微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)-上課用

1、到目前為止，到目前為止， 幾十項(xiàng)幾十項(xiàng)Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，化學(xué)獎(jiǎng)生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，化學(xué)獎(jiǎng) 都與微生物學(xué)有關(guān)都與微生物學(xué)有關(guān)微生物的類群微生物的類群原生生物：原生生物：原核生物原核生物:真菌真菌:病毒病毒:如酵母菌如酵母菌單細(xì)胞的動(dòng)植物單細(xì)胞的動(dòng)植物如草履蟲、單細(xì)胞藻類等如草履蟲、單細(xì)胞藻類等微生物包含了除微生物包含了除植物界植物界和和動(dòng)物界動(dòng)物界以外的所有生物以外的所有生物無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞真核細(xì)胞細(xì)菌、藍(lán)藻細(xì)菌、藍(lán)藻原核細(xì)胞原核細(xì)胞微生物的分類微生物的分類課題1 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)1.提供營(yíng)養(yǎng)和條件2.防止污染一一. .培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：微生物生存的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)微生物生存的環(huán)境

2、和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)1.1.基本成分：基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、無(wú)機(jī)鹽碳源、氮源、水、無(wú)機(jī)鹽碳源碳源無(wú)機(jī)碳源：無(wú)機(jī)碳源：有機(jī)碳源：有機(jī)碳源：COCO2 2、COCO3 32 2- -、HCOHCO3 3- -牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物氮源氮源無(wú)機(jī)氮源：無(wú)機(jī)氮源：有機(jī)氮源：有機(jī)氮源：NHNH4 4、NONO3 3- -牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等等注：含注：含CHONCHON的的有機(jī)物有機(jī)物是是異異養(yǎng)型微生物的養(yǎng)型微生物的碳源碳源、氮源氮源、能源能源一一. .培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：微生物生存的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)微生物

3、生存的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)1.1.基本成分：基本成分：碳源、氮源、水、無(wú)機(jī)鹽碳源、氮源、水、無(wú)機(jī)鹽2.2.特殊營(yíng)養(yǎng)：特殊營(yíng)養(yǎng)：維生素、堿基等維生素、堿基等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）3.pH3.pH、氧氣的需求：、氧氣的需求：4.4.種類：種類：固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基有有無(wú)無(wú) 凝固劑瓊脂凝固劑瓊脂分離分離 鑒定鑒定工業(yè)工業(yè) 生產(chǎn)生產(chǎn)化學(xué)成分：化學(xué)成分：物理性質(zhì)：物理性質(zhì)：天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。1000ml10

4、00ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g瓊脂瓊脂20.0g分析營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成？分析營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成？5. 5. 配制原則配制原則目的明確：目的明確：營(yíng)養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當(dāng)營(yíng)養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當(dāng)適宜的適宜的pHpH值：值：有機(jī)碳源有機(jī)碳源異養(yǎng)型：異養(yǎng)型：根據(jù)微生物的根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的種類、培養(yǎng)目的選擇原料選擇原料自養(yǎng)型：自養(yǎng)型： 不加碳源不加碳源加入緩沖劑加入緩沖劑細(xì)菌偏堿，真菌偏酸細(xì)菌偏堿，真菌偏酸（COCO2 2作為碳源）作為碳源）生產(chǎn)生產(chǎn)科研科研生產(chǎn)生產(chǎn)科研科研 有些細(xì)菌在一定的條件下

5、，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做體，叫做芽孢芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3 3小時(shí)以小時(shí)以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時(shí)候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個(gè)細(xì)菌度、水分適宜）的時(shí)候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個(gè)細(xì)菌. .芽孢（胞）芽孢（胞）耐高溫需保持干燥的耐高溫需保持干燥的 物品，物品，160170 1

6、2小時(shí)小時(shí)接種環(huán)、接種針等接種環(huán)、接種針等 金屬用具金屬用具7075、30min 80、15min100、56min消毒消毒滅菌滅菌定義定義方法方法較為較為溫和溫和理化方法，理化方法，殺死殺死部分有害菌體部分有害菌體（不不包括芽孢、孢子）包括芽孢、孢子）強(qiáng)烈強(qiáng)烈的理化方法，的理化方法，殺死殺死所有微生物所有微生物（包括（包括芽孢、孢子芽孢、孢子）煮沸消毒法煮沸消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑化學(xué)藥劑紫外線紫外線灼燒滅菌灼燒滅菌干熱滅菌干熱滅菌酒精、氯氣、石炭酸等酒精、氯氣、石炭酸等高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，100KPa、121、1530min二二. .無(wú)菌技術(shù)：無(wú)菌技術(shù)：獲得純

7、凈培養(yǎng)物關(guān)鍵是防止外來(lái)雜獲得純凈培養(yǎng)物關(guān)鍵是防止外來(lái)雜菌的污染菌的污染1.1.消毒與滅菌：消毒與滅菌：請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。（1 1） 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2 2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管玻棒、試管、燒瓶和吸管（3 3） 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手實(shí)驗(yàn)操作者的雙手2.2.無(wú)菌范圍：無(wú)菌范圍：實(shí)驗(yàn)操作空間消毒實(shí)驗(yàn)操作空間消毒操作者的手、衣著消毒操作者的手、衣著消毒實(shí)驗(yàn)用具和培養(yǎng)基等滅菌實(shí)驗(yàn)用具和培養(yǎng)基等滅菌實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程二二. .無(wú)菌技術(shù)：無(wú)菌技

8、術(shù)：防止外來(lái)雜菌的污染防止外來(lái)雜菌的污染1.1.消毒與滅菌：消毒與滅菌：酒精燈旁操作酒精燈旁操作超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)單個(gè)單個(gè)或少數(shù)菌體或少數(shù)菌體2.2.特征：特征：大小、形狀、光澤度、大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。顏色、透明度等。3.3.功能：功能：1.1.定義：定義：三三. .菌落菌落鑒定菌種鑒定菌種的重要依據(jù)的重要依據(jù)固體固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上大量繁殖大量繁殖子細(xì)胞群體子細(xì)胞群體1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O 定容至定容至1000mlNaCl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g瓊脂瓊脂20.0g四四. .大腸桿菌的純化培養(yǎng)：大腸桿

9、菌的純化培養(yǎng)：制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.1.計(jì)算：計(jì)算：培養(yǎng)基用量培養(yǎng)基用量依配方計(jì)算各成分的用量依配方計(jì)算各成分的用量2.2.稱量：稱量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙牛肉膏、稱量紙 、少量水加熱溶解、少量水加熱溶解 取紙取紙蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl瓊脂瓊脂 補(bǔ)水定容補(bǔ)水定容4.4.調(diào)調(diào)pHpH、分裝、封口：、分裝、封口：5.5.滅菌：滅菌：6.6.倒平板：倒平板：培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿分散成單個(gè)細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞, ,形成單個(gè)菌落形

10、成單個(gè)菌落約約50防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染灼燒滅菌，灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基二二. .大腸桿菌的純化培養(yǎng)：大腸桿菌的純化培養(yǎng)：制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基純化大腸桿菌：純化大腸桿菌：平板劃線法：平板劃線法：菌種菌種劃劃3 3個(gè)平板個(gè)平板1 1個(gè)不劃線個(gè)不劃線1.1.接種：接種：接種環(huán)接種環(huán)防止劃破培養(yǎng)基防止劃破培養(yǎng)基（重復(fù)實(shí)驗(yàn)）（重復(fù)實(shí)驗(yàn)）（空白對(duì)照）（空白對(duì)照）6 6支試管，分別加入支試管，分別加入9ml9ml無(wú)菌水無(wú)菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051

11、ml106稀釋涂布平板法：稀釋涂布平板法：a.a.梯度稀釋菌液：梯度稀釋菌液：菌液菌液微量微量 移移液器液器稀釋涂布平板法：稀釋涂布平板法：a.a.梯度稀釋菌液：梯度稀釋菌液：b.b.涂布平板：涂布平板：不超過(guò)不超過(guò)0.1ml0.1ml各梯度分別涂布各梯度分別涂布3個(gè)平板個(gè)平板1 1個(gè)不涂布作空白對(duì)照個(gè)不涂布作空白對(duì)照滴滴灼灼試試涂涂稀稀釋釋10103 3倍倍稀稀釋釋10104 4倍倍稀稀釋釋10105 5倍倍平板劃線法：平板劃線法：二二. .大腸桿菌的純化培養(yǎng)：大腸桿菌的純化培養(yǎng)：制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基純化大腸桿菌：純化大腸桿菌：1.1.接種：接種：稀釋涂布平板

12、法：稀釋涂布平板法：2.2.培養(yǎng)：培養(yǎng)：將將接種后接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種未接種的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基放入放入3737恒溫箱中培養(yǎng)恒溫箱中培養(yǎng)12h12h24h24h后，后，觀察并記錄觀察并記錄三三. .菌種的保藏：菌種的保藏：1.1.臨時(shí)保藏：臨時(shí)保藏： 試管固體斜面培養(yǎng)基上試管固體斜面培養(yǎng)基上442.2.長(zhǎng)期保存：長(zhǎng)期保存：菌種易被污染、變異菌種易被污染、變異甘油管藏甘油管藏1ml1ml甘油甘油1ml1ml菌液菌液2020為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物可能存在的微生物污染培養(yǎng)物殺死上次