酶聯(lián)免疫吸附

1、酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù) EIA擬探討的問題擬探討的問題ELISAELISA的原理的原理ELISAELISA的試劑（三個(gè)必要試劑）的試劑（三個(gè)必要試劑）ELISAELISA的類型的類型ELISAELISA的過程的過程ELISAELISA的操作要點(diǎn)的操作要點(diǎn)酶免疫技術(shù)的定義酶免疫技術(shù)的定義酶免疫技術(shù)的類型酶免疫技術(shù)的類型酶免疫技術(shù)的發(fā)展酶免疫技術(shù)的發(fā)展概念概念以酶標(biāo)記的抗體（抗原）作為主要試劑，將抗原抗體反應(yīng)以酶標(biāo)記的抗體（抗原）作為主要試劑，將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化底物反應(yīng)的高效性和專一性結(jié)合起來的的特異性和酶催化底物反應(yīng)的高效性和專一性結(jié)合起來的一種免疫檢測技術(shù)。一種免疫檢測技術(shù)。常用的酶

2、及顯色底物常用的酶及顯色底物常用酶常用酶底物底物加終止液前加終止液前顏色顏色加終止液后加終止液后顏色顏色辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶（HRP）鄰苯二胺（鄰苯二胺（OPD）橙黃色橙黃色橙黃色橙黃色 四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺（TMB）藍(lán)色藍(lán)色黃色黃色堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（AP）對硝基苯磷酸酯對硝基苯磷酸酯（p-NPP）黃色黃色黃色黃色酶免疫技術(shù)類型（按抗原抗體系統(tǒng)的定位劃分）（按抗原抗體系統(tǒng)的定位劃分）酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫組化酶免疫測定酶免疫測定均相酶免疫測定（均相酶免疫測定（EMITEMIT、CEDIACEDIA）異相酶免疫測定異相酶免疫測定液相酶免疫測定液相酶免疫測定固相酶免

3、疫測定固相酶免疫測定（如（如ELISAELISA）均相酶免疫測定均相酶免疫測定 利用酶標(biāo)記物結(jié)合抗原抗體復(fù)合物后，標(biāo)記酶的活性就利用酶標(biāo)記物結(jié)合抗原抗體復(fù)合物后，標(biāo)記酶的活性就受到抑制，因而反應(yīng)后不需分離結(jié)合的和游離的酶標(biāo)記物，受到抑制，因而反應(yīng)后不需分離結(jié)合的和游離的酶標(biāo)記物，直接測定系統(tǒng)中的總標(biāo)記酶的活性的變化，即可確定結(jié)合直接測定系統(tǒng)中的總標(biāo)記酶的活性的變化，即可確定結(jié)合的酶標(biāo)記物的數(shù)量，從而得到待測物的含量。常用于半抗的酶標(biāo)記物的數(shù)量，從而得到待測物的含量。常用于半抗原如藥物、激素、毒品、興奮劑等的測定。原如藥物、激素、毒品、興奮劑等的測定。酶免疫增強(qiáng)測定技術(shù)（酶免疫增強(qiáng)測定技術(shù)（EM

4、ITEMIT）酶活性的抑制是由于標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合后空間位阻了酶酶活性的抑制是由于標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合后空間位阻了酶與底物結(jié)合的部位而造成的。反應(yīng)模式競爭法，當(dāng)未標(biāo)記與底物結(jié)合的部位而造成的。反應(yīng)模式競爭法，當(dāng)未標(biāo)記抗原和標(biāo)記抗原與限量的抗體競爭結(jié)合時(shí)，未標(biāo)記抗原多，抗原和標(biāo)記抗原與限量的抗體競爭結(jié)合時(shí)，未標(biāo)記抗原多，競爭性的與抗體結(jié)合多，則標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合少，酶的競爭性的與抗體結(jié)合多，則標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合少，酶的活性受到抑制少，酶活性高。最終測的酶活性與未標(biāo)記的活性受到抑制少，酶活性高。最終測的酶活性與未標(biāo)記的抗原含量呈正相關(guān)?？乖砍收嚓P(guān)?？贵w抗體酶酶抗體抗體酶酶半抗原半抗原（未標(biāo)記）

5、（未標(biāo)記）底物底物標(biāo)記抗原標(biāo)記抗原酶酶克隆酶供體免疫分析（克隆酶供體免疫分析（CEDIACEDIA）酶是以供體和受體兩個(gè)片段存在的，只有兩個(gè)片段結(jié)酶是以供體和受體兩個(gè)片段存在的，只有兩個(gè)片段結(jié)合在一起形成全酶才具有活性，當(dāng)標(biāo)記了供體酶的抗合在一起形成全酶才具有活性，當(dāng)標(biāo)記了供體酶的抗原與抗體結(jié)合后就空間位阻了酶供體（原與抗體結(jié)合后就空間位阻了酶供體（EDED）與酶受體）與酶受體（EAEA）的結(jié)合，從而不能形成有活性的全酶，酶活性）的結(jié)合，從而不能形成有活性的全酶，酶活性受到抑制。反應(yīng)模式為競爭性結(jié)合。最終測的酶活性受到抑制。反應(yīng)模式為競爭性結(jié)合。最終測的酶活性與未標(biāo)記抗原的含量呈正相關(guān)。與未標(biāo)

6、記抗原的含量呈正相關(guān)。EDED+ +標(biāo)本中抗原標(biāo)本中抗原EDED標(biāo)記抗原標(biāo)記抗原抗體抗體EDED+ +EAEAXEAEAEDED活性酶活性酶異相酶免疫測定異相酶免疫測定抗原抗體反應(yīng)平衡后，體系中同時(shí)存在游離的和結(jié)合的酶抗原抗體反應(yīng)平衡后，體系中同時(shí)存在游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物，兩種標(biāo)記物上的酶都具活性，而只有結(jié)合的酶標(biāo)標(biāo)記物，兩種標(biāo)記物上的酶都具活性，而只有結(jié)合的酶標(biāo)記物的形成與含量才代表待測物的存在與含量。故需將游記物的形成與含量才代表待測物的存在與含量。故需將游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物分離，測定結(jié)合狀態(tài)的酶標(biāo)記物的離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物分離，測定結(jié)合狀態(tài)的酶標(biāo)記物的活性推算待測物的含量。由于分離方

7、法不同，又分為活性推算待測物的含量。由于分離方法不同，又分為液相酶免疫測定液相酶免疫測定游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記都存在于液相中，需用分離劑游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記都存在于液相中，需用分離劑分開后測結(jié)合狀態(tài)的酶標(biāo)記物的活性。分開后測結(jié)合狀態(tài)的酶標(biāo)記物的活性。固相酶免疫測定固相酶免疫測定通過載體將結(jié)合狀態(tài)的酶標(biāo)記物吸附在固相支持物上，通過載體將結(jié)合狀態(tài)的酶標(biāo)記物吸附在固相支持物上，只需洗滌就可將游離的酶標(biāo)記物去除。以只需洗滌就可將游離的酶標(biāo)記物去除。以ELISAELISA最常用。最常用。酶聯(lián)免疫吸附測定酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA)是在

8、是在免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic techniques)(immunoenzymatic techniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù), ,可用于測定抗原，也可用于測定抗體可用于測定抗原，也可用于測定抗體 。ELISAELISA的原理的原理將過量抗體（抗原）包被于載體上，通過將過量抗體（抗原）包被于載體上，通過抗原抗原抗體反應(yīng)使抗體反應(yīng)使酶標(biāo)記抗體（抗原）也結(jié)合在載體酶標(biāo)記抗體（抗原）也結(jié)合在載體上，經(jīng)上，經(jīng)洗滌去除游離的洗滌去除游離的酶標(biāo)記抗體（抗原）后酶標(biāo)記抗體（抗原）后，加入底物顯色，定性或定量分析有色產(chǎn)物

9、從，加入底物顯色，定性或定量分析有色產(chǎn)物從而確定待測物的存在與含量。而確定待測物的存在與含量。ELISA過程過程1 1、包被包被抗原抗原( (抗體抗體) )吸附在固相載體上稱為包被。吸附在固相載體上稱為包被。2 2、復(fù)合物的形成復(fù)合物的形成加待測抗體加待測抗體( (抗原抗原), ), 再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體( (抗原抗原),),生成抗原生成抗原( (抗體抗體)-)-待測抗體待測抗體( (抗原抗原)-)-酶標(biāo)記抗體酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物。的復(fù)合物。3 3、酶與該酶底物反應(yīng)酶與該酶底物反應(yīng)抗原抗原( (抗體抗體)-)-待測抗體待測抗體( (抗原抗原)-)-酶標(biāo)記抗體復(fù)合酶標(biāo)記抗體復(fù)合物與

10、該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。物與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。4 4、檢測檢測借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體( (抗原抗原) )的量。的量。待測抗體待測抗體( (抗原抗原) )的定量與有色產(chǎn)物成正比。的定量與有色產(chǎn)物成正比。ELISA的試劑的試劑三個(gè)必要的試劑：三個(gè)必要的試劑：（1 1）固相的抗菌素原（抗原）或抗體，即）固相的抗菌素原（抗原）或抗體，即 “ “免疫吸附劑免疫吸附劑” （immunosorbentimmunosorbent）；）；（2 2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物結(jié)合物” （conjugateconjugate）；）；

11、（3 3）酶反應(yīng)的）酶反應(yīng)的底物底物。完整的完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：試劑盒包含以下各組分：（2 2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3 3）酶的底物；）酶的底物；（4 4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參 考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定中）；考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定中）；（5 5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6 6）洗滌液；）洗滌液；（7 7）酶反應(yīng)終止液。）酶反應(yīng)終止液。（1 1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；1 1免疫

12、吸附劑免疫吸附劑 已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2-82-8）干燥的條件下一般可保存干燥的條件下一般可保存6 6個(gè)月。個(gè)月。1.11.1固相載體固相載體固相載體在固相載體在ELISAELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)。參與化學(xué)反應(yīng)。 ELISAELISA載體的形狀主要有三種：微載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。國際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定量滴定板、小珠和小試管。國際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為板為8 81212的的9696孔式?？资健?.2 1.2 包被的方式包被的方式包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程

13、。包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程。IgGIgG對聚苯乙烯等固相具有較強(qiáng)的吸附力，其聯(lián)結(jié)對聚苯乙烯等固相具有較強(qiáng)的吸附力，其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在多發(fā)生在FcFc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外，因此抗段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外，因此抗體的包被一般均采用體的包被一般均采用直接吸附法直接吸附法。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被?？梢圆捎瞄g接的可以采用間接的捕獲包被法捕獲包被法，即先將針對該抗原，即先將針對該抗原的特異抗體作預(yù)包被，其后通過抗原抗體反應(yīng)使的特異抗體作預(yù)包被，其后通過抗原抗體反應(yīng)使抗原固相化?？乖滔嗷?DNADNA抗原的包被抗原的包被紫

14、外線照射（例如紫外線照射（例如30W30W紫外燈，紫外燈，75cm75cm照射照射1212小時(shí)）小時(shí)）固相載體先用堿性蛋白質(zhì)，如聚賴氨酸、魚精蛋固相載體先用堿性蛋白質(zhì)，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預(yù)包被，也可提高核酸的結(jié)合力。白等作預(yù)包被，也可提高核酸的結(jié)合力。用親和素先包被載體，然后加入生物素化的用親和素先包被載體，然后加入生物素化的DNADNA脂類物質(zhì)的包被脂類物質(zhì)的包被可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISAELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。酒精揮發(fā)后，讓脂

15、質(zhì)自然干固在固相表面?？剐牧字贵w的抗心磷脂抗體的ELISAELISA試劑一般采用這種包被方式。試劑一般采用這種包被方式。 1.5 1.5 包被的條件包被的條件抗體和蛋白質(zhì)抗原一般采用抗體和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6pH9.6的碳酸鹽緩沖液的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用作為稀釋液，也有用pH7.2pH7.2的磷酸鹽緩沖液及的磷酸鹽緩沖液及pH7-8pH7-8的的Tris-HCLTris-HCL緩沖液作為稀釋液的。緩沖液作為稀釋液的。通常在通常在ELISAELISA板孔中加入包被液后，在板孔中加入包被液后，在4-84-8冰箱中冰箱中放置過夜，放置過夜，3737中保溫中保溫2 2小時(shí)被認(rèn)為具有

16、同等的包小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果。被效果。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml100ng/ml-20ug/ml。為防止包被后載體上留有未包被的空隙而導(dǎo)致本底為防止包被后載體上留有未包被的空隙而導(dǎo)致本底過高，常用過高，常用1%-5%BSA1%-5%BSA封閉空隙。封閉空隙。2 2 結(jié)合物結(jié)合物酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISAELISA中最關(guān)鍵的試劑。中最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應(yīng)具備：良好的結(jié)合物應(yīng)具備：既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。免疫活性。結(jié)合物中酶與

17、抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖冉Y(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤?，在結(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少含有未結(jié)合的例，在結(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少含有未結(jié)合的酶或抗體（或抗原）。酶或抗體（或抗原）。結(jié)合物要有良好的穩(wěn)定性。結(jié)合物要有良好的穩(wěn)定性。 2.1酶用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定來源豐富，價(jià)格不貴來源豐富，價(jià)格不貴 制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力能力在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶 它的相應(yīng)底物易于制備和保存，

18、有色產(chǎn)物易于測定它的相應(yīng)底物易于制備和保存，有色產(chǎn)物易于測定 在在ELISAELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, (horseradish peroxidase, HRPHRP) ) 堿性磷酸酶堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, (alkaline phosohatase, APAP) )。 制備結(jié)合物時(shí)所用抗體一般制備結(jié)合物時(shí)所用抗體一般 均為純度較高的均為純度較高的IgGIgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。 在在ELISAELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不

19、多，總的要求中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。是抗原必須是高純度的。 2.3 2.3 結(jié)合物的制備結(jié)合物的制備酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種交聯(lián)法：可同時(shí)與酶和抗體（抗原）結(jié)交聯(lián)法：可同時(shí)與酶和抗體（抗原）結(jié)合的交聯(lián)劑作為合的交聯(lián)劑作為“橋橋”，分別連接酶和，分別連接酶和抗體（抗原）的方法，形成酶抗體（抗原）的方法，形成酶- -交聯(lián)劑交聯(lián)劑- -抗體（抗原）?？贵w（抗原）。 戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 直接法：用一活化劑首先將酶活化，被活化的直接法：用一活化劑首先將酶活化，被活化的酶分子上的基團(tuán)直接可與抗體（抗原）結(jié)合形酶分

20、子上的基團(tuán)直接可與抗體（抗原）結(jié)合形成標(biāo)記物。形成的標(biāo)記物為酶成標(biāo)記物。形成的標(biāo)記物為酶- -抗體（抗原）?？贵w（抗原）。過碘酸鹽氧化法過碘酸鹽氧化法 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶2.42.4結(jié)合物的保存結(jié)合物的保存需加入蛋白保護(hù)劑（蛋白酶抑制劑）需加入蛋白保護(hù)劑（蛋白酶抑制劑）再加入抗生素（慶大霉素）和防腐劑再加入抗生素（慶大霉素）和防腐劑HRPHRP結(jié)合物加硫柳泵結(jié)合物加硫柳泵APAP結(jié)合物可加疊氮鈉，以防止細(xì)菌生長。結(jié)合物可加疊氮鈉，以防止細(xì)菌生長。冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右加入等體積甘油可在低溫冰箱或普通冰箱中保存加入等體積甘油可在低溫冰箱

21、或普通冰箱中保存較長時(shí)間較長時(shí)間2.5 2.5 結(jié)合物的稀釋液結(jié)合物的稀釋液 為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上，在為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)（例如稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%1%牛牛血清白蛋白），通過競爭以抑制結(jié)合物的吸附。血清白蛋白），通過競爭以抑制結(jié)合物的吸附。 一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫子型表面活性劑，如吐溫2020，0.05%0.05%的濃度較為適宜。的濃度較為適宜。3 3 酶的底物酶的底物3.1 3.1 HRPHRP的底物

22、的底物 鄰苯二胺鄰苯二胺(O-phenylenediamine,(O-phenylenediamine,OPDOPD) )HRPHRP最常用的底物最常用的底物 產(chǎn)物呈橙紅色，在產(chǎn)物呈橙紅色，在492nm492nm處有最高吸收峰處有最高吸收峰OPDOPD見光易變質(zhì)，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。見光易變質(zhì)，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。-四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺(3,3,5,5tetramethylbenzidine,(3,3,5,5tetramethylbenzidine,TMBTMB) ) 產(chǎn)物顯藍(lán)色，酶反應(yīng)用產(chǎn)物顯藍(lán)色，酶反應(yīng)用HCLHCL或或H2SO4H2SO4終止后，產(chǎn)物由藍(lán)終止后，產(chǎn)物由藍(lán)色色呈黃色，可在比色計(jì)中定

23、量，最適吸收波長為呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長為450nm450nm。 3-(4-3-(4-羥基羥基) )苯丙酸苯丙酸3-(4-hydroxy)phenly propionic 3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,acid,HPPAHPPA 經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計(jì)測量（定作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計(jì)測量（定量）或放射自顯影（定性）。量）或放射自顯影（定性）。3.23.2APAP的底物的底物對硝基苯磷酸酯對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,(p-nitrophenyl phosphate,p

24、-NPPp-NPP) )產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在在405nm405nm波長處有吸收峰。波長處有吸收峰。用用NaOHNaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間磷酸磷酸4-4-甲基傘酮甲基傘酮 可發(fā)熒光的底物，用于可發(fā)熒光的底物，用于ELISAELISA作熒光測定，敏感度較高作熒光測定，敏感度較高 洗滌液洗滌液 在板式在板式ELISA中，常用的洗滌液為含中，常用的洗滌液為含0.05%0.05%吐溫吐溫2020的磷酸鹽緩沖液的磷酸鹽緩沖液。 酶反應(yīng)終止液酶反應(yīng)終止液常用的常用的HRPHRP反應(yīng)終止液為硫酸，反應(yīng)終止液為硫酸，在板式在板式ELISA中一般

25、采用中一般采用2mol/L2mol/LELISAELISA的類型的類型一）雙抗體夾心法測抗原一）雙抗體夾心法測抗原利用待測抗原上的兩個(gè)抗原決定簇利用待測抗原上的兩個(gè)抗原決定簇A A和和B B分別與分別與固相載體上的抗體固相載體上的抗體A A和酶標(biāo)記抗體和酶標(biāo)記抗體B B結(jié)合，形成結(jié)合，形成抗體抗體A-A-待測抗原待測抗原- -酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體B B復(fù)合物，復(fù)合物的復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測抗原含量成正比，屬于非競爭性形成量與待測抗原含量成正比，屬于非競爭性反應(yīng)。反應(yīng)?？贵w抗體固相抗體固相抗體保溫保溫受檢標(biāo)本受檢標(biāo)本抗原抗原洗滌洗滌酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體抗體抗體酶標(biāo)酶標(biāo)洗洗滌滌加加底底物物保溫保溫洗

26、滌洗滌 此法適用于測定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，此法適用于測定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，不適用于測定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能不適用于測定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。形成兩位點(diǎn)夾心。 雙抗體夾心法測抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子雙抗體夾心法測抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子（RFRF）的干擾。采用）的干擾。采用F F（abab）或）或FabFab片段作酶結(jié)合片段作酶結(jié)合物物的試劑，由于去除了的試劑，由于去除了FcFc段，從而消除段，從而消除RFRF的干擾。的干擾。 抗體的選擇：如抗體的來源為抗血清，包被和抗體的選擇：如抗體的來源為抗血清，包被和酶標(biāo)用的抗體最好分別取自不

27、同種屬的動物。酶標(biāo)用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。二）二）間接法測抗體間接法測抗體原理為將已知抗原連接在固相載體上，待測抗體原理為將已知抗原連接在固相載體上，待測抗體與抗原結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗原與抗原結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗原- -待測待測抗體抗體- -酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，復(fù)合物的量與待測抗體酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，復(fù)合物的量與待測抗體量成正比，也屬于非競爭性反應(yīng)。量成正比，也屬于非競爭性反應(yīng)。抗原抗原固相抗原固相抗原洗滌洗滌受檢血清受檢血清抗體抗體洗滌洗滌酶標(biāo)抗抗體酶標(biāo)抗抗體抗抗體抗抗體酶標(biāo)酶標(biāo)洗洗滌滌加加底底物物保溫保溫保溫保溫主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷主要用

28、于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷 間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性度的非特異性IgG IgG ，非特異，非特異IgGIgG可直接吸附到固相可直接吸附到固相載體上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。載體上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。 在間接法中，抗原包被后一般用無關(guān)蛋白質(zhì)（在間接法中，抗原包被后一般用無關(guān)蛋白質(zhì)（BSABSA）再包被一次，以封閉（再包被一次，以封閉（blockingblocking）固相上的空余間）固相上的空余間隙。在檢測過程中標(biāo)本須先行稀釋（隙。在檢測過程中標(biāo)本須先行稀釋（1:401:401:2001:2

29、00），以避免過高的陰性本底），以避免過高的陰性本底影響結(jié)果的判斷。影響結(jié)果的判斷。 三）三）競爭法競爭法可用于檢測抗原和抗體。用酶標(biāo)抗原（抗體）與待可用于檢測抗原和抗體。用酶標(biāo)抗原（抗體）與待測測的非標(biāo)記抗原（抗體）競爭性的與固相載體上的限的非標(biāo)記抗原（抗體）競爭性的與固相載體上的限量量抗體（抗原）結(jié)合，待測抗原（抗體）多，則形成抗體（抗原）結(jié)合，待測抗原（抗體）多，則形成非非標(biāo)記復(fù)合物多，酶標(biāo)復(fù)合物就少，故顯色程度與待標(biāo)記復(fù)合物多，酶標(biāo)復(fù)合物就少，故顯色程度與待測測物含量成反比。物含量成反比。 小分子激素、藥物等小分子激素、藥物等ELISAELISA測定多用此法。測定多用此法。 對照孔與樣

30、品孔底物降解量的差未知抗原量對照孔與樣品孔底物降解量的差未知抗原量 四）四）捕獲包被法測抗體捕獲包被法測抗體 在在臨床檢驗(yàn)中測定抗體臨床檢驗(yàn)中測定抗體IgMIgM時(shí)多采用捕獲包被法。時(shí)多采用捕獲包被法。抗人抗人IgMIgM固相抗體的形成固相抗體的形成加入血清標(biāo)本，形成加入血清標(biāo)本，形成抗人抗人IgMIgM固相抗體固相抗體- -特異性特異性IgMIgM抗抗體體復(fù)合物復(fù)合物加入抗原，形成加入抗原，形成抗人抗人IgMIgM固相抗體固相抗體- -特異性特異性IgMIgM抗抗體體- -抗原抗原復(fù)合物。復(fù)合物。加酶標(biāo)記針對抗原的特異性抗體，形成加酶標(biāo)記針對抗原的特異性抗體，形成抗人抗人IgMIgM固相固相

31、抗體抗體- -特異性特異性IgMIgM抗體抗體- -抗原抗原- -酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體復(fù)合物。復(fù)合物。酶再與底物作用，呈色即與標(biāo)本中的酶再與底物作用，呈色即與標(biāo)本中的IgMIgM成正相關(guān)。成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的早期診斷。此法常用于病毒性感染的早期診斷。ELISAELISA常用技術(shù)類型比較常用技術(shù)類型比較類型類型固相載固相載體上的體上的包被物包被物待測待測物物酶標(biāo)記物酶標(biāo)記物顯色程度顯色程度與待測物與待測物含量間的含量間的關(guān)系關(guān)系雙抗體夾心法雙抗體夾心法（一步法）（一步法）抗體抗體A抗原抗原酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體B正相關(guān)正相關(guān)間接法間接法抗原抗原抗體抗體酶標(biāo)二抗酶標(biāo)二抗正相關(guān)正相關(guān)競爭法競爭法抗

32、原抗原（抗體）（抗體）抗體抗體（抗原）（抗原）酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體（抗原）（抗原）負(fù)相關(guān)負(fù)相關(guān)捕獲法捕獲法抗抗IgMIgM酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體正相關(guān)正相關(guān)ELISAELISA的操作要點(diǎn)的操作要點(diǎn)1 1 標(biāo)本的采取和保存標(biāo)本的采取和保存廣泛：體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物廣泛：體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便），大部分檢測以血清為標(biāo)本。（如尿液、糞便），大部分檢測以血清為標(biāo)本。5 5天內(nèi)測定的血清，天內(nèi)測定的血清，44，超過一周，超過一周，低溫冰存低溫冰存。凍結(jié)血清融解后，應(yīng)充分混勻，避免氣泡凍結(jié)血清融解后，應(yīng)充分混勻，避免氣泡 ?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后

33、再混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。檢測。測抗體的血清如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。測抗體的血清如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。3 加樣2 2 試劑的準(zhǔn)備試劑的準(zhǔn)備按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。從冰箱中取出的試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。從冰箱中取出的試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗(yàn)不用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。試劑盒中本次試驗(yàn)不用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。 一般有一般有3 3次加樣，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。次加樣，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEIS

34、ALEISA板孔的底部，避免加板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。4 4 保溫（溫育）保溫（溫育）常采用常采用4343、3737、室溫和、室溫和44（冰箱溫度）等。（冰箱溫度）等。3737是常用的保溫溫度。是常用的保溫溫度。也采用也采用44過夜，抗原抗體反應(yīng)過夜，抗原抗體反應(yīng)44更為徹底。更為徹底。一般采用水浴，將一般采用水浴，將ELISAELISA板置于水浴箱中，板置于水浴箱中，ELISAELISA板底應(yīng)板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保

35、鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應(yīng)，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。板漂浮在水面上。 5 5 洗滌洗滌通過洗滌來達(dá)到分離通過洗滌來達(dá)到分離游離的游離的和和結(jié)合的結(jié)合的酶標(biāo)酶標(biāo)記物的目的。記物的目的。 洗滌的方式除某些洗滌的方式除某些ELISAELISA儀器配有特殊的自動儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種。洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種。浸泡式浸泡式 a.a.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液；吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液；b.b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）；用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）；c.c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔

36、，放置浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-21-2分鐘，間歇搖動，分鐘，間歇搖動，d.d.吸干孔內(nèi)液體。吸干應(yīng)徹底，可用水泵或真空泵抽吸，吸干孔內(nèi)液體。吸干應(yīng)徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；e.e.重復(fù)操作重復(fù)操作c c和和d d，洗滌，洗滌3-43-4次（或按說明規(guī)定）。次（或按說明規(guī)定）。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。 6 6 顯色和比色顯色和比色OPDOPD底物顯色在室溫或底物顯色在室溫或3737反應(yīng)反應(yīng)20-3020-30分鐘后分鐘后即不再加深，即不再加深， OP

37、DOPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。 TMBTMB經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后，約作用后，約4040分鐘顯色達(dá)頂峰，分鐘顯色達(dá)頂峰，TMBTMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDSSDS）能使藍(lán)色維持較長時(shí)間（）能使藍(lán)色維持較長時(shí)間（12-2412-24小時(shí)）小時(shí)）是目視判斷的良好終止劑。酸性終止液則會使是目視判斷的良好終止劑。酸性終止液則會使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長（藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長（450nm450nm）測讀吸光值。測讀吸光值。比色比色拭干板底附著的液體，正確放入酶

38、標(biāo)比色儀的比色架中拭干板底附著的液體，正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中蒸餾水校零點(diǎn)蒸餾水校零點(diǎn)比色結(jié)果的表達(dá)用光密度（比色結(jié)果的表達(dá)用光密度（oplical densityoplical density，ODOD），），或吸光度（或吸光度（absorbenceabsorbence，A A），兩者含義相同。），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于通常的表示方法是，將吸收波長寫于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸收波長為的吸收波長為492nm492nm，表示方法為，表示方法為A492nmA492nm或或OD492nmOD492nm。 吸光度減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算

39、吸光度減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算酶標(biāo)比色儀酶標(biāo)比色儀 酶標(biāo)儀，專用于測讀酶標(biāo)儀，專用于測讀ELISAELISA結(jié)果吸光度的光度計(jì)。酶標(biāo)儀結(jié)果吸光度的光度計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性的主要性能指標(biāo)有：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到一般可精確到0.0010.001，準(zhǔn)確性為，準(zhǔn)確性為1%1%，重復(fù)性達(dá)，重復(fù)性達(dá)0.5%0.5%。應(yīng)注意可測范圍與線性范圍的不同，線性范圍常小于可應(yīng)注意可測范圍與線性范圍的不同，線性范圍常小于可測范圍，比如某一酶標(biāo)儀的可測范圍為

40、測范圍，比如某一酶標(biāo)儀的可測范圍為0.0000.0002.9002.900，而其線性范圍僅而其線性范圍僅0.0000.0002.0002.000，這在定量，這在定量ELISAELISA中制作中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)予注意。標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)予注意。 結(jié)果判斷結(jié)果判斷 1 1 定性測定定性測定對受檢標(biāo)本中是否含有待測抗原或抗體作出對受檢標(biāo)本中是否含有待測抗原或抗體作出“有有”或或“無無”的的簡單回答，分別用簡單回答，分別用“陽性陽性”、“陰性陰性”表示表示在間接法和夾心法在間接法和夾心法ELSIAELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法在競爭法ELISAELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。2 2 定量測定定量測定定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定大分子量物質(zhì)的夾心法測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISAELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線最高點(diǎn)的吸光度可接近寬，曲線最高點(diǎn)的吸光度可接近2.02.0，繪制時(shí)常用半對數(shù)紙，繪制時(shí)常用半對數(shù)紙，以檢測物的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度的以檢測物的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈值逐