醫(yī)學分子生物學-整理筆記

1、-作者xxxx-日期xxxx醫(yī)學分子生物學-整理筆記【精品文檔】第2章 基因、基因組和基因組學基因 (gene)：攜帶有遺傳信息的 DNA或 RNA序列，也稱為遺傳因子?；蚴呛铣捎泄δ艿牡鞍踪|或 RNA所必需的全部 DNA，包括編碼蛋白質或 RNA的核酸序列，也包括為保證轉錄所必需的調控序列?；虻墓δ埽簜鬟f遺傳信息，控制個體性狀表現(xiàn)。 結構基因 (structural genes)：可被轉錄形成 mRNA，并轉譯成多肽鏈，構成各種結構蛋白質，催化各種生化反應的酶和激素等。調節(jié)基因 (regulatory genes) ：某些可調節(jié)控制結構基因表達的基因。其突變可影響一個或多個結構基因的功能

2、，或導致一個或多個蛋白質(或酶)量的改變。 eg. miRNA, siRNA, piRNA種類IIIIII分布核仁核基質核基質產物rRNAmRNA, microRNA5S rRNA, tRNA, siRNA 核糖體 RNA 基因 (ribosomal RNA genes) 與轉運 RNA 基因 (transfer RNA genes)：只轉錄產生相應的RNA而不翻譯成多肽鏈。 真核生物的RNA聚合酶 ( 3種)：RNA 聚合酶 I, II, III. 開放閱讀框架 (open reading frame，ORF)：在DNA鏈上，由蛋白質合成的起始密碼開始，到終止密碼為止的一個連續(xù)編碼序列。斷裂

3、基(split gene)：真核生物結構基因，由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質。基因組 (genome)：一個細胞內的全部遺傳信息，包括染色體基因組和染色體外基因組。 基因組中的 DNA包括編碼序列和非編碼序列。 部分病毒基因組-RNA。 C值 (C-value)：一種生物體單倍體基因組DNA的總量，用以衡量基因組的大小。通常，進化程度越高的生物其基因組越大，但從總體上說，生物基因組的大小同生物在進化上所處地位的高低無關。存在 C-value paradox （C值悖理）。生物復雜性越高，其基因的密度越低。 病毒基因

4、組的大小: 與細菌或真核細胞相比，病毒的基因組很小。不同的病毒之間基因組大小相差很大。乙肝病毒DNA：3kb，編碼4種蛋白質；痘病毒的基因組：300kb，編碼幾百種蛋白質。病毒基因組的大小通常與其對宿主的依賴程度有關，基因組越大，依賴性越小。 RNA 病毒基因組編碼序列具有節(jié)段性 :有些病毒的基因組 RNA由不連續(xù)的幾條核酸鏈組成（如流感病毒，輪狀病毒等）。 分段基因組的病毒一般感染效率較低 ；分段基因組容易發(fā)生重組，故病毒容易變異 。 目前未發(fā)現(xiàn)DNA病毒有此狀況。病毒基因存在基因重疊 :基因重疊：同一段DNA片段能夠參與編碼兩種甚至兩種以上的蛋白質分子。這種現(xiàn)象在其它的生物細胞中僅見于線粒

5、體和質粒DNA。此結構意義在于使較小的基因組能夠攜帶較多的遺傳信息。 基因重疊的方式 :1）一個基因完全在另一個基因里面。2）幾個基因部分重疊。3）兩個基因之間只有一個堿基重疊。 重疊基因的DNA序列可能大部分相同，但由于翻譯時的讀碼框架不同、或起始部位不同而產生不同的蛋白質。 有些真核病毒的部分序列，對某一個基因來說是內含子，而對另一個基因而言卻是外顯子。 病毒基因組的大部分序列具有編碼功能：病毒基因組的大部分是用來編碼蛋白質的，只有非常小的一部份沒有編碼翻譯功能。 X174基因組中不編碼的序列只占217/5375。乳頭瘤病毒基因組約，其中不編碼的部分約為。 少數(shù)真核生物病毒的基因組也存在內

6、含子結構。病毒基因組的轉錄單元是多順反子 :多順反子 mRNA (polycistronie mRNA) ：病毒基因組DNA序列中功能上相關的蛋白質的基因或 rRNA的基因往往叢集在基因組的一個或幾個特定的部位，形成一個功能單位或轉錄單元。它們可被一起轉錄成含有多個 mRNA 的分子。病毒基因組都是單倍體：除了逆轉錄病毒以外，一切病毒基因組都是單倍體，每個基因在病毒顆粒中只出現(xiàn)一次。 逆轉錄病毒帶有逆轉錄酶，能使RNA反向轉錄生成DNA，因此其基因組可擁有兩個拷貝。 噬菌體基因具有連續(xù)性：噬菌體的基因是連續(xù)的，而真核細胞病毒的基因是不連續(xù)的，具有內含子。 原核生物基因組通常比較簡單，其基因組大

7、小在106bp107bp之間，所包含的基因數(shù)目幾百個到數(shù)千個之間。 原核生物基因組通常由一條環(huán)狀的雙鏈DNA分子組成，在細胞中與蛋白質結合成染色體的形式，在細胞內形成一個致密的區(qū)域，稱為類核（nucleoid）. 大腸桿菌染色體基因組的結構和功能 :大腸桿菌基因組序列中的基因密度非常高，編碼區(qū)所占的比例較大。大腸桿菌中總共有4288個基因，平均編碼長度為 950bp，基因之間的間隔區(qū)長度為 118bp，而且這些結構基因沒有內含子。大腸桿菌DNA分子中的重復序列很少，但在大腸桿菌基因組中不同部位可以有稱為 轉座子 的50kb的重復片段。 轉座因子：原核生物轉座因子主要有二類：插入序列 (inse

8、rtion sequence，IS) : IS：2000bp以內，兩端都有正向重復序列（direct repeats，DR）和反向重復序列（inverted repeats，IR），中間1kb左右的編碼序列，僅編碼和轉座有關的轉座酶。 只有當 IS 轉座到某一基因中使該基因失活或插入位點旁邊的染色體發(fā)生畸變等效應時才會被發(fā)現(xiàn)。 復合型轉座子 ( composite transposon, Tn) : Tn ：200020000bp之間，兩端由一對 IS 元件組成，帶有與轉座作用有關的基因以及其他基因。 根據(jù)轉座的的機制和結果，可將轉座分為：復制型轉座，保守型轉座大腸桿菌染色體外基因組的結構和功

9、能：質粒（plasmid）：一類染色體外具有自主復制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子，屬染色體外基因組。 大腸桿菌質粒是雙鏈環(huán)狀結構的 DNA 分子。可以有共價閉合環(huán)狀 DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）、缺口的環(huán)狀 DNA、線性DNA 三種結構狀態(tài)。質粒對宿主細胞的生存一般不是必需的，但質粒帶有某些特殊的不同于宿主細胞的遺傳信息，其存在賦予宿主細胞一些遺傳性狀。質粒能自主復制，是能獨立復制的復制子（autonomous replicon）。嚴緊控制（stringent control）型質粒：其復制常與宿主的繁殖偶聯(lián)，拷貝數(shù)較少，每個細胞中只有1個到

10、十幾個拷貝。松弛控制（relaxed control）型質粒：其復制與宿主不偶聯(lián)，每個細胞中有幾十到幾百個拷貝。 質粒的穩(wěn)定性與不相容性: 質粒的不相容性（incompatibility）：兩種不同質粒因利用同一復制和維持機制，在復制和隨后向子代細胞分配的過程中會發(fā)生競爭，從而不能在同一宿主細胞內穩(wěn)定存在，其中一種質粒將被丟失。 攜帶不同復制和維持機制的質粒屬于不同的不相容群，它們可以共存于同一細胞中。 影響質粒穩(wěn)定性的因素：1.主細胞分裂時質粒能否均衡地分配到子代細胞。2.質粒分子自身結構的穩(wěn)定性。 真核生物的遺傳物質絕大部分存在于細胞核染色體，少部分存在于線粒體或葉綠體中-細胞核基因組和細

11、胞器基因組。 真核生物染色體基因組特點 : 人類基因組中僅含有2500030000個基因，遠低于預期。在人類基因組中只有很少一部份（約2-3）DNA序列用以編碼蛋白質和結構RNA。人類基因組中存在大量基因間隔區(qū)序列，主要由重復DNA構成。 在基因內部含大量內含子。 單拷貝序列：占 40%-80%，結構基因基本上屬于單拷貝序列。中度重復序列：重復次數(shù)10105，占 10-40%。如rRNA、tRNA、組蛋白以及免疫球蛋白的基因等，另有部分可能與基因的調控有關。高度重復序列：拷貝數(shù)大于106 ，占 10-60%。如反向重復序列 (inverted repeats) 和衛(wèi)星DNA (satellit

12、e DNA)。 反向重復序列常見于基因的調控區(qū)，可能與復制、轉錄的調控有關。 重復序列的多態(tài)性：DNA多態(tài)性：DNA 序列發(fā)生變異從而導致的個體間核苷酸序列的差異。主要包括 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）和 串聯(lián)重復序列多態(tài)性（tandem repeats polymorphism）。 SNP-由基因組DNA上的單個堿基的變異引起的DNA序列多態(tài)性。 據(jù)估計，人類基因組中每1kp就存在一個SNP位點，共有約300萬個之多，是人群中個體差異最具代表性的DNA多態(tài)性。 相當一部分SNP還直接或間接與個體的表型差異、對疾病的易感性或抵抗能力、對

13、藥物的反應性等相關。 大多數(shù)SNP位點十分穩(wěn)定，人類85%的SNP是共有的。 高度重復序列中的無間隔反向重復序列很容易形成限制性內切酶識別位點，也很容易因為突變產生或是失去一個酶切位點，可以造成 限制性片段長度多態(tài)性 (restriction fragment length polymorphism， RFLP).真核基因組存在多基因家族與假基因 :多基因家族 (multi gene family)：由某一祖先基因經(jīng)過重復和變異所產生的一組基因。 假基因 (pseudo gene)：與某些有功能的基因結構相似，但不能表達有功能的基因產物的某些基因。 多基因家族大致可分為兩類： 一個基因家族的不

14、同成員成簇地分布在不同染色體上，但核酸序列高度同源，編碼一組功能上緊密相關的蛋白質，如珠蛋白基因家族。 基因家族成簇地分布在某一條染色體上，它們可同時發(fā)揮作用，合成某些蛋白質，如組蛋白基因家族就成簇地集中在第7號染色體長臂3區(qū)2帶到3區(qū)6帶區(qū)域內，這種分布方式與DNA復制時需要大量的組蛋白有關。 假基因的產生有兩種方式：由突變引起的基因序列變化而失去功能，這樣產生的假基因帶有內含子，稱為常規(guī)假基因（conventional pseudogene）。mRNA經(jīng)過反轉錄為cDNA，再插入基因組，由于插入位點不合適或序列發(fā)生變化而導致失去功能。這種類型的假基因不含內含子，稱為已加工的假基因（proc

15、essed pseudogenes）。真核生物細胞器基因組：真核生物有兩類細胞器能攜帶遺傳物質：線粒體和葉綠體。這些遺傳物質獨立于細胞核基因組外，能夠自行復制和表達，又稱為染色體外基因組。 線粒體基因組編碼其自身蛋白質合成體系的某些成員，如rRNA和tRNA等，以及呼吸鏈中的某些成員，如ATP酶、NADH還原酶、細胞色素氧化酶復合體中的某些組分。其它成員由細胞核基因組編碼。 高等動物線粒體基因組具有獨特的特點：母系遺傳。子代線粒體基因組來自母親，父系的線粒體基因組在精卵結合時一般不能進入卵細胞。 線粒體DNA損傷后不易修復，突變率較高，可能與衰老及某些疾病有關。遺傳密碼與通用遺傳密碼存在差別，

16、如UGA（終止密碼子）編碼Trp，AGA/AGG（Arg）為終止密碼子等。 基因組學（Genomics）：對生命有機體全基因組進行序列分析和功能研究的學科。 結構基因組學：目的是在生物體的整體水平上測定出全部蛋白質分子、蛋白質蛋白質、蛋白質與其他生物分子復合體的三維結構。 基因定位克隆：利用微衛(wèi)星和SNP全基因組掃描來搜索與疾病性狀緊密相關的位點，從而確定疾病相關基因的位置并進一步獲得克隆。 功能基因組學：根據(jù)已有基因的功能推測基因組中具有相似結構的基因的功能，通過實驗手段驗證。有效的方法有定點突變、基因敲除（knock-out）和RNA干擾及過量表達技術等。 第3章 蛋白質組學蛋白質是一種復

17、雜的有機生物大分子，它們是生命活動的實際執(zhí)行者。幾乎所有的生物催化劑-酶，都是蛋白質。構成細胞骨架和動物大部分結構的纖維物質也是蛋白質；膠原蛋白和角蛋白組成了皮膚，毛發(fā)和軟骨；肌肉大部分也是由蛋白質組成。蛋白質由一個一個的氨基酸首尾相接形成肽鏈，肽鏈再折疊形成一定空間結構。蛋白質組（proteome）：指由一個基因組，或一個細胞、組織表達的所有蛋白質。蛋白質組學（proteomics）：以蛋白質組為研究對象，分析細胞內動態(tài)變化的蛋白質組成成分、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質之間的相互作用與聯(lián)系，在整體水平上研究蛋白質的組成與調控的活動規(guī)律。 功能蛋白質組：細胞在某一階段或與某一生理現(xiàn)象相關的所

18、有蛋白質。差異蛋白質組：不同種類或狀態(tài)下各種樣本之間蛋白質組的區(qū)別與變化。多樣-蛋白質數(shù)目大大超過基因數(shù)目?？勺?蛋白質隨時間與空間變化。基于凝膠的工作流程是目前使用的較為廣泛的、發(fā)展最為成熟的工作流程。樣品制備：樣品來源：細胞、組織、體液等?？刹捎萌鞍祝换蜻M行預分級（線粒體、高爾基體、葉綠體、膜蛋白、核蛋白等）-提高低豐度蛋白質的上樣量及檢測靈敏度。盡可能擴大蛋白質的溶解度和解聚，以提高分辨率。樣品分離：雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）：利用蛋白質的等電點與分子量差異分離之。2-DE 的缺點：難以有效分離極酸、極堿性蛋白質，極大、極小

19、蛋白質，及低豐度蛋白質。膠內酶解過程費時、費力，難以與質譜實現(xiàn)自動化聯(lián)用。第一向：等電聚焦 IEF；第二向：SDS-PAGE。染色方法：考馬斯亮藍染色；銀染（不含戊二醛）；熒光染色（Cy3,Cy5），放射性同位素標記等。新型非凝膠技術：液相色譜法（liquid chromatography, LC）對在雙向電泳中難以分離鑒定的高分子量、低分子量、極酸性、極堿性和疏水性強的蛋白進行有效的分離鑒定。LC-MS/MS：液質聯(lián)用技術。微量測序（microsequencing）：N-末端Edman降解：經(jīng)凝膠分離的蛋白質直接印跡在PVDF膜或玻璃纖維膜上N末端氨基酸殘基經(jīng)苯異硫氰酸酯修飾從多肽鏈上切下修

20、飾的殘基再經(jīng)層析鑒定余下的多肽鏈被回收再進行下一輪降解循環(huán)。 缺點：過程緩慢，消耗大，試劑昂貴。質譜分析（Mass spectrometry）：基本原理：樣品分子離子化后，根據(jù)離子間質荷比（m/z）差異來分離并確定樣品分子量。主要質譜類型：MALDI-TOF MS: 基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜 (Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)利用固體基質分子均勻包埋樣品分子，在激光照射下，基質分子吸收激光能量而蒸發(fā)，攜帶樣品分子進入氣相，進一步將能量傳遞給樣品分子，從而實現(xiàn)樣品分

21、子離子化。MALDI 最大的特點是離子電荷通常為1-2個，而不象ESI中為多電荷離子，對分子質量較大的樣品而言，不會形成復雜的多電荷圖譜，因而對圖譜的解析比較清楚。 ；ESI MS: 電噴霧質譜（ electrospray ionisation mass spectrometry ）待測分子溶解在溶劑中，以液相方式通過毛細管到達噴口。在高電壓作用下形成帶電荷的霧滴，隨著霧滴中溶劑的蒸發(fā)，其表面電場隨半徑減少而增加，電荷密度不斷變大，到達某一臨界點時，樣品以離子方式蒸發(fā)進入氣相，從而實現(xiàn)離子化。ESI特點：沒有直接的外界能量作用于分子，因此對分子結構破壞較少，是一種典型的“軟電離”方式?？尚纬啥?/p>

22、電荷離子，因此在較小的m/z范圍內可以檢測到大分子質量的分子。采用電噴霧質譜目前可測定分子質量100kDa以下的蛋白質，最高可達150kDa。由于采用液相方式進樣，可與蛋白質化學中常用的液相色譜聯(lián)用，即液相色譜-電噴霧質譜 (LC-ESI MS)。在常規(guī)電噴霧質譜中，噴霧的過程易形成較大液滴，液滴中的樣品分子在離子源就不能完全離子化從而降低了樣品的利用率和靈敏度。鑒定與注釋蛋白質的路線：通過肽指紋圖譜（peptide mass fingerprint, PMF）和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配通過檢測樣品中部分肽段的二級質譜信息或氨基酸序列標簽和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配蛋白質數(shù)據(jù)庫：目前應用最普遍的數(shù)據(jù)庫是NRDB和d

23、bEST 數(shù)據(jù)庫。NRDB 由SWISS-PROT 和GENPETP等幾個數(shù)據(jù)庫組成；dbEST是由美國國家生物技術信息中心（NCBI）和歐洲生物信息學研究所(EBI)共同編輯，包括大量肽序列標簽（PST）。SWISS-PROT()擁有目前世界上最大的蛋白質組學數(shù)據(jù)庫。PMF或二級質譜匹配檢索常用搜索引擎-MASCOT()抗體芯片：可用于研究在不同生理狀態(tài)或病理狀態(tài)下蛋白水平的量變。優(yōu)點：微型化，集成化，高通量化。如腫瘤標志物抗體芯片等。常用熒光標記：Cy5和Cy3等。酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid system）：典型的真核轉錄因子都

24、含有二個結構域: DNA結合結構域（DNA binding domain，DNA-BD）和轉錄激活結構域（activation domain，AD）。二個結構域功能上相互獨立又互相依賴，只有結合才具完整活性。酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白蛋白的相互作用。 利用酵母雙雜交技術篩選新的相互作用蛋白：1）DNA-BD + Bait protein；2）AD + cDNA文庫的基因。將陽性反應的酵母菌株中的 AD-LIBRARY載體提取分離出來，從而對載體中插入的文庫基因進行測序和分析，研究與已知基因在生物學功能上的聯(lián)系。第4章 基因工程基因工程（gene engineeri

25、ng）：又稱為重組DNA技術，是指將外源基因通過體外重組后導入受體細胞，并使其能在受體細胞內復制和表達的技術。分子克隆（molecular cloning）:是指在體外將制備的DNA片段與載體重組，然后導入受體細胞，并在受體細胞中復制、擴增，以獲得該DNA分子的大量拷貝的技術。第一節(jié) 工具酶一、限制性核酸內切酶(restriction endonuclease, RE)是一類能識別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。主要用途：1）在分子克隆過程中切割DNA以獲取目的基因片段、切割載體形成切口，使目的基因能插入載體。2）分析限制性片段長度多態(tài)性（RFLP），用于遺傳病的診斷，法醫(yī)DNA指

26、紋分析等。3）用于構建DNA的物理圖譜、基因定位及DNA同源性分析等。類酶識別序列特點回文結構(palindrome)，切口 ：平端切口、粘端切口二、DNA聚合酶 1、DNA聚合酶和Klenow片段 DNA-pol是單一肽鏈的多功能酶，分子量為103kd，它具有3種酶活性：1)53聚合酶活性；2)35核酸外切酶活性；3)53核酸外切酶活性。 Klenow片段的主要功能有：1)補齊雙鏈DNA的3末端，同時可使3末端DNA標記同位素；2)在cDNA克隆中，合成cDNA第二鏈；3)DNA序列分析。 2、Taq DNA聚合酶:一種耐熱的DNA聚合酶，分子量為65 kd，最佳作用溫度是7080，Taq酶

27、具有5?3? 聚合酶活性和依賴于聚合作用的5?3?外切酶活性。Taq DNA聚合酶可用于DNA測序及通過PCR對DNA分子的特定序列進行體外擴增。3、逆轉錄酶 依賴RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板、4種dNTP為底物，催化合成DNA，其功能主要有：1)逆轉錄作用；2)核酸酶H的水解作用；3)依賴DNA的DNA聚合酶作用。4、末端脫氧核糖核苷酰轉移酶 分子量為60 kd，在二價陽離子存在下，催化脫氧核糖核苷酸轉移到單鏈或雙鏈DNA分子的3末端-OH上。功能主要有：1)在載體或目的基因3末端加上互補的同質多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重組連接。2)用于DNA3末端的同位素探針標記。1）

28、底物是單鏈DNA或有3?突出末端的雙鏈DNA，需要Mg2+。2）底物是平端或3?凹端的雙鏈DNA，需要Co2+。 三、 DNA連接酶 大腸桿菌DNA連接酶和T4 DNA連接酶兩種類型，分子量分別為7500和6000，兩者的輔基不同，前者需NAD+，后者需ATP。它們催化的反應也不盡相同，大腸桿菌DNA連接酶只能連接粘性末端，而T4DNA連接酶既能連接粘性末端，又能連接平末端。 四、 堿性磷酸酶 催化去除DNA、RNA或dNTP上的5?-磷酸基團，其主要用途有：1)除去DNA片段上的5?磷酸，以防自身連接。2)在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素標記前，除去RNA或DNA上5?端的磷酸。五、 核

29、酸酶S1 核酸酶S1可水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交分子中的單鏈部分。其主要作用有：除去粘性末端以產生平末端；除去cDNA合成時形成的發(fā)夾結構；分析RNA的莖環(huán)結構和DNA-RNA分子的雜交情況。功能：水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交體中的單鏈部分。載體（vector）:指能攜帶外源DNA片段導入宿主細胞進行擴增或表達的工具。載體的本質為DNA。制備的目的基因或外源性DNA片段必須與合適的載體連接形成重組體，才能進入受體細胞并進行復制和表達。載體包括克隆載體和表達載體。常用的載體有：質粒、噬菌體、粘粒、酵母質粒和病毒等。載體大都經(jīng)過改造，如質粒改造后攜帶某些選擇性標記和克

30、隆位點的遺傳信息；噬菌體改造后只保留同一種限制酶的單個或兩個切點。在常用的克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件（DNA序列）即為表達載體，它不僅可攜帶外源基因片段進入宿主細胞，而且可在宿主細胞中表達外源基因。載體應具備的特征：能自我復制并具較高的拷貝數(shù)。分子量一般10Kb。帶有遺傳篩選標記。有適當?shù)南拗泼盖形稽c，便于外源基因的插入和篩選。載體上具有多個限制酶的單一位點（即在載體其他部位無這些酶的相同位點）稱為多克隆位點。一、克隆載體 能將載體外源基因在受體細胞中復制擴增并產生足夠量目的基因的載體稱為克隆載體。（一）質粒載體 質粒（plasmid）是指細菌染色體以外的小分子環(huán)狀雙鏈DNA，能自

31、我復制和表達其攜帶的遺傳信息。主要用途：用于保存和擴增2Kb目的DNA。構建cDNA文庫。目的DNA的測序。作為核酸雜交時的探針來源。pBR322質粒是由一系列大腸桿菌質粒DNA通過DNA重組技術構建而成的雙鏈克隆載體，長為。它含有一個能保證高拷貝自我復制的復制起始點（Ori），并裝有四環(huán)素抗性（Tetr）基因和氨芐青霉素抗性（Ampr）基因供菌落篩選。在這兩個抗性基因中分別含有BamHI和PstI等限制酶的單一酶切位點，用于插入外源DNA片段。如有外源基因的插入，會導致這些標志性基因的失活。pUC系列載體是由pBR322質粒和M13噬菌體重組構建而成的雙鏈DNA質粒載體。pUC18和pUC1

32、9質粒長約，除多克隆位點互為相反方向排列外，其它序列均相同。PUC質粒系列還包括pUC8、pUC9和pUC118、pUC119，它們的區(qū)別在于MCS的限制酶識別位點數(shù)目不同，而每一對pUC質粒的MCS中限制酶識別位點數(shù)目相同、順序相反。pUC質粒含Ampr，可供菌落篩選。載體中裝入一個來自大腸桿菌乳糖操縱子的DNA片段（lacZ基因），該基因編碼-半乳糖苷酶氨基端的一個片段，IPTG可誘導此片段合成，而此片段能與宿主細胞所編碼的缺陷型-半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內互補（-互補），形成完整的-半乳糖苷酶。-半乳糖苷酶能催化指示劑底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）形成藍色菌落。pUC

33、載體的lacZ基因中含有MCS，當外源基因插入MCS，lac-肽基因閱讀框架被破壞，細菌內將無-半乳糖苷酶活性，菌落呈白色（即半乳糖苷酶的藍白斑篩選實驗）。（二）噬菌體載體 噬菌體（bacteriophage，phage）：指感染細菌的病毒。按其生活周期分為兩種類型：溶菌性噬菌體：指噬菌體感染細胞后，連續(xù)增殖，直到細菌裂解，釋放的噬菌體又可感染其它細菌。溶原性噬菌體：指噬菌體感染細胞后，可將自身的DNA整合到細菌的染色體中去，和細菌染色體一起復制。噬菌體 野生型的噬菌體是線性雙鏈DNA，全長，其中60%（約30Kb）是溶菌生長所必需，中間40%的區(qū)域為非必需，可被外源DNA片段代替而不影響噬菌

34、體的生存。噬菌體5末端含12核苷酸的互補單鏈順序，是天然的粘性末端，稱為cos位點，噬菌體感染宿主菌后，其粘端通過堿基配對而結合，形成環(huán)狀DNA分子。重組噬菌體的分子量必須在野生型噬菌體的75%105%之間。重組噬菌體篩選標記：外源基因插入型：藍白斑(LacZ)篩選外源基因置換型：噬菌斑數(shù)目（red和gam基因，轉染率高1001000倍）。用途：用作一般的克隆載體。用于構建基因組或cDNA文庫（22Kb）。用于抗體庫或隨機肽庫的構建。核酸的序列分析。M13噬菌體 含一約的單鏈（正鏈）閉環(huán)DNA分子。M13噬菌體在細菌內呈溶源狀態(tài)生長，成熟的子代噬菌體中只有一條含外源DNA的鏈（負鏈）。改造過的

35、M13噬菌體引入了帶有大腸桿菌LacZ的調控序列和N端部分氨基酸的編碼信息以及多克隆位點序列，因此也可用藍白斑篩選重組體。M13噬菌體載體主要用于目的DNA的測序和單鏈放射性探針的制備，克隆的外源DNA一般1Kb。 M13噬菌體特點：野生型M13噬菌體為左右的閉環(huán)正鏈DNA分子?？寺〉耐庠椿蚱?kb。M13噬菌體能以單鏈和雙鏈兩種方式存在，可用于感染(經(jīng)包裝的單鏈DNA)和轉化(雙鏈DNA)。M13中引入的多克隆位點，正好插入LacZ基因內，可利用藍白色噬菌斑篩選重組體。M13噬菌體只降低宿主細胞的生長速度，而不溶解宿主細胞（呈溶源狀態(tài)生長，故可從細菌培養(yǎng)液中獲得噬菌體，制備單鏈DNA）。

36、（三）粘性質粒(cosmid) 組成：質粒復制的起始位點(ORI)。攜帶抗藥基因。用于插入目的基因的單一酶切位點。噬菌體的cos位點。特點：粘粒（粘性質粒）載體大小為46Kb，而插入外源基因長達4050kb。加入噬菌體頭部和尾部蛋白，可將粘粒包裝成類似于?噬菌體的具感染能力的顆粒，容易進入大腸桿菌。粘粒進入細菌后則完全失去噬菌體的功能，而表現(xiàn)質粒的特性。用途：克隆大片段DNA；構建基因組文庫。（四）酵母細胞中克隆基因常用載體 酵母人工染色體（yeast artificial chromosome，YAC）是利用酵母染色體DNA和大腸桿菌pBR322改造而成，可以插入長達1000Kb的外源DNA

37、片斷。根據(jù)其復制方式不同分為三型：整合型（YIP）、復制型（YRP）和附加體型（YEP）載體，YRP中插入酵母著絲粒區(qū)，構成酵母著絲粒質粒（YCP）載體。三類載體的共同特點:能在大腸桿菌中復制，并具有較高的拷貝數(shù)；含有在酵母細胞中便于選擇的遺傳標記；含有合適的限制酶切位點，以便插入外源基因。YIP和YCP載體能穩(wěn)定遺傳但都是單拷貝、轉化率低，多用于遺傳分析；而YRP和YEP載體對酵母具有很高的轉化活性、拷貝數(shù)較高但穩(wěn)定性差，后者較前者穩(wěn)定，是基因克隆中常用的載體。 （五）動物細胞基因克隆的載體 已構建并經(jīng)常使用的動物病毒克隆載體有：猿猴空泡病毒40（simian vacuolating vir

38、us 40，SV40）載體；腺病毒（adenovirus）載體；逆轉錄病毒（retrovirus）載體。二、表達載體 表達載體是指能將外源基因在受體細胞中有效轉錄和正確翻譯的載體。外源目的基因在新宿主細胞中是否克隆成功，是通過鑒定克隆是否表達的方法來證實，即產生克隆基因所編碼的蛋白質，其每個環(huán)節(jié)都至關重要。真核基因在原核細胞中表達需要有效轉錄及一系列調控元件，必須保證外源基因插入方向的正確性；受原核啟動子的控制；必須能在大腸桿菌中有效轉錄和有效翻譯?；虮磉_、合成有功能的蛋白質依賴于基因的有效轉錄、mRNA正確的翻譯和翻譯后加工。為了判斷某一待測DNA序列的生物活性，常采用報告基因（repor

39、ter gene）方法。報告基因（reporter gene）：是指處于待測基因下游并通過轉錄和表達水平來反映上游待測基因功能的基因，又稱報道基因。（一）原核細胞表達載體 原核細胞的表達載體主要是大腸桿菌表達載體。外源基因在原核細胞中表達需要重要調控元件。大腸桿菌表達載體是在克隆載體的基礎上導入表達系統(tǒng)調控元件：啟動子核糖體結合位點克隆位點轉錄終止信號。1.啟動子（promoter）：如乳糖啟動子（Lac）、色氨酸啟動子（Trp）、Tac啟動子（Trp-Lac）以及PL和PR啟動子等。序列 終止子（terminator）：一個基因的3末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶識別并停止轉錄

40、的功能。該序列含有一段富含A/T和富含G/C的回文對稱結構，終止子轉錄后形成的RNA具有莖環(huán)狀局部二級結構。1）非融合型表達載體pKK223-3。2）分泌型克隆表達載體PINlll系統(tǒng)。3）融合型表達載體pGEX系統(tǒng)（二）哺乳動物細胞表達載體真核表達載體的真核表達元件有：啟動子/增強子克隆位點終止位點和加polyA信號。1原核DNA序列：包括能在大腸桿菌中自身復制的復制子和抗藥基因的篩選標記。2啟動子：轉錄起始位點上游2530bp有富含AT的TATA框，TATA框的上游約100200bp處為上游啟動子元件。3增強子（enhancer）：是一類顯著提高基因轉錄效率的順式作用元件。4終止子和加po

41、lyA信號。三、穿梭載體 既能在原核細胞中復制、又能在真核細胞中復制，在原核和真核細胞分子克隆中均能應用的載體稱為穿梭載體（shuttle vector）。（一）穿梭粘粒載體：穿梭粘粒載體能攜帶真核DNA片段在細菌內擴增，并通過轉染進入哺乳動物細胞進行轉錄和表達。這類載體常用于研究目的基因表達調控的組織細胞特性以及它所編碼蛋白質的功能，也可從粘?；蚪M文庫中篩選出特殊功能基因。（二）酵母穿梭質粒載體：酵母復制型載體是穿梭質粒載體，它由酵母DNA片段插入到大腸桿菌質粒中構建而成，除有細菌質粒復制子和抗藥性標記外，還有酵母DNA片段提供的選擇標記，同時又攜帶了自主復制順序，由于該載體同時含有大腸桿

42、菌和酵母的自主復制基因，故能在兩種細胞中存在和復制。另外，由噬菌體、質粒與SV40病毒DNA元件也可構建成穿梭載體，Pac10重組病毒-質粒載體也是穿梭載體。 分子克隆的基本步驟 一、 目的基因的獲取 （一）從基因文庫中獲取 目的基因：指被研究的某一基因或DNA序列，即需要克隆或表達的基因?；蚪M文庫（genomic library，G-文庫）是指含有某種生物全部基因隨機片段的重組DNA克隆群。構建基因組文庫時，先將原核或真核細胞染色體DNA提純，通過機械或酶切使之成為一定大小的片段，將其與適當?shù)妮d體相連接，經(jīng)體外包裝、轉染細菌，得到一組含不同DNA片段的重組噬菌體顆粒。這個文庫中含有基因組內

43、全部基因片段，是一個貯存基因組全部序列的信息庫，故稱為G-文庫。轉染（transfection）是指以噬菌體、病毒或以它為載體構建的重組子導入細胞的過程。如以細胞全部mRNA經(jīng)逆轉錄，制備出全套cDNA建庫，則稱為C-文庫。（二）逆轉錄法 是應用得最多的獲取目的基因的方法。但前提是目的基因的序列已知，至少部分已知。選用富含目的基因mRNA的細胞作為實驗材料，有利于分離到目的基因。如胰島素基因的mRNA主要存在于胰腺組織，血紅蛋白基因的mRNA占網(wǎng)質紅細胞總mRNA的50%90%。用此法得到的目的基因進行克隆可獲得較完整的連續(xù)編碼順序，易在宿主細胞中表達及篩選。 （三）人工合成DNA片段 根據(jù)已

44、知某種基因的核苷酸序列或某種基因產物的氨基酸序列，可推導出為該多肽編碼的核苷酸短序列，再用DNA合成儀人工合成目的基因。此法適用于合成分子量較小的目的基因（100bp以內），如：人生長激素釋放因子、血管加壓素、干擾素、胸腺素及胰島素原的基因等。（四）直接從染色體DNA中分離目基因 根據(jù)染色體DNA的限制性內切酶圖譜，用適當?shù)南拗菩詢惹忻盖懈钊旧wDNA、分離目的基因。本方法較適用于制備原核生物目的基因，其原因為：（1）真核細胞染色體DNA有豐富的內含子，它們在原核細胞中轉錄后不能被剪接。（2）真核細胞的基因多數(shù)為單拷貝，難以分離到足夠量的目的基因。 二、 載體的選擇 噬菌體和粘性質粒載體常用來

45、構建基因組文庫；構建cDNA文庫和克隆較小DNA片段常用pUC系列等質粒；M13噬菌體則用于克隆一些待測的DNA序列。三、 目的基因和載體酶切與連接四、重組DNA導入受體細胞 細胞膜結構改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細胞稱謂感受態(tài)細胞(competent cell)。以質粒DNA或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程稱為轉化（transformation）。五、重組體的篩選和鑒定（一）遺傳標記表型特征篩選 1.抗生素抗性標記篩選 因大多數(shù)質粒載體帶有抗生素抗性標記的特征（如Ampr、Tetr等），當帶有完整抗性基因的載體轉化無抗性細菌后，被轉化的陽性菌獲得抗生素抗性基因而存活并形成

46、噬菌斑，未轉化菌不能存活，但應排除未重組的空載體。某些質粒載體如pBR322質粒中裝有Ampr和Tetr抗性基因，在含四環(huán)素和氨芐青霉素的平皿上都能夠生長的細菌只含有空載體，此篩選方法稱為雙抗生素對照篩選。2.-半乳糖苷酶基因失活篩選（藍白斑篩選）3.營養(yǎng)標記選擇: 當細胞生物合成途徑中某個酶的編碼基因失活后，該細胞成為營養(yǎng)缺陷型，如導入細胞的重組DNA能彌補缺陷的基因，那么，培養(yǎng)基中就不需補充有關的營養(yǎng)成分，由此可挑選出含重組DNA的陽性細菌。 （二）重組子結構特征的篩選1重組子大小鑒別篩選:從挑選的菌落中分別提取重組載體DNA和原載體DNA，用一種限制酶切消化后直接進行電泳，重組載體DNA

47、因分子量較大而遷移率較小。2酶切鑒定:根據(jù)已知外源基因兩端的酶切位點，分別用相應的兩種內切酶進行切割，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，可根據(jù)DNA mark來分析插入DNA片段的分子量。3PCR篩選法。4核酸雜交技術篩選：將DNA的克隆片段或轉化細菌平板轉移至硝酸纖維素薄膜上，應用特異性的核酸探針對其進行原位雜交，可篩選出陽性克隆。另外，還可通過斑點雜交和Southern blot雜交技術篩選 。在分子生物學領域，利用基因工程技術，大腸桿菌體內的基因50%以上已被定位，其DNA序列已被測出，基因表達調控關系也基本搞清。在真核生物中，利用基因工程的理論和技術已發(fā)現(xiàn)上百種癌基因和209余種抗癌基因，它們分別是

48、細胞增殖調控的正負信號。在發(fā)育生物學中精細胞的分化及受精過程所發(fā)生的變化，基因表達的發(fā)育調控的研究與基因工程技術的應用是密不可分的 基因工程的理論和技術對人類基因組計劃的實現(xiàn)具有重大作用，將對人類基因組作圖和測序，對于了解人類的全部基因構成，提供可資查的一個完美的基因信息庫，也為認識人類遺傳疾病和癌發(fā)病機理提供有價值的信息。 動植物基因工程 1.轉基因動物與蛋白制藥的生產 轉基因動物可以用來代替發(fā)酵罐生產一些珍貴的蛋白質。它的原理是使外來基因在動物乳腺中表達，從乳液中提取所要的蛋白質。英國的藥用蛋白公司用這種方法將轉基因綿羊來試行生產人類抗胰蛋白酶因子，在每升羊奶中可取得35克這種蛋白質。 2

49、.轉基因動物與動物改良。 3.轉基因動物與人類疾病治療 。 4.轉基因動物與基礎生物學研究。5.轉基因植物微生物基因工程和發(fā)酵工業(yè) 我國已有人干擾素、人白介素2、人集落刺激因子、重組人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹瀉疫苗等多種基因工程藥物和疫苗進入生產或臨床試用。世界上還有幾百種基因工程藥物及其它基因工程產品在研制中，成為當今農業(yè)和醫(yī)藥業(yè)發(fā)展的重要方向，將對醫(yī)學和工農業(yè)發(fā)展作出新貢獻。第5章 基因診斷基因在醫(yī)學中的應用 1、基因診斷目前應用最多的是：癥狀前診斷（疾病易感性）。產前診斷（羊水、臍帶血、絨毛膜）遺傳性疾病。著床（植入）前診斷。臨床診斷（國外已用于乳腺癌、結腸癌等）。意義：優(yōu)生優(yōu)育；確

50、定與疾病有關狀態(tài)（如易感性、抗藥性、發(fā)病類型及階段）；傳染病早期（產生抗體前）診斷及病毒攜帶者的檢出；分析基因型，使器官移植配型精確；法醫(yī)DNA鑒定。胚胎移植前遺傳病診斷 preimplantationgenetic diagnosis, PGD 是在體外受精（in-vitro fertilization, IVF）技術、分子生物學和顯微操作的基礎上，對受精三天后的胚胎在種植前，檢查其正常后再移植到子宮的一項新技術，也即所謂第三代試管嬰兒技術。一般在卵裂期，當胚胎發(fā)育到6-8個細胞階段，抽取1-2個細胞，進行遺傳疾病診斷。根據(jù)遺傳診斷結果，僅將正常胚胎移植至子宮?；蚝铜h(huán)境共同決定生物的性狀。

51、基因是內因；環(huán)境是外因。環(huán)境（外因)的干擾必須通過基因(內因)的作用來影響生物的性狀(如人的健康狀況)疾病與遺傳基因及環(huán)境之間的關系 任何疾病（外傷除外）都是遺傳與環(huán)境兩者相互作用所致。只是在不同的疾病中，兩者所起的作用不同。遺傳性疾病都與基因有關。心血管疾病、糖尿病、腫瘤都與多個基因缺陷有關。傳染性疾病主要是外部環(huán)境作用所致，如肝炎。雖然沒有肝炎病毒的感染不會得病，但是同樣得感染，不同的人表現(xiàn)不一樣而且感染得了肝炎，治療后的結果也大不相同。這些差別中的遺傳因素不容忽視。因而，不能說傳染病與遺傳無關?；虿》诸?單基因?。好系聽栠z傳性疾病，諸如：白化病、早老癥、血紅蛋白病、甲型血友病、囊性纖維

52、化病、脆性X綜合征等。多基因病或多因子復雜性狀疾?。耗[瘤、心腦血管疾病、代謝病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等。獲得性基因病：感染性病原體，諸如：HBV、HCV、HIV、HPV等。分子（基因）診斷的發(fā)展經(jīng)歷了三個階段：以DNA分子雜交技術為基礎的診斷方法開展遺傳病的基因診斷；以PCR技術為基礎的診斷方法開展獲得性基因?。ú≡⑸铮┑幕蛟\斷；以生物芯片（biochip）技術為代表的高通量密集型技術的診斷方法開展多基因多因素疾病的基因（分子）診斷。從傳統(tǒng)的DNA診斷發(fā)展到核酸及其表達產物（mRNA、蛋白質）的全面診斷與過程診斷。生物芯片（biochip）技術，將大量基因探針基因片段蛋白多肽按特

53、定的排列方式固定在玻片（硅片、塑料片）上，實現(xiàn)了高通量篩查。系統(tǒng)生物學（systems biology），推動分子診斷的快速發(fā)展以系統(tǒng)論的觀點、動態(tài)的觀點、多樣性的觀點和進化的觀點來分析結果重點，不是在個別核酸或蛋白質分子的序列及其功能。乳腺癌和卵巢癌是具有家族遺傳傾向的，約15-20%有家族史。與乳腺癌與卵巢癌遺傳密切相關是BRCA1和BRCA2基因。BRCA1和BRCA2基因的功能是控制細胞增生，當它們中任一基因發(fā)生突變將大大增加個體患乳腺癌和卵巢癌的機率，并導致個體的發(fā)病年齡明顯提前。分子診斷的臨床意義：不僅能夠對疾病作出早期診斷、確切診斷；而且還能確定個體歸于疾病的易感性以及疾病的分期

54、分型、療效監(jiān)測、預后判斷等。 感染性疾病的分子診斷： 獲得性基因病的分子診斷：流感病毒與各種流感；乙肝病毒DNA的檢測；乙肝病毒YMDD突變檢測；AIDS患者HIV的檢測；SARS與SARS冠狀病毒流感病毒屬于有包膜的單鏈RNA病毒，易于變異。甲型和乙型流感病毒的基因組由8個單獨的單鏈RNA片段組成。丙型流感病毒的基因則由7個RNA片段組成，每個RNA片段編碼12個多肽。病毒變異及機制：點突變（antigen drift，抗原性漂移）RNA病毒的RNA聚合酶缺乏校正機制，其核酸復制的錯誤頻率高達萬分之一?；蚪粨Q（genetic shift，抗原性轉換）病毒基因組由8個負向RNA基因片段組成，

55、復制過程中易發(fā)生基因重配。1.分子診斷方法 可采用RT-PCR、FQ-PCR檢測流感病毒RNA所用引物常按流感病毒保守的非結構基因NS基因序列設計。2.臨床意義 （1）流感病毒的診斷過去主要靠雞胚羊膜腔培養(yǎng)和血清學血凝抑制試驗，這些方法比較費時，靈敏度低，且難以作出早期診斷（2）PCR法敏感、特異、簡便、快速，適合于流感病毒的臨床檢測、分型和流行病學調查。HBV DNA檢測的臨床意義 1.診斷方面：1）HBV_DNA是HBV存在最直接的依據(jù)；2）是HBV復制的標志；3）是患者具有傳染性的標志。2.療效判斷：HBV_DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標。3）預后判斷：HBV_DNA水平

56、與病情有一定的關系。乙肝病毒YMDD突變檢測 拉米夫定(Lamivudine)：硫代脫氧胞嘧啶（2-deoxy-3-thiacytidine，3TC）；核苷類似物；口服抗病毒藥物。作用：降低HBVDNA的濃度；改善肝臟組織的病變；可能阻斷肝纖維化的進程，終止肝硬化的發(fā)展。不受人種、病毒感染的模式、野生型或基因組前C區(qū)突變的影響；口服，副作用小。YMDD突變檢測常見方法 1.基因測序法(最好的)2.熒光定量PCR方法。 熒光定量PCR檢測YMDD 基本原理：確定探針特定的TM值來區(qū)分是否突變。常用方法：覆蓋突變位點熒光雙探針雜交的方法檢測YMDD。TM值：在核酸加熱變性過程中，當雙鏈DNA解鏈到

57、一半時所對應的溫度就是該核酸的TM值，也叫核酸的熔點。每種不同的核酸有不同的TM值。影響TM值的主要因素：1.堿基中GC含量，含量越高，TM越大。2.核酸的長度，核酸越長，TM越大。3.完全配對比不完全配對時TM值要大。HBV在體內的復制過程是一個逆轉錄過程?？共《緳C制；競爭性阻斷逆轉錄酶（依賴RNA的DNA多聚酶）活性，有效地抑制HBV的復制；進入細胞的拉米夫定在激酶的作用下可被磷酸化為三磷酸脫氧胞苷，可以與dCTP競爭性摻入延伸的DNA，因它缺乏3羥基而使復制的病毒DNA鏈終止。HIV基因組結構 基因結構組為RNA雙分子，與其他逆轉錄病毒基本相同。5端有帽子結構，3端有poly(A)結構。

58、逆轉錄病毒共同的結構基因和側翼末端重復順序（long terminal repeats，LTRs）等。LTRs不編碼任何蛋白，可起始其他病毒基因的表達，無種屬特異性，LTR含調控病毒基因表達的DNA序列，分別位于HIV基因組的兩端。參與基因表達的調節(jié)基因。調控病毒的感染性，成熟或釋放的基因。HIV分子診斷1.分子診斷方法（1）PCR：盡管HIV是RNA病毒，但其感染細胞后會自我反轉錄成cDNA，并整合到宿主細胞基因組中復制，故可用感染細胞的DNA為模板進行PCR擴增，從而進行診斷。PCR擴增時需選擇病毒基因組中的高度保守序列作為引物，如gag、LTR、tat、env和pol區(qū)段中的保守區(qū)。PCR法：特別適用于無癥狀HIV感染者。（2）病毒載量檢測：對感染者體內HIV RNA