細(xì)菌DNA的提取方法

1、細(xì)菌DNA的提取方法針對(duì)一些不易于提取的細(xì)菌的方法:試驗(yàn)試劑：抽提緩沖液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl10MLiCl2MLiClDEPC-water（抑制RNA酶活性）3MNaAc(pH5.2)96%乙醇70%乙醇試驗(yàn)步驟：1、抽提緩沖液65預(yù)熱。2、加菌體到已經(jīng)預(yù)熱的緩沖液（700ul）中混勻，65，10min。3、加酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），振蕩，以12,000rpm，離心10min。4、取上清，加氯仿/異戊醇（24：1）振蕩，以12,000rpm，離心10min。

2、5、重復(fù)再作一次步驟4。6、加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇），20C下沉淀。7、以2,000rpm，離心10min。8、棄上清，以70乙醇條洗沉淀，也可以再用100乙醇洗，然后溶解于100ml水中。較為常用的細(xì)菌DNA提取方法：實(shí)驗(yàn)步驟：1、將菌株接種于液體LB培養(yǎng)基，37震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2、取1.5ml培養(yǎng)物12000rpm離心2min。3、沉淀中加入567ul的TE緩沖液，反復(fù)吹打使之重新懸浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混勻，于37溫育1h.4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混勻，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混勻

3、后再65溫育10min。5、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min,將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來(lái)，沉淀可稍加離心。6、沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后，離心棄乙醇真菌DNA提取總結(jié)的兩種方法：第一種方法：試驗(yàn)步驟：1、取真菌菌絲0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。2、加入4mL提取液，快速振蕩混勻。3、加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1)，渦旋35min（此處是粗提沒(méi)有加酚）。4、以4，1000rpm，離心5min。5、上清再用等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次。以4，10,000rpm，離心5min。6、取上清，加入2

4、/3倍體積的-20預(yù)冷的異丙醇或2.5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀,混勻,靜置約30min。7、用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次,再用無(wú)水乙醇漂洗1次,吹干，重懸于500ulTE中。8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37下處理1h。9、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次。以4，10,000rpm，離心5min。10、取上清，加入1/10倍體積的3MNaAc,2.5倍體積的無(wú)水乙醇,-70沉淀30min以上。11、沉淀用75%乙醇漂洗，風(fēng)干,溶于200ulTE中，-20保存?zhèn)溆?。DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7

5、.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1SDS，3MNaAc。第二種方法：試驗(yàn)步驟：1、真菌菌絲0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉。2、加入3mL65預(yù)熱的DNA提取緩沖液，快速振蕩混勻65水浴30min,期間混勻2-3次。3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。4、等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4離心5min）。5、取上清，加入2/3倍體積的-20預(yù)冷異丙醇,混勻,靜置約30min。6、用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次,再用無(wú)水乙醇漂洗1次,吹干，重懸于500ulTE中。7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37處理1h。8、

6、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次。以4，10,000rpm，離心5min。9、取上清，1/10V3MNaAc,2.5V體積的無(wú)水乙醇,-70沉淀30min以上。10、沉淀用75%乙醇漂洗，風(fēng)干,溶于200ulTE中，-20保存?zhèn)溆?。?xì)菌基因組DNA的提取方法綜述，提供了5種方法。1 快速微量提取法A.取1.5ml菌體培養(yǎng)物于一滅菌Ep管中，12000rpm離心1min, 丟去上清夜，收集菌體。B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸鈉,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混勻,置于37oC水浴1hr。C.然后加入2

7、00ul5mol/L的氯化鈉溶液，混勻后于13000rpm離心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加兩倍體積無(wú)水乙醇，1/10體積醋酸鉀(3M ,pH8.0)，-20度保存1小時(shí)后，13000rpm離心15min，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室溫干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4保存?zhèn)溆谩? 蛋白酶/SDS法制備先用10ml含適當(dāng)抗生素的GBM過(guò)夜培養(yǎng)Delftia sp.，第二天4000rpm離心10min收集菌體，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌體2次，之后將菌體充分懸浮在5

8、ml 1TE緩沖液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，輕輕混勻后50放置3h5h，接著用等體積的Tris飽和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自動(dòng)移液器吸管頭將絮狀DNA沉淀塊吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于適當(dāng)1TE或ddH2O中。31) 細(xì)菌培養(yǎng)：細(xì)菌接種于5ml液體培養(yǎng)基中，37搖床（300rpm）培養(yǎng)過(guò)液。2) 細(xì)菌收集：取1ml培養(yǎng)物于1.5ml EP管中，室溫8000rpm離心5min，棄上清，沉淀重新懸浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。3) 菌體裂解：加入6l 50mg/

9、ml的溶菌酶，37作用2h。再加2mol/LNaCl50l，10%SDS 110l，20mg/ml的蛋白酶K 3l，50作用3h或37過(guò)夜。（此時(shí)菌液應(yīng)為透明粘稠液體）4) 抽提：菌液均分到兩個(gè)1.5ml EP管，加等體積的酚氯仿異戊醇(25241)，混勻，室溫放置5-10min。12000rpm離心10min。抽提兩次。（上清很粘稠，吸取時(shí)應(yīng)小心，最好槍頭尖應(yīng)剪去）5) 沉淀：加0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10min。1 2000rpm離心10min。6)洗滌：沉淀用75%的乙醇洗滌。7) 抽（涼）干后，溶于50l ddH2O中，取2-5l電泳。作PCR模板用。4. DNA EXTR

10、ACTION PROCEDURE - GENERAL1) Grow cells overnight in 500 ml broth medium.2) Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM EDTA.3) Freeze cell suspension at -20C4) Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, and let thaw at room temperat

11、ure. When thawed, place on ice for 45 min.5) Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Place in 50C water bath for 60 min.6) Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15 min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this

12、 step if necessary.7) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase. Dissolve overnight by rocking at 4C.8) Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge

13、 at 10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube.9) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).10) Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA.11) Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis.51) 100m

14、l 細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)液, 5000rpm離心10分鐘, 去上清液。2) 加9.5ml TE懸浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50l 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混勻, 37保溫1小時(shí)。3) 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混勻。4) 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混勻, 65保溫20分鐘。5) 用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm離心10分鐘, 將上清液移至干凈離心管。6) 用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干凈管中。7) 加1倍體積異丙醇, 顛倒混合, 室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。8) 用玻棒撈出DN

15、A沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20保存。如DNA沉淀無(wú)法撈出,可5000rpm離心, 使DNA沉淀。9) 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三節(jié)中操作步驟處理。注：1)CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2O,緩慢加入10g CTAB,加水至100ml。2)氯仿:異戊醇(24:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，異丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉劑)，5mol/L NaCl。本方法通過(guò)SDS裂解細(xì)胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分一：儀器：同方法一 二：試劑：TE、TAE緩沖液；10%SDS；NaCL；20mg/ml蛋白酶；CTAB/NaCL溶液(10% CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml水中，緩慢加入10gCTAB，加熱溶解)；25/24/1,酚/氯仿/異戊醇; 24/1,氯仿/異戊醇；異丙醇；及100%乙醇三：操作 1.5ml 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌細(xì)胞 離心，5000rpm,1min 沉淀 溶于500l TE緩沖液中混勻 30l 10