色對(duì)比。同法在同一載玻片上以大腸桿菌和葡萄球菌混合紙片，作革蘭氏染色對(duì)比。 細(xì)菌分離與鑒定方課件 革蘭氏染色法革蘭氏染色法 革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握酒精脫色程度，如脫色過革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握酒精脫色程度，如脫色過 度，則陽性菌被誤染為陰性菌。此外，菌齡也影響染色結(jié)度，則陽性菌被誤染為陰性菌。此外，菌齡也影響染色結(jié) 果，如陽性菌培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，或已死及部分自行溶解，都果，如陽性菌培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，或已死及部分自行溶解，都 常呈陰性反應(yīng)。常呈陰性反應(yīng)。 結(jié)果與思考結(jié)果與思考 在你所作的革蘭氏染色制片中，大腸桿菌和葡萄球菌被染在你所作的革蘭氏染色制片中，大腸桿菌和葡

29、萄球菌被染 成何種顏色？它們是革蘭氏陽性菌還是革蘭氏陰性菌？成何種顏色？它們是革蘭氏陽性菌還是革蘭氏陰性菌？ 作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關(guān)作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關(guān) 鍵一步是什么？鍵一步是什么？ 當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣能保證你的染當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣能保證你的染 色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？ G+ G-另一判斷方法：取40ul 3%NaOH滴加于潔凈的載波 片上，用接種環(huán)刮去平板單個(gè)菌苔適量，在NaOH滴上研 磨40S，用接種環(huán)挑起，若有拉絲現(xiàn)象，則為G-，否則為 G+ 細(xì)菌分離與鑒定方課件

30、 糖發(fā)酵試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn) 原理原理 各種細(xì)菌因含有發(fā)酵不同糖類的酶，所以分解糖類 的能力各不相同，有的能分解多種糖類，有的僅能 分解12中糖類，還有不能分解。細(xì)菌分解多糖類， 如淀粉、菊糖等，因其分子較大，不能進(jìn)入細(xì)菌細(xì) 胞，必須被細(xì)菌分泌的胞外酶水解后，才能為細(xì)菌 吸收利用。雙糖也要胞外酶水解為單糖后被細(xì)菌所 利用。細(xì)菌利用的單糖主要有葡萄糖、果糖等，細(xì) 菌發(fā)酵葡萄糖可產(chǎn)生丙酮酸，生成乳酸、琥珀酸、 甲酸、乙酸等有機(jī)酸，并生成醇類和氣體（CO2和 H2）。細(xì)菌分解糖類后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可因菌種的 不同而異，有的產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，有的則僅產(chǎn)酸，故可 利用此特點(diǎn)以鑒別細(xì)菌。 細(xì)菌分離與鑒定方課件 糖發(fā)酵試

31、驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn) 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 蛋白胨蛋白胨 5.0g 溴甲酚紫（溴甲酚紫（0.04%） 15 ml 蒸餾水蒸餾水1000mL,調(diào)調(diào)PH至至7.4,分裝，每瓶分裝，每瓶100ml 每每100ml蛋白胨水中分別加入葡萄糖、蔗糖、阿拉蛋白胨水中分別加入葡萄糖、蔗糖、阿拉 伯糖、七葉苷及水楊苷伯糖、七葉苷及水楊苷1.0g，充分溶解，分裝試管，充分溶解，分裝試管， 106.44kPa高壓滅菌高壓滅菌10min。 方法方法 以幼齡斜面培養(yǎng)物分別接種上述發(fā)酵管，以幼齡斜面培養(yǎng)物分別接種上述發(fā)酵管，28培養(yǎng)培養(yǎng) 24 h。凡試驗(yàn)管顏色從紫色變?yōu)辄S色，表明細(xì)菌可。凡試驗(yàn)管顏色從紫色變?yōu)辄S色，表明細(xì)菌可 發(fā)酵該種糖

32、類，判為陽性。發(fā)酵該種糖類，判為陽性。 嗜水氣單胞菌可發(fā)酵以上嗜水氣單胞菌可發(fā)酵以上5種糖類。種糖類。 細(xì)菌分離與鑒定方課件 脫脂奶平板試驗(yàn)（酪蛋白胨化試驗(yàn)）脫脂奶平板試驗(yàn)（酪蛋白胨化試驗(yàn)） 原理原理 大部分細(xì)菌無直接分解蛋白質(zhì)的能力，多是利大部分細(xì)菌無直接分解蛋白質(zhì)的能力，多是利 用蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物，如蛋白胨和氨基酸等為用蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物，如蛋白胨和氨基酸等為 其氮源。其氮源。 細(xì)菌分解蛋白質(zhì)是依賴于蛋白酶和肽酶的作用，細(xì)菌分解蛋白質(zhì)是依賴于蛋白酶和肽酶的作用， 前者為胞外酶，能水解蛋白質(zhì)為多肽和簡(jiǎn)單的前者為胞外酶，能水解蛋白質(zhì)為多肽和簡(jiǎn)單的 肽，有時(shí)可釋放出少量氨基酸，其功用是使不肽，有時(shí)可釋放出少