應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)從枳中篩選根特異表達(dá)基因

1、園藝學(xué)報(bào)，（）： 2014411224812488 http: / www. ahs. ac. cn acta horticulturae sinica e-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140722；修回日期：20141102 基金項(xiàng)目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（cars-27）；國家高技術(shù)研究發(fā)展（863）計(jì)劃課題（2011aa100205）；重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目（cstc2013jcyja8）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（xdjk2013c104，xdjk2014a018） * author for correspondencee-m

2、ailchenshanchun 應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)從枳中篩選根特異表達(dá)基因 姚利曉，何永睿，許蘭珍，雷天剛，彭愛紅，鄒修平，陳善春* （中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，國家柑桔工程技術(shù)中心，國家柑桔品種改良中心，重慶 400712） 摘 要：為篩選分離植物根組織特異表達(dá)基因，以枳根rna為試驗(yàn)組，葉rna為驅(qū)動(dòng)組，構(gòu)建了枳根消減文庫。從該消減文庫中共獲得有效序列1 177個(gè)，其片段長度主要分布在200 500 bp；序列拼接后得到455個(gè)非重復(fù)序列，其中245個(gè)與已知基因匹配，具有結(jié)合功能、催化活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性等生物學(xué)功能，可參與植物的代謝、細(xì)胞生長、個(gè)體發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過程。實(shí)時(shí)定量pcr

3、檢測結(jié)果顯示這些基因中的主要乳液蛋白、早期結(jié)瘤素樣蛋白和貝殼杉烯酸氧化酶等基因在根中高表達(dá)。 關(guān)鍵詞：枳；根特異表達(dá)基因；抑制性消減雜交技術(shù)；定量pcr 中圖分類號：s 666 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：a 文章編號：0513-353x（2014）12-2481-08 identification of root-specific genes with subtractive suppression hybridization from poncirus trifoliate yao li-xiao，he yong-rui，xu lan-zhen，lei tian-gang，peng ai-hong，zou

4、 xiu-ping，and chen shan-chun* （citrus research institute，chinese academy of agricultural sciences；national citrus engineering research center；national citrus improvement center，chongqing 400712，china） abstract：a suppression subtractive hybridization（ssh）library of poncirus trifoliata was successfull

5、y constructed for screening the citrus root-specific genes by using the root rna as driver and the leaf one as tester. of 1 362 sequenced clones，1 177 ests（expressed sequence tags）in good quality were acquired from the ssh library and assembled into 455 unigenes. among them，245 unigenes were homolog

6、ous with the genes in genbank database，which have biology function such as catalytic activity，transporter activity，carrier activity and so on. they play the important roles in biology process such as metabolic process，cellular process，developmental process，response to stimulus and so on. the 17 gene

7、s were further analyzed by real-time pcr and confirmed that they were highly expressed in the roots，but very low in the leaves. bioinformatic analysis indicated that they are the major latex protein gene，the early nodulin-like protein gene，the ent-kaurenoic acid oxidase gene and etc. key words：ponci

8、rus trifoliata；root-specific gene；the suppression subtractive hybridization library； quantitive pcr 通信作者（：）致謝：感謝西南大學(xué)趙曉春研究員在論文寫作過程中提出的中肯建議。 2482 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 根系是植物獲取水分和營養(yǎng)的主要器官，近年來根系特異表達(dá)基因的鑒定及其功能分析成為研究的熱點(diǎn)，包括脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因mtn5（pii et al.，2009）、葡糖硫苷酶基因cptgg2（wang et al.，2009b）、生物防御基因mic-3（buriev et al.，2010）、細(xì)胞

9、壁松弛蛋白基因expb（won et al.，2011）、信號傳遞蛋白（wall-associated receptor-like kinases）基因waks（kaur et al.，2013）、細(xì)胞壁形成相關(guān)的胼胝質(zhì)合酶基因gsl8（劉林 等，2013）、植物抗非生物壓力交替氧化酶（alternative oxidase）基因aox（mhadhbi et al.，2013）等。并且根特異性啟動(dòng)子對作物改良具有重要的價(jià)值，尤其在植物抗病蟲害、耐鹽堿、耐旱，以及提高和改善食根性植物產(chǎn)量、營養(yǎng)成分等方面有突出的應(yīng)用價(jià)值，一些根特異性表達(dá)啟動(dòng)子，如atpky10（li et al.，2009）、r

10、cc3（jeong et al.，2010）、pspr10（xu et al.，2010）、atmdk4-20（lilley et al.，2011）、atnrt21（kong et al.，2013）等已經(jīng)被應(yīng)用于植物的轉(zhuǎn)基因研究中。但相對于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和其它組織特異性啟動(dòng)子，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用的根系特異性啟動(dòng)子的種類仍然較少（李鳳龍 等，2012）。 枳（poncirus trifoliata）是應(yīng)用最廣泛的柑橘砧木品種之一。目前已從枳中克隆出耐低溫相關(guān)的ptcbf（wang et al.，2009a）、ptrhos1（liu et al.，2010）和ptcorp（long et al.，2

11、012）等基因， 以及與耐干旱相關(guān)的基因ptrabf（huang et al.，2010）、ptrmapk（huang et al.，2011）和ptadc （wang et al.，2011）等。然而，從利用根系抗逆性的角度來說，研究根系特異表達(dá)基因的種類和功能更有意義。本研究中以枳根系的rna為試驗(yàn)組、葉片rna為驅(qū)動(dòng)組構(gòu)建了根消減cdna文庫，以期獲得根中特異表達(dá)基因的信息，為組織特異表達(dá)基因的篩選及根特異性啟動(dòng)子的克隆和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1.1 材料 于2011年秋季采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所“國家果樹種質(zhì)（重慶）柑橘圃”，種子用八按照植物總rna（小量）抽提試劑盒（上

12、海華舜生物技術(shù)有限公司，商品1.2 構(gòu)建根消減cdna文庫 rna為模板，應(yīng)用super smarttm pcr cdna synthesis kit （clontech，cat.生工生物工程（上海）股份有限公司測序。去除載體序列和枳果實(shí)羥基喹啉處理后，置于濕潤的無菌濾紙上發(fā)芽，待芽長至1 cm時(shí)移栽至營養(yǎng)土中。長出5 6片復(fù)葉時(shí)取出植株，剪取頂端第3片葉或幼嫩根，在自來水下沖洗干凈，用depc水處理，無菌濾紙吸干表面的水后液氮凍存。 稱取100 mg根或葉組織，號 w7021）說明書提取枳根rna。在第1次加入去蛋白液離心后，加入dnase（rnase-free）在37 處理30 min，再

13、次用去蛋白液處理，以去除樣品中的dna。所提rna應(yīng)用紫外分光光度儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測。 分別以1 g枳根和葉的總 no. 635000）按照ld-pcr方法合成cdna，pcr擴(kuò)增24個(gè)循環(huán)。以所獲得的根cdna為試驗(yàn)組，葉cdna為驅(qū)動(dòng)組，按照pcr-selecttm cdna subtraction kit（clontech，cat. no. 637401）試劑盒說明書進(jìn)行rsa酶切消化、接頭連接、雜交、pcr擴(kuò)增等操作；采用actin基因引物（劉小豐 等，2011），用pcr檢測雜交效率，分別在18、23、28、33個(gè)循環(huán)取pcr產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測。利用dna回收試劑盒（北京三博遠(yuǎn)

14、志）回收第2次pcr差減產(chǎn)物連接到pgem-t easy載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌jm109，挑取白斑測序。 將根消減文庫全部1 362個(gè)白色克隆送接頭序列，將長度大于150 bp的ests利用dnastar軟件進(jìn)行拼接，獲得unigenes。利用blast2go12期 姚利曉等：應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)從枳中篩選根特異表達(dá)基因 2483 （版本v.2.7.0）等軟件進(jìn)行生物學(xué)功能注釋和分類，并利用blastn在柑橘功能基因數(shù)據(jù)庫（http：/bioinfo.ibmcp.upv.es/ genomics/cfgpdb/）中進(jìn)行同源搜索。 1.3 定量pcr分析 反轉(zhuǎn)錄用primescript rt

15、 reagent kit購自寶生物工程（大連）有限公司（takara code：drr表1 所用列 table 1 preriments 基因 unigene 引物 primer 正向序列向序列 reverse sequence 037a），定量pcr按照sybr premix ex taqtm（takara code：drr420a）說明書操作，所用引物（表1）由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。定量pcr的反應(yīng)條件為95 預(yù)變性90 s；95 10 s，61 20 s，72 20 s，共40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析產(chǎn)物的特異性。3次生物學(xué)重復(fù)，采用ct法分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確定各基因在

16、根和葉中的相對表達(dá)量。 引物序imers used in the exp forward sequence 反contig 1 c1f/c1r 5-tgatcgcagttgcggacgact -3 aacccca-3 5-agggaccccaatgatgacontig 8 c8f/c8r 5-acgcggggaaaccagaagcaaa-3 3 -3 -3 2 5-agtccaaccctccgaccactcat-3 contig 12 c12f/c12r5-tgtgatagctcatgggccaaat-3 5-attctcaggggcagagtggg-3 a-contig 22 c22f/c2

17、2r 5-gctttgggggatgatgggcttcg-35-tcaagccattccgaagggtgaaccontig 28 c28f/c28r 5-actaccagagctgcagggcttca-3 5-cttcaagccagcttcgcaatggc-3 contig 38 c38f/c38r 5-tgcctggagtagtctgcgcac-3 5-tcggtcccccttttcgtgaacc-3 ccontig 54 c54f/c54r 5-agccagaaccttcccatgccaa-35-agtgaggtcaccggattcactcttcontig 56 c56f/c56r 5-c

18、gctgaggaaagctaaggaggagc5-acggtgacagattggtcatgcgt-3 singleton 5s52f/s52r 5-tgcctacaacaaggccctccga-3 5-ggccgcatatgtaatgcgcg-3 3 singleton 60 s60f/s60r 5-ccatgttgagggcgaagtgtcac-35-cagggccaagaatttgtgtgggcsingleton 73 s73f/s73r 5-tgaaggcacagcaacatgcgt-3 -35-tccaaaactcaaccttgcagcca-3 singleton 86 s86f/s8

19、6r 5-gatgatggcagtttggtgcactgg5-ggcctacggctgctgagaaagg -3 singleton 169 s169f/s169r5-tgcgttcgatttggaacccacc-3 5-ttgcagcgatgggatcaccga-3 singleton 247 s247f/s247r 5-ctacccaccccatccgactggg-3 5-ctgctttgcaaggtggcatgcc-3 singleton 265 c265f/c265r 5-gcttgtggcttggacgccaaac-3 5-cccagtaggaccacctccaccat-3singl

20、eton 283 s283f/s283r 5-ttccacgcctttgaagatggggc-35-cagcggcttgttgatgttggtgg-3 singleton 297 s297f/s297r 5-tgacagtgcctggtttcccccat-3 5-gtgcttagctgcaggccacacc-3 actin actin1/actin2 5-catccctcagcaccttcc-3 5-ccaaccttagcacttctcc-3 2 結(jié)果與分析 2.1 cdna消減文庫序列分析結(jié)果 的消減效率進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)消減cdna在pcr擴(kuò)增至33個(gè)循環(huán)時(shí)行測序，共計(jì)1 362個(gè)。去除載體序

21、列和片段小于150 bp的序體過程、生物學(xué)調(diào)以看家基因actin對根消減文庫都未發(fā)現(xiàn)目的條帶，而未消減的cdna在23個(gè)循環(huán)時(shí)即可檢測到actin的表達(dá)（圖1），表明本次構(gòu)建的枳根消減文庫消減效率較高。 通過藍(lán)白斑篩選，挑取全部白色克隆進(jìn)列，獲得有效序列1 177個(gè)，其片段長度主要分布在200 500 bp。利用dnastar軟件進(jìn)行序列拼接，獲得455個(gè)unigenes，其中包含contigs 121個(gè)、singletons 334個(gè)。利用blast2go軟件對unigenes序列進(jìn)行同源搜索（blastx，e 1.0e-6）和功能注釋，有245個(gè)unigenes可與已知基因的氨基酸序列匹配

22、，這些基因多來源于柑橘及其近緣屬植物，占比對上基因的87.3%，如克利曼?。╟itrus clementina）同源基因206個(gè)、甜橙（c. sinensis）4個(gè)、枳（p. trifoliata）2個(gè)、枸櫞（c. medica）1個(gè)、酸橙（c. aurantium）1個(gè)；另有193個(gè)unigenes無任何比對信息。 基因功能歸類結(jié)果表明，這些基因主要涉及一些代謝過程、細(xì)胞過程、單個(gè)有機(jī)節(jié)、定位、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞成分構(gòu)成、發(fā)育過程、多細(xì)胞有機(jī)體過程和信號傳遞等；從生物學(xué) 2484 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 功能看，主要涉及一些結(jié)合功能、催化活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性等；這些基因編碼蛋白主要存在于細(xì)胞和細(xì)胞器結(jié)

23、構(gòu)中，有部分存在于細(xì)胞膜和大分子復(fù)合體中，少數(shù)位于細(xì)胞間隙和膜封閉腔內(nèi)（圖2）。 圖1 根消減文庫效率檢測 fig. 1 reduction of actin abundance by pcr-select subtraction 2.2 定量pcr結(jié)果 455genes在柑橘功能基因計(jì)劃（citrus functional genomics project，cfgp）的est數(shù)搜索，發(fā)現(xiàn)有14個(gè)unigenes與cfgp中根來源的ests匹配較多，將這14個(gè)unig圖2 枳消減文庫特異性表達(dá)unigenes go分類結(jié)果 生物學(xué)過程：1. 代謝過程，2. 細(xì)胞過程，3. 單個(gè)有機(jī)體過程，4.

24、 生物學(xué)調(diào)節(jié)，5. 定位，6. 應(yīng)激反應(yīng)，7. 細(xì)胞成分構(gòu)成，8. 發(fā)育過程， 9. 多細(xì)胞有機(jī)體過程，10. 信號傳遞，11：14. 結(jié)合功能，15. 催化活性， biologiccess：ation，6. response to stimulus，7. cellular cignaling，11. growth， . 生長過程，12. 繁殖過程，13. 多個(gè)有機(jī)體過程；分子功能16. 轉(zhuǎn)運(yùn)活性，17. 電子傳遞，18. 轉(zhuǎn)錄因子，19. 分子修飾，20. 抗氧化活性，21. 結(jié)構(gòu)分子，22. 受體，23. 酶活調(diào)節(jié)； 細(xì)胞組分：24. 細(xì)胞，25. 細(xì)胞器，26. 細(xì)胞膜，27. 大分子復(fù)

25、合體，28. 細(xì)胞間隙，29. 膜封閉腔。 fig. 2 distribution of differentially expressed unigenes according to the go consortium al pro1. metabolic process，2. cellular process，3. single-organism process，4. biological regulation，5. localizomponent organization，8. developmental process，9. multicellular organismal proces

26、s，10. s12. reproduction，13. multi-organism process；molecular function：14. binding，15. catalytic activity，16. transporter activity， 17. electron carrier activity，18. nucleic acid binding transcription factor activity，19. molecular transducer activity， 20. antioxidant activity，21. structural molecule

27、activity，22. receptor activity，23. enzyme regulator activity； cellular component：24. cell，25. organelle，26. membrane，27. macromolecular complex， 28. extracellular region，29. membrane-enclosed lumen. 將個(gè)uni據(jù)庫中進(jìn)行blastnenes和另外3個(gè)隨機(jī)選擇的unigenes contig 38、singleton 86和singleton 265進(jìn)行定量pcr分析，發(fā)現(xiàn)其在根中的表達(dá)量高于葉中的表

28、達(dá)（表2）。這一研究結(jié)果一方面提示cfgp中est數(shù)據(jù)可作為基因組織表達(dá)的初步判斷標(biāo)準(zhǔn)，另一方面，contig 38、singleton 86和singleton 265的組織表12期 姚利曉等：應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)從枳中篩選根特異表達(dá)基因 2485 達(dá)分析結(jié)果豐富了cfgp的數(shù)據(jù)。 table 2 表2 部分unigenes定量pcr結(jié)果 the real time pcr result of partial unigenes ests數(shù) rent tissues in cfgp cfgp中不同組織來源est numbers from diffe基因 unigene 注釋 nr_annot

29、ation ne 果實(shí) fruit 根中相對表達(dá)倍數(shù)（葉為1） relative fold 根 葉 離層 root leaf abscission zoexpression in root contig 1 白 dna binding protein dna結(jié)合蛋16 0 0 1 16.14 contig 8 抗酒石酸酸性磷酸酶 tartrate-resistant acid phosphatase type 5 otein contig 22 6 0 0 0 19.81 contig 28 ng protein 3 0 0 0 117.57 contig 38* 0 0 0 0 14.50

30、ck protein cid oxidase singleton 52 ase 1 0 0 0 129.66 singleton 60 e p450 2 0 1 1 2.71 e protein amily protein singleton 169 1 0 1 1 2.75 protein singleton 265* ette 0 0 0 0 4.29 rotein 213 1 1 1 3.97 contig 12 衰老相關(guān)蛋白 senesence-associated pr2 0 0 1 3.22 主要乳液蛋白 major latex protein 藍(lán)銅結(jié)合蛋白 blue copper

31、-bindi未知蛋白 unknowncontig 54 熱休克蛋白 calmodulin-binding heat-sho1 0 0 0 3.75 contig 56 貝殼杉烯酸氧化酶 ent-kaurenoic a1 0 0 1 10.77 貝殼杉烯酸氧化酶 ent-kaurenoic acid oxid細(xì)胞色素p450 cytochromsingleton 73 低溫誘導(dǎo)蛋白 low temprature induced-lik9 4 0 4 2.90 singleton 86* bet v i家族蛋白 bet v i allergen f0 0 0 0 16.88 細(xì)胞色素p450 cy

32、tochrome p450 singleton 247 14-3-3蛋白 14-3-34 1 2 0 2.03 atp結(jié)合盒 atp-binding casssingleton 283 甲基轉(zhuǎn)移酶 o-methyltransferase 1 8 1 1 5 72.47 singleton 297 主要乳液蛋白 major latex p0 0 1 1 46.37 * 隨機(jī)選擇。 electio3 通過構(gòu)建枳根的消減文庫，并進(jìn)一步應(yīng)用定量pcr分析，得到在根中高表達(dá)的基因，要乳液蛋白基因contig 22、藍(lán)銅結(jié)合蛋白基因contig 28、貝殼衫烯酸氧化酶基因contig 56和singl植物

33、，如擬南芥、煙草、甜椒、桃、樹莓、草莓、甜瓜、黃瓜和大豆中也分離出主要* random sn. 討論 本研究中如主eton 52等。 主要乳液蛋白最先在罌粟的乳液中發(fā)現(xiàn)（nessler et al.，1985），因是罌粟乳液中的主要蛋白而得名。隨后在其它乳液蛋白基因。隨著植物基因組學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)植物主要乳液蛋白基因包含不同的家族成員。有研究顯示主要乳液蛋白與植物發(fā)育相關(guān)，在花、果實(shí)或根中特異表達(dá)，受順式肉桂酸、乙烯的誘導(dǎo)（aggelis et al.，1997；kloos et al.，2002；ruperti et al.，2002；dowd et al.，2004；wu et al.，20

34、08；guo et al.，2011）。主要乳液蛋白參與植物對生物或非生物逆境的防御反應(yīng)，在高鹽、低溫、干旱、強(qiáng)光和黑暗等非生物逆境下，其表達(dá)量在短期內(nèi)迅速提高（nam et al.，2003；hwang et al.，2004；kimbrough et al.，2004；chen & dai，2010；sun et al.，2010）；在病原物誘導(dǎo)下主要乳液蛋白基因的表達(dá)增強(qiáng)，與植物的抗病性相關(guān)（chen & dai，2010）。本研究中在枳根消減文庫中篩選出主要乳 2486 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 液蛋白基因，其在根中的表達(dá)量是葉中的46倍，表明該基因可能在根中特異性高表達(dá)。 藍(lán)銅結(jié)合蛋白

35、是一種廣泛存在于微生物和植物中的古老超蛋白家族，能結(jié)合型銅離子。植物藍(lán)銅結(jié)合蛋白超家族由質(zhì)體蘭素和 phytocyanins（pcs）兩個(gè)蛋白家族組成，它們間氨基酸序列相似性 et al.，2001）。貝殼杉烯，也可為下一步根特異性啟動(dòng)子的克隆提供參考。 aggela，john i，karvouni z，grierson d. 1997. characterization of two cdna clones for mrnas expressed during ripening of melon（cucumis . plant molecular biology，33：313322. gen

36、e family in upland cotton（gossypium hirsutum l.）. theoretical and applied chen873. um f. sp. vasinfectum. molecular plant-microbe interactions，17：654667. gene sequence. plant molecular biology，75：guo ular biology，75：481495. 較低（小于20%），但該超家族蛋白均含有1個(gè)二硫鍵，能夠形成8個(gè)折疊結(jié)構(gòu)。pcs蛋白家族分為4個(gè)亞家族：漆樹藍(lán)蛋白（stellacyanins）、質(zhì)體蘭

37、素（plantacyanins）、花青苷（uclacyanins） 和早期結(jié)瘤素樣蛋白（early nodulin-like proteins，enodls）。目前已從大白菜、水稻等植物的基因組中分別鑒別出84個(gè)和62個(gè)pcs編碼基因（ma et al.，2011；li et al.，2013）。pcs在植物的抗逆過程中具有重要作用，參與非生物脅迫，如干旱、鹽害、低溫、金屬離子等的反應(yīng)過程（ruan et al.，2011；wu et al.，2011）。但藍(lán)銅結(jié)合蛋白的功能特別是早期結(jié)瘤素樣蛋白的功能研究甚少，本研究中發(fā)現(xiàn)的contig 28編碼早期結(jié)瘤素樣蛋白，尚未在柑橘中發(fā)現(xiàn)相關(guān)的報(bào)道。

38、 貝殼杉烯酸氧化酶屬于細(xì)胞色素p450（cyp450）蛋白家族中的cyp88a亞家族，是赤霉素合成過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，催化貝殼衫烯酸到ga12的三步反應(yīng)過程（helliwell酸氧化酶的研究多限于突變體，玉米dwarf3基因是該亞家族第1個(gè)被克隆的基因（winkler & helentjaris，1995），隨后從擬南芥、大麥和豌豆中也克隆出該基因（helliwell et al.，2001；davidson et al.，2003）。不僅貝殼杉烯酸氧化酶基因核苷酸序列的突變會造成植株的矮化，最近研究發(fā)現(xiàn)貝殼杉烯酸氧化酶表達(dá)水平的變化也會對植物的株形造成影響，形成矮化變異株（歐春青 等，201

39、3）或影響花序的發(fā)育（guo et al.，2012）。貝殼杉烯酸氧化酶基因在植物不同組織和不同發(fā)育階段表達(dá)，目前發(fā)現(xiàn)向日葵貝殼杉烯酸氧化酶基因hakao2主要在根中表達(dá)（fambrini et al.，2011）。本研究中也發(fā)現(xiàn)兩個(gè)在枳根中高表達(dá)的貝殼杉烯酸氧化酶基因singleton 52和contig 56，其在根中的表達(dá)量分別是葉中的130和11倍，同時(shí)在根的消減文庫中也發(fā)現(xiàn)其它的p450蛋白，但其組織表達(dá)特性尚未進(jìn)行深入研究。 本研究中通過構(gòu)建枳根的消減文庫，發(fā)現(xiàn)大量根中高表達(dá)基因，這不僅為柑橘基因工程育種豐富了候選的外源功能基因 references is melo l.）frui

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