電泳儀和毛細(xì)管電泳儀

1、電泳儀和毛細(xì)管電泳儀胡水旺病理生理學(xué)教研室1第一節(jié) 電泳 帶電顆粒在電場電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳(electrophoresis, EP) 利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達(dá)到分離的技術(shù)稱為電泳技術(shù)電泳技術(shù)2電泳發(fā)展簡史1897，Kohlausch推導(dǎo)出帶電粒子移動的理論公式20世紀(jì)初，Hardy發(fā)現(xiàn)許多生物膠體粒子的遷移率取決于電解質(zhì)溶液的pH值320世紀(jì)50年代，出現(xiàn)支持物的區(qū)帶電泳80年代后期，出現(xiàn)毛細(xì)管電泳，芯片電泳1937年瑞典化學(xué)家Tiselius將血清蛋白分成清蛋白、1-、2-、-球蛋白（移界電泳法）+點(diǎn)樣線諾貝爾獎4目前，電泳技術(shù)在生物大分子生物大分子

2、尤其是蛋白質(zhì)和核酸的分離、分析和鑒定上具有巨大優(yōu)勢。生物化學(xué)與分子生物學(xué)的“常規(guī)武器”及常用工具。5電泳電泳原理原理 基本原理：基本原理： 不同的物質(zhì)，由于其帶電性質(zhì)、顆粒不同的物質(zhì)，由于其帶電性質(zhì)、顆粒形狀和大小不同，因而在一定的電場中它形狀和大小不同，因而在一定的電場中它們的們的移動方向移動方向和和移動速度移動速度也不同，因此可也不同，因此可使它們分離。使它們分離。6一、電泳遷移率一、電泳遷移率（Electrophoresis mobility） 當(dāng)顆粒的摩擦力與電場力相等時：F = E Q = f f摩擦系數(shù)f 帶電顆粒的電場力：F = E QF+_QEL7 根據(jù)Stoke公式: 顆粒半

3、徑， 介質(zhì)粘度不同物質(zhì)顆粒具有不同電泳速度8電泳遷移率或電泳淌度（電泳遷移率或電泳淌度（ ） = = EQ6 適用于球形帶電粒子 帶電粒子在單位電場強(qiáng)度作用下的移動速度9 = = = Ed / t U / Ld L t U-+-d Ad BABdd = dA - d B = ( A- B ) t UL物質(zhì)間能否分離取決于它們遷移率的差異淌度不同是HPCE分離的基礎(chǔ)10二、 影響電泳速度的因素11等電點(diǎn)：蛋白質(zhì)（或兩性電解質(zhì)）所帶的凈電荷為0時溶液的值。此時它們在電場中的遷移率為0。12兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì)：兩性電解質(zhì)就是既能當(dāng)酸又能當(dāng)堿用的電解質(zhì)。兩性電解質(zhì)通常為兩性元素的氧化物的水合物、氨基

4、酸等。電場強(qiáng)度 E 離子強(qiáng)度 I 電流強(qiáng)度 I I 131). 雙電層pH3時，Si OH SiO -石英毛細(xì)管142).電滲流（EOF）電滲現(xiàn)象中整體移動著的液體電滲：電滲流：在高電場的作用下引起柱中的溶液整體向一個方向移動的現(xiàn)象SiO-電泳緩沖液+-15電滲流方向電滲引起緩沖液從毛細(xì)管一端向另一端流動。一般方向是從陽極到陰極16電滲流形狀 電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為平流，塞式流動（譜帶展寬很小）液相色譜中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。17電滲流的大小電滲流速度大于電泳速度帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流兩種速度

5、的矢量和18-電泳緩沖液流動方向+-+合理利用電滲流可以使陽離子、中性分子、陰離子實(shí)現(xiàn)同時分離分析顆粒的電泳方向與電滲方向相同時，相對19介質(zhì)對樣品的滯留作用吸附作用越強(qiáng)，三. 電泳的分類按電壓高低常壓電泳：100500 V按支持介質(zhì)區(qū)帶電泳高壓電泳：500 V自由電泳20電泳電泳方法方法 （一）紙電泳（一）紙電泳 支持載體：濾紙支持載體：濾紙21濾紙條水平架設(shè)樣品點(diǎn)于濾紙中央濾紙被潤濕蓋上絕緣密封罩輸入直流電壓特點(diǎn)特點(diǎn)： 對蛋白質(zhì)吸附小，消除拖尾現(xiàn)象對蛋白質(zhì)吸附小，消除拖尾現(xiàn)象 分離速度快分離速度快 電泳時間短電泳時間短 樣品樣品用量少用量少22（二）醋酸纖維素薄膜電泳檢測微量異常蛋白特點(diǎn)特

6、點(diǎn)：機(jī)械強(qiáng)度好、彈性大、透明、機(jī)械強(qiáng)度好、彈性大、透明、 化學(xué)穩(wěn)定性高、無電滲作用、設(shè)備簡單、化學(xué)穩(wěn)定性高、無電滲作用、設(shè)備簡單、 樣品量小、分辨率高樣品量小、分辨率高 23（三）凝膠電泳利用利用pH值梯度介質(zhì)，分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)值梯度介質(zhì)，分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)24樣品各組分別聚焦在各自等電點(diǎn)樣品各組分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的相應(yīng)的pH值值位置成一條清晰而位置成一條清晰而穩(wěn)定的窄帶。穩(wěn)定的窄帶。 （四）等電聚焦電泳特點(diǎn)：樣品用量少、分辨率高 電泳速度快、加入樣品的位置可意選任擇 測定物質(zhì)的等電點(diǎn) 中、大分子量生物組分的分離分析。 采用兩種不同濃度的電解質(zhì)組成，一種為前導(dǎo)電采用兩種不同濃度

7、的電解質(zhì)組成，一種為前導(dǎo)電解質(zhì)，充滿整個毛細(xì)管柱；另一種為尾隨電解質(zhì)，解質(zhì)，充滿整個毛細(xì)管柱；另一種為尾隨電解質(zhì)，置于一端的電泳槽中。前導(dǎo)電解質(zhì)的遷移率高于置于一端的電泳槽中。前導(dǎo)電解質(zhì)的遷移率高于任何樣品組分，后者則低于任何樣品組分，被分任何樣品組分，后者則低于任何樣品組分，被分離的組分按其不同的遷移率夾在中間，在強(qiáng)電場離的組分按其不同的遷移率夾在中間，在強(qiáng)電場的作用下，各被分離組分在前導(dǎo)電解質(zhì)與尾隨電的作用下，各被分離組分在前導(dǎo)電解質(zhì)與尾隨電解質(zhì)之間的解質(zhì)之間的空隙中空隙中移動，實(shí)現(xiàn)分離。移動，實(shí)現(xiàn)分離。25（五）等速電泳（五）等速電泳（六）雙向凝膠電泳（二維電泳）六）雙向凝膠電泳（二維電

8、泳） 26第一向：等電聚焦電泳 （IEF）根據(jù)復(fù)雜的蛋白質(zhì)成分中各個蛋白質(zhì)的PI的不同，將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。第二向：凝膠電泳 （SDS-PAGE）按蛋白質(zhì)分子量的大小在垂直方向進(jìn)行分離。其結(jié)果現(xiàn)為斑點(diǎn)狀 。27IEF流程圖流程圖雙向電泳原理雙向電泳原理第二向：第二向：SDS-PAGESDSpH梯度第一向等電聚焦PI第二向SDSPAGE凝膠分子量pHSDS-PAGEPI30雙向電泳31 (七七）免疫電泳）免疫電泳32抗原樣品在瓊脂平板上進(jìn)行電泳分離加入抗體抗體擴(kuò)散中與抗原相遇并反應(yīng)出現(xiàn)沉淀弧33第二節(jié)第二節(jié) 電泳儀的臨床應(yīng)用電泳儀的臨床應(yīng)用 一、一、 血清蛋白電泳血清蛋白電泳 新鮮血清經(jīng)醋酸纖維薄

9、膜或瓊脂糖電泳、染色后，新鮮血清經(jīng)醋酸纖維薄膜或瓊脂糖電泳、染色后，通常可見通?？梢? 5條帶，即清蛋白、條帶，即清蛋白、 1 1、 2 2、 和和 球蛋白。球蛋白。許多疾病總血清蛋白濃度和各蛋白組分的比例有所許多疾病總血清蛋白濃度和各蛋白組分的比例有所改變，通過血清蛋白電泳圖譜能幫助我們對某些疾改變，通過血清蛋白電泳圖譜能幫助我們對某些疾病進(jìn)行診斷及鑒別診斷。病進(jìn)行診斷及鑒別診斷。 34血清蛋白電泳圖譜二、尿蛋白電泳二、尿蛋白電泳 臨床進(jìn)行尿蛋白電泳的主要目的是：確定臨床進(jìn)行尿蛋白電泳的主要目的是：確定尿蛋白的來源；了解腎臟病變的嚴(yán)重程度（選尿蛋白的來源；了解腎臟病變的嚴(yán)重程度（選擇性蛋白尿

10、與非選擇性蛋白尿），從而有助于診擇性蛋白尿與非選擇性蛋白尿），從而有助于診斷和預(yù)后的判斷。當(dāng)斷和預(yù)后的判斷。當(dāng) 不能進(jìn)行腎活檢時，不能進(jìn)行腎活檢時， 尿蛋白電泳結(jié)果能尿蛋白電泳結(jié)果能 很好地協(xié)助臨床判斷很好地協(xié)助臨床判斷 腎臟的主要損害腎臟的主要損害。 35尿蛋白電泳圖譜尿蛋白電泳圖譜 三、血紅蛋白及糖化血紅蛋白電泳血紅蛋白及糖化血紅蛋白電泳 應(yīng)用應(yīng)用電泳法鑒別患者血液中電泳法鑒別患者血液中Hb的類型及含量，對的類型及含量，對于貧血類型的臨床診斷及治療具有重大意義。于貧血類型的臨床診斷及治療具有重大意義。Hb電電泳結(jié)果應(yīng)根據(jù)不同年齡人群進(jìn)行分析。泳結(jié)果應(yīng)根據(jù)不同年齡人群進(jìn)行分析。 36血紅蛋白

11、電泳圖譜四、免疫固定電泳四、免疫固定電泳 可可對各類對各類IgIg及其輕鏈進(jìn)行分型，最常用于臨床常規(guī)及其輕鏈進(jìn)行分型，最常用于臨床常規(guī)M M蛋白的分型與鑒定。一般用于單克隆蛋白的分型與鑒定。一般用于單克隆IgIg增殖病、單增殖病、單克隆克隆IgIg病、本周氏蛋白和游離輕鏈病、多組分單克病、本周氏蛋白和游離輕鏈病、多組分單克隆隆IgIg病、重鏈病、病、重鏈病、 CSFCSF寡克隆蛋白鑒寡克隆蛋白鑒 別、多克隆別、多克隆IgIg病的病的 診斷和鑒別診斷。診斷和鑒別診斷。37免疫固定電泳圖譜免疫固定電泳圖譜 五、五、 同工酶電泳同工酶電泳 同工酶電泳用于臨床上常見的同工酶或同工酶同工酶電泳用于臨床上

12、常見的同工酶或同工酶亞型分析。亞型分析。 1 1乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶(LD/LDH)(LD/LDH)同工酶：同工酶： 2 2肌酸激酶（肌酸激酶（CKCK）同工酶：）同工酶： 3 3CKCK同工酶亞型：同工酶亞型： 38 同工酶電泳圖譜 六、脂蛋白電泳六、脂蛋白電泳 脂蛋白電泳檢測各種脂蛋白（包括膽固醇和甘油三脂蛋白電泳檢測各種脂蛋白（包括膽固醇和甘油三酯）主要用于高脂血癥的分型、冠心病危險性估計，酯）主要用于高脂血癥的分型、冠心病危險性估計，以及動脈粥樣硬化性及相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展、診斷以及動脈粥樣硬化性及相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療（包括治療性生活方式改變、飲食及調(diào)脂藥物和治療（包括治療

13、性生活方式改變、飲食及調(diào)脂藥物冶療）效果觀察的研究等。冶療）效果觀察的研究等。39脂蛋白電泳圖譜第三節(jié) 高效毛細(xì)管電泳（HPCE）基本原理：在毛細(xì)管內(nèi)實(shí)現(xiàn)的電泳技術(shù)在毛細(xì)管內(nèi)實(shí)現(xiàn)的電泳技術(shù)40所用分離柱的柱徑大，柱較短，分離效率不高（遠(yuǎn)低于HPLC），溫度影響大。2.高效毛細(xì)管電泳技術(shù)上的重要突破1）采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細(xì)管2）采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓3）柱效遠(yuǎn)高于HPLC色譜經(jīng)典電泳與高效毛細(xì)管電泳1.經(jīng)典電泳分離法的不足41HPCE的特點(diǎn)：高效（每米塔板數(shù)為十萬、百萬、千萬）高速（幾十秒內(nèi)完成）高靈敏度（10-1910-21mol）樣品用量少（納升）應(yīng)用范圍廣（無機(jī)離子到整個細(xì)胞）重現(xiàn)

14、重現(xiàn)性好性好進(jìn)樣準(zhǔn)確性高準(zhǔn)確性高42HPCE的基本工作原理溶液中的帶電粒子以高壓電場為驅(qū)動力，沿毛細(xì)管通道，以不同速度向與其所帶電荷相反的電極方向遷移，并依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離。43緩沖液充滿毛細(xì)管柱進(jìn)樣端換上樣品池，進(jìn)樣換回緩沖液池各組分淌度和分配差異而實(shí)現(xiàn)分離紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測器分析流程儀器裝置施加高壓電壓數(shù)據(jù)記錄與處理系統(tǒng)色譜圖44030KV; 200300A高壓電源：毛細(xì)管柱：石英材料; 內(nèi)徑為2575m紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測器檢測器：進(jìn)樣技術(shù)：電動進(jìn)樣（電遷移進(jìn)樣）氣動進(jìn)樣（壓差進(jìn)樣）進(jìn)樣端加壓出口端減壓虹吸作用45毛細(xì)管電泳的分離模式v1.毛細(xì)管區(qū)

15、帶電泳 （CZEv2.毛細(xì)管凝膠電泳 CGEv3.毛細(xì)管膠束電動色譜（MECC)v4.毛細(xì)管電色譜（CEC461.毛細(xì)管區(qū)帶電泳整個系統(tǒng)都用同一種緩沖溶液充滿。背景電解質(zhì)的濃度一般高于試樣，起運(yùn)載電流的作用，其離子有一定的遷移率。小分子離子，生物大分子或反應(yīng)生成離子的物質(zhì)基于試樣中各個組分間荷質(zhì)比的差異47毛細(xì)管種類 非涂層毛細(xì)管（裸管） 內(nèi)壁涂層毛細(xì)管（涂層管）(聚乙烯醇類(PVA) 涂層毛細(xì)管/CEP 涂層毛細(xì)管)-+EOF0tm (min) Parabolic Resistance to flow at surface More diffusion/broader detection z

16、one Minimizes band broadening Narrows detection zone電滲流是CE中最大的驅(qū)動力來源之一電滲流的正面及負(fù)面作用 正面作用正面作用 增加分離速度增加分離速度 使得正、負(fù)電荷物使得正、負(fù)電荷物質(zhì)同時分離質(zhì)同時分離 負(fù)面作用負(fù)面作用 減少分離時間和分減少分離時間和分離有效距離離有效距離 電滲流的波動極大電滲流的波動極大的影響了遷移時間的影響了遷移時間的重復(fù)性的重復(fù)性影響電滲流的因素 pH值 pH越高，電滲流越大 離子強(qiáng)度 離子強(qiáng)度越高，電滲流越小 緩沖溶液添加劑 離子型表面活性劑、有機(jī)溶劑、環(huán)糊精電滲流隨pH的變化情況控制電滲流的三個重要手段1. 采

17、用涂層毛細(xì)管，消除電滲流的影響2. 改變pH，從而調(diào)整電滲流的大小。pH10以后，電滲流基本不增加3. 添加劑：有機(jī)溶劑可以降低電滲流的大小，從而增加分離的有效距離；表面活性劑可以徹底改變電滲流的方向和大小，主要是在陰離子分析時使用緩沖溶液的影響和選擇 在CE中應(yīng)該根據(jù)以下性質(zhì)來選擇緩沖溶液：1. 在所選的pH范圍內(nèi)有較強(qiáng)緩沖能力；2. 在檢測波長處有低的紫外吸收；3. 小的淌度（即大體積、低電荷離子）以降低所產(chǎn)生的電流。 那些被稱為生物“優(yōu)良緩沖液”的，如Tris, borate, CAPS等特別有用，因?yàn)檫@些緩沖溶液中的離子一般較大，能夠在較高濃度下使用而不會產(chǎn)生大的電流，但一個潛在的缺點(diǎn)

18、是這些大的緩沖離子有強(qiáng)的紫外吸收。常用的CE緩沖體系 磷酸鈉體系 寬緩沖范圍 硼酸鈉體系 高pH范圍 Tris-HCl體系 低pH范圍 醋酸-醋酸銨體系 CE/MS常用體系 2.毛細(xì)管凝膠電泳 毛細(xì)管內(nèi)先填充凝膠(例如polyacrylamide或cellulose)，此時凝膠會在毛細(xì)管內(nèi)形成分子篩，樣品依分子量的大小在毛細(xì)管內(nèi)移動速度不同而進(jìn)行分離。 用于核酸片斷及蛋白分子量分析CE雙鏈及單鏈核酸分析45-寡核苷酸質(zhì)控寡核苷酸質(zhì)控 1.0 2.0 3.0123 456789101112131415161718192023242526272829303031323334IS21 10.0 15

19、.0Relative Fluorescence IntensitydsDNA片段片段 (72 bp-12 Kbp)CE-SDS蛋白分子量分析3.毛細(xì)管膠束電動色譜按淌度和疏水性不同進(jìn)行分離61中加入表面活性劑(surfactant，例如SDS)，使之形成膠束（Micelle），樣品根據(jù)其疏水性(Hydrophobicity)強(qiáng)弱的差異，在膠束與電解質(zhì)的分配系數(shù)有所不同來進(jìn)行分離 ，樣品疏水性愈強(qiáng)，則進(jìn)入膠束的機(jī)會愈大。通常物質(zhì)進(jìn)入膠束后，泳動的速度會變慢，因此疏水性愈強(qiáng)的物質(zhì)則愈慢出來。毛細(xì)管膠束電動色譜原理SDS-+EOFMicellar Electrokinetic Chromatogra

20、phy (MEKC)七種青霉素的分離(A) CZE : 20mM Pi-Borate, pH 8.5(B) MEKC : 0.1 M SDS in (A) soln. 膠束電動色譜的特點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 增加對弱極性物質(zhì)分離的分離度 在中藥分析、天然產(chǎn)物分析、農(nóng)藥分析中經(jīng)常使用 缺點(diǎn) 穩(wěn)定性不佳，達(dá)到好的重復(fù)性比較困難 4.毛細(xì)管電色譜(CEC)v利用電滲驅(qū)動電滲驅(qū)動溶劑通過高效液相色譜毛細(xì)管柱，利用試樣在兩相的分配進(jìn)行分離。67v能夠分離不帶電荷的物質(zhì)。v不需要壓力泵系統(tǒng)的情況下，提供了微量體積試樣溶液的高效分離通過電滲流泵，而不是通過機(jī)械輸送流動相通過固定相的。簡化了輸送體系。v電滲泵產(chǎn)生的是電滲泵

21、產(chǎn)生的是塞子式塞子式流動輪廓，而不是流體動力流動輪廓，而不是流體動力學(xué)輪廓，因此毛細(xì)管電色譜的分離柱效比高效液相學(xué)輪廓，因此毛細(xì)管電色譜的分離柱效比高效液相色譜法高。色譜法高。特點(diǎn)：68 1. DNA分析 DNA分析包括堿基、核苷、核苷酸、寡核苷酸、引物、探針、單鏈DNA、雙鏈DNA(DNA片段、PCR產(chǎn)物)分析及DNA序列測定。CZE和MECC通常用來分離堿基、核苷酸、簡單的核苷酸等。CGE則用于較大的寡核苷酸、ssDNA、dsDNA和DNA序列分析。已有CE測定DNA序列的商品儀器面市，但快速測定DNA序列仍在研究中。69第四節(jié)第四節(jié) 毛細(xì)管電泳的應(yīng)用與發(fā)展動向毛細(xì)管電泳的應(yīng)用與發(fā)展動向

22、2. 肽和蛋白分析 CE在生物大分子蛋白和肽的應(yīng)用可概括為兩大方面：一是其結(jié)構(gòu)的表征，二是研究相互作用。CE已廣泛用作最有效的純度檢測手段，它可檢測出多肽鏈上單個氨基酸的差異。用CIEF測定等電點(diǎn)，分辨度可達(dá)0.01pH單位。肽譜用CE/MS聯(lián)用進(jìn)行分析，可推斷蛋白的分子結(jié)構(gòu)。用CE進(jìn)行蛋白本身反應(yīng)及和小分子相互作用研究是研究熱點(diǎn)，蛋白和DNA分析始終是CE研究的重點(diǎn)，今后會有更多的研究。70 3.手性分離 手性對映體分離、鑒定有巨大的應(yīng)用價值，已成為醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)一個重要課題。除CIEF外，其余五種模式均可用于手性分離。CE進(jìn)行手性分離，通常均在運(yùn)行緩沖液內(nèi)加入手性選擇劑，在操作及分離效率上均優(yōu)

23、于HPLC手性分離。今后CE手性分離將會在發(fā)展更多手性選擇劑、更深入地探討分離機(jī)理及手性藥物在體內(nèi)的作用及代謝等方面開展研究。71 4.藥物分析和臨床檢測 目前CE在藥物和臨床研究領(lǐng)域已成為不可缺少的有力手段，但在醫(yī)藥領(lǐng)域尚未確定為法定方法，故未得到廣泛使用。醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)大量研究工作表明CE正在走向成熟。而CE/MS聯(lián)用也將促進(jìn)CE快速發(fā)展。CE在臨床化學(xué)中除進(jìn)行臨床分子生物學(xué)測定外，也廣泛用于疾病臨床診斷、臨床蛋白分析、臨床藥物監(jiān)測和藥物代謝研究。藥物代謝研究對CE是一個挑戰(zhàn)，雖有不少成功報道，但在提高靈敏度、解決蛋白吸附等方面仍待改進(jìn)。72 5.環(huán)境監(jiān)測和離子分析 CE在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用也日

24、趨增多，目前主要集中在用各種模式，包括CEC分離監(jiān)測土壤等環(huán)境中的多環(huán)芳烴(PAHs)，可在10min內(nèi)分離16種多環(huán)芳烴。CE在環(huán)境監(jiān)測中應(yīng)用還需提高靈敏度和發(fā)展?jié)饪s、富集方法。CE較重要的應(yīng)用還有糖的分析，目前最成功的是用APTS作糖的衍生化試劑，標(biāo)記后用LIF可進(jìn)行單糖和多糖的測定。73 6.單細(xì)胞、單分子監(jiān)測 單細(xì)胞、單分子檢測是CE研究達(dá)到的最高境界，對生命科學(xué)和化學(xué)有巨大潛在意義單細(xì)胞監(jiān)測或許會對細(xì)胞水平的藥理學(xué)、了解生命過程提供一種活體檢測手段。單個DNA分子的檢測早有報道，最近EYeung報道用CE監(jiān)測單個蛋白分子，是一突破性的進(jìn)展，表明科學(xué)家向研究單分子間的各種化學(xué)和生物反應(yīng)跨出了決定性的一步。74 7.毛細(xì)管電