幾種真菌誘導(dǎo)子對云南紅豆杉細(xì)胞產(chǎn)生紫杉醇的影響

1、15 卷 4 期1999 年 10 月生 物 工 程 學(xué) 報chi nese jou r n al of b iotech nologyvol . 15 no . 4october 1999幾種真菌誘導(dǎo)子對云南紅豆杉細(xì)胞產(chǎn)生紫杉醇的影響陳永勤 3朱蔚華 3 3吳蘊祺胡秋( 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 藥物研究所 北京 100050)關(guān)鍵詞 云南紅豆杉 ,懸浮細(xì)胞培養(yǎng) ,真菌誘導(dǎo)子 ,紫杉醇分類號 q81311文獻(xiàn)標(biāo)識碼 a文章編號 100023061 (1999) 0420522224自 1993 年以來 ,紫杉醇 ( taxol) 已成為臨床上治療乳腺癌和卵巢癌的重要藥物 。由于其藥源

2、植物紅豆杉屬植物 ( t ax us l . ) 生長非常緩慢 ,體內(nèi)紫杉醇含量很低 ,且資源有限 ,所以人們一直在尋找解 決紫杉醇藥源短缺的方法 。用紅豆杉屬植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇被認(rèn)為是一種有潛力的方法之 一 ,受到人們的高度重視 。雖然有關(guān)這方面的報道較多1 ,但該研究仍處在試驗階段 ,還未見用此方法 商業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇的報道 。其重要原因是目前紅豆杉屬植物離體細(xì)胞的紫杉醇產(chǎn)量還比較低 ,而且不 穩(wěn) 。人們?nèi)栽诶^續(xù)尋找提高紫杉醇產(chǎn)量的方法 。真菌能產(chǎn)生一些促進(jìn)植物細(xì)胞次生代謝的化合物 ,因此在植物細(xì)胞培養(yǎng)中常被用作誘導(dǎo)子來提高 次生代謝物的產(chǎn)量2 。本文報道了幾種真菌誘導(dǎo)子對云南紅豆杉

3、 ( t ax us y u n n anensis) 懸浮細(xì)胞產(chǎn)生紫 杉醇的影響 。1材料與方法111 細(xì)胞系的建立取云南紅豆杉 (本所栽培植株 ,來自云南省林業(yè)科學(xué)院植物園) 當(dāng)年生莖段洗凈后 ,先后用 70 %乙 醇消毒 2min 和 011 %hgcl2 消毒 20min 。用無菌水漂洗 6 次后 ,剪成小段 ,接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈 傷組織的誘導(dǎo) ;愈傷組織形成后 ,轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng) 。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是通過將愈傷組織接 種在液體增殖培養(yǎng)基中 、在搖床上震蕩培養(yǎng)建立起來的 ?；九囵B(yǎng)基為 b5 培養(yǎng)基3 的無機鹽 、100 mg/ l 肌醇 、1125 mg/ l 煙酸 、

4、110 mg/ l 維生素 b1 、015 mg/ l 維生素 b6 、20 . 0 g/ l 蔗糖 、011 mg/ l ba p (62芐基腺嘌呤) 和 110 mg/ l 2 ,42d 。誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加有110 g/ l 水解乳蛋白 。增殖培養(yǎng)基中添加了 210 mmol/ l 的 l2谷氨酰胺 。固體培養(yǎng)基中瓊脂濃度為 810 g/ l 。培養(yǎng)基 p h 為 518 。培養(yǎng)溫度為 24 2 ,黑暗 。搖床轉(zhuǎn)速 120 r/ min 。112 誘導(dǎo)子的制備將桔青霉 ( penicil l i u n ci t ri n u m ) 、灰綠犁頭酶 ( a bsi di a gl auca)

5、 、魯氏毛霉 ( m ucor rou x i an us) 和灰葡 萄孢霉 ( b ot ryt is ci nerea ) 的 菌 絲 接 種 在 液 體 改 良 pda 培 養(yǎng) 基 ( 10010 g/ l 土 豆 , 2010 g/ l 葡 萄 糖 ,310 g/ l kh2 po4 ,115 g/ l mgso4 7 ho2 ,110 mg/ l vb1 ) 中 。在搖床上 (120 r/ min) 暗培養(yǎng) 7d 后 ,將各菌 培養(yǎng)物過濾 ,取菌絲 ,用蒸餾水沖洗 2 次 ,在 121 消毒 25 min ,即為誘導(dǎo)子 。113 誘導(dǎo)試驗取 5 瓶懸浮細(xì)胞 ,靜置 2 min 后 ,

6、倒出上層培養(yǎng)液 ,剩下的細(xì)胞培養(yǎng)物同 1500 ml 加有 110 mmol/ l苯丙氨酸的增殖培養(yǎng)基混勻 ,再分裝到 500 ml 三角瓶中 ,每瓶 130 ml 。真菌誘導(dǎo)子在培養(yǎng)至 12d 時加3現(xiàn)在湖北大學(xué)生命科學(xué)院工作 ,武漢 430062 。3 3 聯(lián)系人 。收稿日期 :1998208224 ,修回日期 :1998212214 。入 ,每瓶 30 ml 。對照瓶加 30 ml 無菌蒸餾水 。每處理 2 個重復(fù) 。桔青霉的用量為 311 g/ l 干菌絲 、灰色犁頭霉為 3142 g/ l 干菌 、魯氏毛霉為 3125 g/ l 干菌絲和灰葡萄霉為 2178 g/ l 干菌絲 。繼續(xù)

7、培養(yǎng)至15d 時結(jié)束 ,離心收集細(xì)胞 ,烘干后測定干重和紫杉醇含量 。 不同桔青霉菌加入量和誘導(dǎo)時間的試驗操作同上 。桔青霉菌培養(yǎng)物也在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)至 12d 時加入 ,加入量分別為每瓶 15 ml 、30ml 和 50ml ( 分別相當(dāng)于干菌絲 1155 、3 . 1 和 512 g/ l ) ,對照瓶加 30 ml 無菌蒸餾水 。誘導(dǎo)時間分別為 3d 和 5d 。各處理重復(fù) 3 次 。114 紫杉醇的測定細(xì)胞中紫杉醇含量的測定按 wu 等4 的 hpl c 法進(jìn)行 。色譜柱為 plantinum c18 ( 250 mm 4. 6 mm ,5 m ,alltech ,u sa) ,流動相為

8、甲醇2乙腈2水 (25 35 45) ,流速 110 ml / min ,檢測波長 227 nm 。細(xì)胞樣 品中紫杉醇含量通過外標(biāo)法計算 ,以細(xì)胞干重表示 。2結(jié)果與討論本試驗的云南紅豆杉懸浮細(xì)胞系為淡黃色 ,多呈小米大小的顆粒狀 ,生長周期為 18d 。細(xì)胞中產(chǎn)生 的紫杉醇經(jīng)紫外吸收圖譜和質(zhì)譜確證 。在兩組試驗中 ,在細(xì)胞快速生長期的末期 (第 12d) 加入真菌誘導(dǎo)子對細(xì)胞干重的的影響不顯著 ( 資 料略) ,但對細(xì)胞中紫杉醇的含量影響很大 。211 不同真菌誘導(dǎo)子對云南紅豆杉細(xì)胞產(chǎn)生紫杉醇的影響在所試驗的真菌誘導(dǎo)子中 ,以含桔青霉菌絲的處理 ( penl) 效果最好 ,其紫杉醇含量和產(chǎn)量

9、分別比對 照高 11312 %和 10410 % (圖 1) ,達(dá) 010356 % (干細(xì)胞) 和 5106 mg/ l 。其次是灰葡萄孢霉菌 ,處理后紫杉 醇含量和產(chǎn)量分別比對照提高了 5817 %和 5112 % 。魯氏毛霉和灰綠梨頭霉對云南紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì) 胞形成紫杉醇的促進(jìn)作用不顯著 。雖然桔青霉菌的培養(yǎng)液也能提高細(xì)胞中紫杉醇的含量 ,但效果不如 有菌絲的顯著 。圖 1 真菌誘導(dǎo)子對云南紅豆杉懸浮細(xì)胞產(chǎn)生紫杉醇的影響a : taxol co ntent ( %dw) ; b : taxol yield ( mg/ l ) . c k. co nt rol , penl . penic

10、i l li u m ci t ri n u m cult ure , pen2 . filt rate of penici l li u m ci t ri n u m cult ure , muc . m ucor rou x i a n us cult ure , abs. a bsi di a gl a uca cult ure , bot . b ot ryt is ci nerea cu1t ure. bars rep resent standard erro rs of t he means. columns sharing t he same let ters do not d

11、iffer f ro m each ot her at p = 0 . 05 by a l sr test .212 桔青霉菌誘導(dǎo)子的加入量和誘導(dǎo)時間對云南紅豆杉細(xì)胞產(chǎn)生紫杉醇的影響不同桔青霉菌絲加入量對云南紅豆杉細(xì)胞產(chǎn)生紫杉醇的影響較大 。在 3 種濃度處理中 ,以 311 g/ l 的效果最好 ,其紫杉醇的含量和產(chǎn)量分別比對照提高了 2 倍以上 ( 圖 2) 。從誘導(dǎo)時間來看 ,以加入誘導(dǎo) 子后繼續(xù)培養(yǎng) 3d 的效果最好 ,延長誘導(dǎo)時間反而會使紫杉醇含量和產(chǎn)量有所下降 。524生物工程學(xué)報15 卷圖 2 不同桔青霉培養(yǎng)物加入量和誘導(dǎo)時間對云南紅豆杉懸浮細(xì)胞產(chǎn)生紫杉醇的影響a : taxol

12、 co ntent ( %dw) ; b : taxol yield ( mg/ l ) . c k : co nt rol , penl : treated by additio n of 1 . 55 g/ l mycelium fo r 3 days , pen2 : treated by additio n of 3 . 1 g/ l mycelium fo r 3 days , pen3 : treated by additio n of 5 . 2 g/ l mycelium fo r 3 dyas , pen4 : treated by additio n of 3 . 1 g/

13、 l mycelium fo r 5 days. bars rep resent standard erro rs of t he means. columns sharing t he same let ters do not differ f ro m each ot her at p :0 . 05 by a l sr test .生紫杉醇 ,但不同真菌的效果差異很大 。因此 ,通過大量篩選 ,有可能得到促進(jìn)作用更強的菌種 。致 謝 本所方唯碩博士提供了紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品 ,姚慶強博士代測紫杉醇的紫外吸收圖譜 ,中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心蔣 可研究員和趙國棟高級工程師代做 a pci 質(zhì)譜 ,

14、特致謝意 。參考文獻(xiàn)陳永勤 ,朱蔚華 1 植物生理學(xué)通訊 ,1997 ,33 :2132191f. dico smo ,m . misawa . t ren ds i n b iotech nology ,1985 ,3 :3183221o . l , gambo rg , r. a ,miller , k. ojima . ex p . cel l . res . , 1968 ,50 :1481511wu y. q . , zhu w. h. , ling. j . ch rom at g r & rel ated tech nol . , 1997 ,20 :31473151 .1234

15、eff ects of fungus el ic itors on ta xol product ion in suspensioncell s of ta xus yu n na nensischen yo ngqinzhu weihuawu yunqihu qiu( i nst it ute of m ateri al medica , chi nese a cadem y of medical s ciences & peki ng u nion medical college , beiji ng 100050)abstractthe effect s of t he cult ure

16、s of penicil l i u n ci t ri n u m , a bsi di a gl auca , m ucor rou x i an usand b ot ryt is ci nerea o n t he growt h and taxol p roductio n in suspensio n cells of t ax us y u n n anensis were investigated. the result s showed t hat t he additio n of t he cult ures of penicil l i u n ci t ri n u m or b ot ryt is ci nerea into t he suspensio n cell cult ures of t . y u n n anensis at t he final stage of fast2growing p hase ( t he 12t h day of cult ure) did not inhibited t he cell growt h , but dramatically increased taxol yield ;