超高效液相色譜的應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展前景

1、超高效液相色譜的應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展前景 生物分離工程課堂報告之 Speaker:黃妙珍 09生物技術(shù)三班 2011.11.3 色譜分離精度高，設(shè)備簡 單，操作方便，根據(jù)各種 原理進行分離的色譜法不 僅普遍應(yīng)用于物質(zhì)成分的 定量分析和檢測，而且廣 泛應(yīng)用于生物物質(zhì)的制備 分離和純化。是目前最好 的生物純化技術(shù)。 常見的分離方式 蒸餾蒸餾 離心 電泳電泳 過濾過濾 超濾超濾 色譜色譜 色譜分類 4 2 3 1 色譜色譜 柱狀色譜柱狀色譜 薄層色譜薄層色譜 紙色譜紙色譜 色相色譜色相色譜 高效液相色譜高效液相色譜 超高效液相色譜超高效液相色譜 色譜典型的儀器配置 色譜泵及控制器色譜泵及控制器 數(shù)據(jù)處理及

2、控制數(shù)據(jù)處理及控制 進樣器進樣器 色譜柱色譜柱 檢測器檢測器 W ate rs 486 分離度 色譜條件的優(yōu)化 速度容量 開發(fā)液相色譜方法 分辨率是色譜分離中主要考慮的因素 在開發(fā)色譜方法時，有很多因素是很重要的。除分辨率之外，以下幾個因素 都要考慮。 靈敏度 載樣量 分析速度 溶劑損耗 Click to add title in here 自自20世紀(jì)世紀(jì)70年代以來，隨著高效液相色譜年代以來，隨著高效液相色譜 (High Performance Liquid Chromatography， HPLC)技術(shù)的不斷發(fā)展，美國技術(shù)的不斷發(fā)展，美國Waters公司于公司于2004 年的匹茲堡會議上

3、推出了最新研制的年的匹茲堡會議上推出了最新研制的ACQUITY超超 高效液相色譜高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)，其采用，其采用17 Ixm細(xì)細(xì) 粒徑的新型固定相，可獲得高達(dá)粒徑的新型固定相，可獲得高達(dá)2萬塊萬塊m理論塔理論塔 板數(shù)的超高柱效，并以系統(tǒng)整體設(shè)計的創(chuàng)新技術(shù)，板數(shù)的超高柱效，并以系統(tǒng)整體設(shè)計的創(chuàng)新技術(shù)， 全面提升了液相色譜的速度、靈敏度和分離度，全面提升了液相色譜的速度、靈敏度和分離度， 造就了液相色譜性能上的飛躍和進步并形成分離造就了液相色譜性能上的飛躍和進步并形成分離 科學(xué)的一個新興領(lǐng)域?？茖W(xué)的一個新興領(lǐng)域

4、。 超高效液相色譜 Click to add title in here 超高效液相色譜 （UPLC）的原理 UPLC的理論基礎(chǔ)為： 范德米特范德米特(Van Deemeter)方程方程 HETP=AdP+Bv+CdP2 HETP：理論塔板高度：理論塔板高度 A：渦流擴散系數(shù)：渦流擴散系數(shù) 由該方程可得出結(jié)論： 顆粒度越小柱效越高；每個顆粒度尺寸有自己的最佳柱 效的流速；更小的顆粒度使最高柱效點向更高流速(線速度)方 向移動，而且有更寬的線速度范圍所以降低顆粒度不但提高柱 效，同時也提高速度。 dlP：填料粒徑：填料粒徑 B：分子徑向擴散系數(shù)：分子徑向擴散系數(shù) C：傳質(zhì)因子為流動相線速度：傳質(zhì)

5、因子為流動相線速度 van Deemter曲線的提示 Click to add title in here Click to add title in here 如果填料的顆粒繼續(xù)演變?nèi)绻盍系念w粒繼續(xù)演變 未來的色譜:更小的顆粒度 液相色譜30年的發(fā)展史是顆粒技術(shù)的發(fā)展史。顆粒度的改變直 接影響到柱效，從而對分離結(jié)果產(chǎn)品直接影響。由上圖可知：隨 著顆粒度的不斷降低，色譜分離度不斷提高。 小顆粒分離的理論與科學(xué)基礎(chǔ)小顆粒分離的理論與科學(xué)基礎(chǔ) 更小顆粒度所面臨的挑戰(zhàn) Click to add title in here 小顆粒帶來生產(chǎn)力 基于17 m小顆粒技術(shù)的UPLC與人們熟知的高效液相色譜(

6、HPLC)技術(shù)，具有相 同的分離原理。不同的是，UPLC不僅比HPLC具有更高的分離能力，而且結(jié)束了 人們多年不得不在速度和分離度之間取舍的歷史。使用UPLC可以在很寬的線速 度、流速和反壓下進行高效的分離工作，并獲得優(yōu)異的結(jié)果 -UPLC的優(yōu)點 超高分離度 圖3: UPLCTM與HPLC：分離度比較 由右圖可見：由右圖可見：UPLCTMUPLCTM 可以大大提高分離度，可以大大提高分離度， 同時色譜峰強度也得到同時色譜峰強度也得到 了提高。了提高。 小顆粒帶來生產(chǎn)力 -UPLC的優(yōu)點 超高速度 圖4: UPLC與HPLC：速度比較 圖5：UPLC美國藥典有關(guān)物質(zhì)分析實例 原有原有HPLCHP

7、LC分析需要分析需要4 4個不同的方法、個不同的方法、 三根不同的色譜柱，至少需要三根不同的色譜柱，至少需要6565分分 鐘才能完成；鐘才能完成；UPLCUPLC使用了一根色譜使用了一根色譜 柱、一種簡單方法，在柱、一種簡單方法，在1 1分鐘內(nèi)即可分鐘內(nèi)即可 完成。完成。 小顆粒帶來生產(chǎn)力 -UPLC的優(yōu)點 超高靈敏度速度 圖6: HPLC到UPLCTM：靈敏度的改善無需折衷 UPLCTM使用小顆 粒技術(shù)可以得到更 高的柱效（因而改 善了分離度）、更 窄的色譜峰寬，即 更高的靈敏度。 UPLC儀器構(gòu)造 UPLC儀器構(gòu)造 Click to add title in here UPLC儀器模式圖

8、UPLC數(shù)據(jù)采集軟件 Empower軟件軟件 MassLynx 為高性能質(zhì)譜應(yīng)用 程序，用于采集、分析、管理 和分布 UV 及質(zhì)譜數(shù)據(jù)。它提 供 了智能儀器控制，可以采集額 定質(zhì)譜、完全質(zhì)譜、MS/MS 和完全質(zhì)譜 MS/MS 數(shù)據(jù)。 MassLynx軟件軟件 Empower 具有基于圖標(biāo)和圖形的用 戶界面，可用于采集、處理、管理、 報告和存儲色譜數(shù) 據(jù)。 UPLC的樣品瓶和樣品板 與UPLC匹配 的色譜柱比較少 峰面積的重復(fù)性欠佳 對高頻檢測儀器的需要 超高效液相色譜的局限性 盡管UPLC能顯著減少復(fù)雜樣品的分析分離時間，提高檢測的靈敏度和分離度，但 目前UPLC的使用仍然存在局限性，其普及

9、應(yīng)用可能仍然需要一些時間。 色譜柱要能夠耐受由于粒徑減小而帶來的高 反壓，而且粒徑的減小也給色譜柱充填技術(shù) 帶來了挑戰(zhàn)。 UPLC分析樣品時峰面積的重復(fù)性略遜 于HPLC，特別是低濃度樣品時更加明 顯，其峰面積重復(fù)性的RSD約為HPLC 的2倍。 UPLC分離樣品色譜峰擴展很小，通常峰底寬 度只有幾秒鐘，低濃度的樣品峰則更窄。 OConnor等 發(fā)現(xiàn)，使用UPLC測定低濃度 樣品時，準(zhǔn)確度、精密度都比較差。 Click to add title in here 超高效液相色譜的應(yīng)用現(xiàn)狀 1.食品安全領(lǐng)域 1.1農(nóng)藥殘留物檢測領(lǐng)域 1.2食品添加劑分析檢測中的應(yīng)用 農(nóng)藥殘留分析屬于微量至超微量分

10、析范疇，要求檢測儀器有非常 高的靈敏度；同時，由于其具有種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點，對 檢測方法的通量和速度也提出了更高的要求。在農(nóng)殘分析檢測中， UPLC與傳統(tǒng)的HPLC 相比較，不僅在分離度、靈敏度和分析速 度上得到較大提高，而且很大程度上減少了樣品和試劑的消耗量， 具有很好的應(yīng)用前景。 隨著食品品種和添加劑種類的增加、多種添加劑的復(fù)配使用，迫 切需要建立多種添加劑同時快速檢測的方法。目前，HPLC 技術(shù) 是食品添加劑檢測的最常用方法；而較這一傳統(tǒng)方法而言，在技 術(shù)性能上擁有優(yōu)勢的UPLC 得到了更突出的應(yīng)用。 超高效液相色譜的應(yīng)用現(xiàn)狀 2.藥物開發(fā)領(lǐng)域 2.1化學(xué)藥品分析 2.2中藥藥品分

11、析 在針對藥物合成的分析方面，UPLC可實現(xiàn)隨時快速準(zhǔn)確檢測合成過 程中的中間體、副產(chǎn)物或降解產(chǎn)物等。 Waters公司合成了17 pm顆粒度的Acquity UPLC填料，減少了固 定相表面殘余硅羥基，因而在分析生物堿類樣品時，流動相中只加入酸 抑制劑，不需添加有機胺即可使其獲得良好的分離。由于在流動相中避 免了有機胺及鹽的加入，可以在一定程度上降低質(zhì)譜噪音、減少對質(zhì)譜 的污染，且使用的流速適合與質(zhì)譜直接聯(lián)用，無需分流，可以進一步提 高檢測靈敏度，為中藥分析提供良好的平臺。 超高效液相色譜的應(yīng)用現(xiàn)狀 3.其他領(lǐng)域 農(nóng)藥殘留物檢測 水質(zhì)和環(huán)境監(jiān)測 化妝品質(zhì)量控制 . 超高效液相色譜與其他技術(shù)的

12、交叉應(yīng)用 merit 超高效液相色譜和高效液相色譜聯(lián)合 固相萃取一超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法 氣相萃取一超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法 王文昭、李鵬等8基于超高效液相色譜和高效液相色譜的偏最小二乘 判別分析法建立了一種新型的區(qū)別診斷乳腺增生和乳腺癌患者的快速臨 床方法。 超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLCMS-MS)9具有更加簡便、快 速、靈敏的特點，特異性好、能夠排除基質(zhì)干擾，定量限更低、定性 更準(zhǔn)確，是分析組織中氯羥吡啶殘留的理想方法。 陳躍 應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(UPLCMSMS)技 術(shù)，建立了高靈敏、快速的同時檢測農(nóng)產(chǎn)品中8種種衣劑農(nóng)藥 殘留量的方法。 超高效液相色譜儀的制造

13、在世界領(lǐng)域的UPLC研發(fā)生產(chǎn)中，Waters作為專業(yè)液相色譜的廠商，是業(yè)界 唯一同時擁有液相色譜所有組件技術(shù)包括液相色譜儀器硬件、填料技術(shù)和軟 件技術(shù)的供應(yīng)商，擁有液相色譜技術(shù)最強大的科研和生產(chǎn)機構(gòu)。 從六十年代首推世界上第一臺液相色譜(LC)系統(tǒng)，到七十年代高效液相色 譜(HPLC)技術(shù)的商品化，直至2004年超高效液相色譜(UPLC)系統(tǒng)的推出， Waters是色譜技術(shù)公認(rèn)的領(lǐng)導(dǎo)者11。 Waters世界世界專業(yè)液相色譜的廠商 超高效液相色譜的發(fā)展前景 UPLC是一種較為新穎的技術(shù)手段，與傳統(tǒng)分析方法相比具有多 方面的優(yōu)勢。 UPLC可以更快的速度和更高的質(zhì)量完成以往HPLC的工作，沃 特世將致力于豐富已有的UPLC產(chǎn)品，現(xiàn)已推出了六種新的色 譜柱，包括:BEH C18、C8、苯基和ShieldRP18、 HILIC 及 HSS T3。同時還