分選型流式細胞儀課件

1、BDBD公司生物科學部公司生物科學部 BD公司簡介n BD是由是由Maxwell W.Becton和和Fairleigh S. Dickinson于于1897年在紐約創(chuàng)立的，總部設(shè)在新澤西州。年在紐約創(chuàng)立的，總部設(shè)在新澤西州。n 經(jīng)過經(jīng)過100多年的發(fā)展，多年的發(fā)展，BD已成為世界上最大的醫(yī)療技術(shù)已成為世界上最大的醫(yī)療技術(shù)及醫(yī)療設(shè)備公司之一，它以領(lǐng)先的技術(shù)、卓越的產(chǎn)品質(zhì)及醫(yī)療設(shè)備公司之一，它以領(lǐng)先的技術(shù)、卓越的產(chǎn)品質(zhì)量和誠實可信的服務(wù)贏得了全球用戶及合作伙伴的廣泛量和誠實可信的服務(wù)贏得了全球用戶及合作伙伴的廣泛贊譽。贊譽。n BD一直是全球最專業(yè)、產(chǎn)品線最全的流式細胞儀生產(chǎn)商一直是全球最專業(yè)、

2、產(chǎn)品線最全的流式細胞儀生產(chǎn)商和流式技術(shù)領(lǐng)導者。全球市場占有率達到和流式技術(shù)領(lǐng)導者。全球市場占有率達到80，中國市，中國市場占有率達到場占有率達到85%。 BDBD公司流式細胞儀公司流式細胞儀FACSCaliburLSRIIFACSCantoIIInfluxFACSAriaIIAccuri C6LSRFortessaFACSVerseFACSJazzBD FACSAriaIIBD FACSAriaII分選型流式細胞儀分選型流式細胞儀 20082008年最新產(chǎn)品年最新產(chǎn)品 集多種專利技術(shù)和完美設(shè)計集多種專利技術(shù)和完美設(shè)計n 流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)(Flow Cytometry,簡稱簡稱FCM)是一種

3、快速、準是一種快速、準確、客觀的同時檢測直線流動狀態(tài)中單個顆粒多項物理確、客觀的同時檢測直線流動狀態(tài)中單個顆粒多項物理及生物學特性，加以分析定量的技術(shù)，并可以對特定群及生物學特性，加以分析定量的技術(shù)，并可以對特定群體加以分選。體加以分選。n 研究對象為生物顆粒，如各種細胞、染色體、微生物及研究對象為生物顆粒，如各種細胞、染色體、微生物及人工合成微球等。人工合成微球等。n 流式細胞儀流式細胞儀(Flow Cytometer)集激光技術(shù)、電子物理技集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計算機技術(shù)、細胞熒光化學技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計算機技術(shù)、細胞熒光化學技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型

4、高科技儀器。術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。 基本概念基本概念 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) 光學系統(tǒng)光學系統(tǒng) 電子系統(tǒng)電子系統(tǒng) 數(shù)據(jù)儲存與分析系統(tǒng)數(shù)據(jù)儲存與分析系統(tǒng) 分選系統(tǒng)分選系統(tǒng)流式細胞儀組成流式細胞儀組成Fluidics CartCytometer液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)AIR PRESSUREBULKINJECTIONSheath TankAIR PRESSUREASPIRATEDWASTE(VACUUM)ASPIRATEDWASTE(DEGAS)SHEATHFILTER0” 9”R1Sheath RegulatorR2Sample RegulatorV17V20V5V6液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)樣

5、品流速的選擇樣品流速的選擇 低流速：一般用于分辨率較高的分析，如低流速：一般用于分辨率較高的分析，如DNA分析分析高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，影響高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，影響分型。分型。光學系統(tǒng)光學系統(tǒng)FreqFluorescenceFSC detectorSSC and Fluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.)光信號光信號11前向角散射光信號前向角散射光信號側(cè)向角散射光信號側(cè)向角散射光信號熒光信號熒光信號LONG (700nm)550 Long Pass (650LP)650 Short Pass (600S

6、P)SHORT (500nm)Pass Through Filters600/100 Band Pass (600/100)Transmitted 550 nm550 - 650 nm (60050)Wavelengths Blocked650 nm550 nm650 nmShort PassLong PassBand PassLONG (700nm)550 Long Pass (650LP)650 Short Pass (600SP)SHORT (500nm)Dichroic FiltersTransmitted 550 nmDiflected 90650 nm550 nmFluorochr

7、omes Overview123電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換器：將光信號轉(zhuǎn)換成電信號光電轉(zhuǎn)換器：將光信號轉(zhuǎn)換成電信號 光電二極管光電二極管 光電倍增管（光電倍增管（PMT）放大器兩種放大方式：放大器兩種放大方式： 線性放大（線性放大（lin） 對數(shù)放大（對數(shù)放大（log）線性放大：按光強度的線性關(guān)系輸出信號。用于線性放大：按光強度的線性關(guān)系輸出信號。用于FSC，SSC， 細胞周期檢測，細胞周期檢測，SP細胞檢測及分選等。細胞檢測及分選等。對數(shù)放大：按光強度的對數(shù)關(guān)系輸出信號。用于大多數(shù)對數(shù)放大：按光強度的對數(shù)關(guān)系輸出信號。用于大多數(shù)熒光染色實驗。熒光染色實驗。時間( 秒)電壓脈沖面積脈沖高度脈沖寬

8、度0電脈沖信號類型：電脈沖信號類型： 高度信號高度信號H 寬度信號寬度信號W 面積信號面積信號A細胞周期中粘聯(lián)體區(qū)分細胞周期中粘聯(lián)體區(qū)分AreaHeightThreshold閾值閾值用于屏蔽噪音信號和碎片信號，只有高于等于閥值道數(shù)的用于屏蔽噪音信號和碎片信號，只有高于等于閥值道數(shù)的信號才會被送入計算機進行處理。信號才會被送入計算機進行處理。模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換器模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換器FL2時間時間時間時間FSCFL1SSC時間FL3FL1SSCFSCFL2 時間FL4數(shù)據(jù)儲存與分析系統(tǒng)數(shù)據(jù)儲存與分析系統(tǒng)數(shù)據(jù)儲存數(shù)據(jù)儲存39,27139,271Event 1Event 2Event 3FSCSSC FITCPE

9、List-Mode Data8967530,621PE-AFITC-ATimePE-AFITC-AMay be exported as FCS fileFITC/PE雙染樣本雙染樣本數(shù)據(jù)顯示數(shù)據(jù)顯示 直方圖（直方圖（Histogram） 二維點圖（二維點圖（Dot Plot） 等高線圖（等高線圖（Contour Plot） 密度圖（密度圖（Density） 三維圖（三維圖（3D Plot）等）等 直方圖：顯示單一參數(shù)（橫坐標）與通道細胞個數(shù)（縱坐標）直方圖：顯示單一參數(shù)（橫坐標）與通道細胞個數(shù)（縱坐標）。一條豎線代表一個細胞信號，多豎線累加形成峰圖，一個峰。一條豎線代表一個細胞信號，多豎線累加

10、形成峰圖，一個峰即一類細胞。即一類細胞。 二維點圖：一個點代表一個細胞信號。二維點圖：一個點代表一個細胞信號。 等高線圖：可顯示數(shù)據(jù)信號的疏密程度。等高線圖：可顯示數(shù)據(jù)信號的疏密程度。 密度圖：可顯示信號分布的疏密程度。密度圖：可顯示信號分布的疏密程度。 三維圖（三維圖（3D Plot）等）等Aria II的噴嘴位于檢測點的噴嘴位于檢測點的下方，因此更換噴嘴后的下方，因此更換噴嘴后無需重新調(diào)整激光光路無需重新調(diào)整激光光路1 1檢測檢測2 2充電充電3 3偏轉(zhuǎn)偏轉(zhuǎn)4 4收集收集分選系統(tǒng)分選系統(tǒng)分析結(jié)果精準：需要高靈敏度和分辨率分析結(jié)果精準：需要高靈敏度和分辨率-石英杯流動池石英杯流動池分選細胞純

11、度：需要對目標細胞的準確定位分選細胞純度：需要對目標細胞的準確定位-Accudrop和和Sweetspot技技術(shù)術(shù)分選速度：保證純度前提下高度分選分選速度：保證純度前提下高度分選-分選速度分選速度70 ,000個細胞個細胞/秒秒分選后活性：需要整個系統(tǒng)各環(huán)節(jié)對細胞的保護分選后活性：需要整個系統(tǒng)各環(huán)節(jié)對細胞的保護-石英杯流動池，自動無石英杯流動池，自動無菌管路清洗，溫控菌管路清洗，溫控儀器性能狀態(tài)穩(wěn)定性：質(zhì)控程序的監(jiān)控和調(diào)整儀器性能狀態(tài)穩(wěn)定性：質(zhì)控程序的監(jiān)控和調(diào)整-CS&T儀器質(zhì)控程序及儀儀器質(zhì)控程序及儀器狀態(tài)監(jiān)控器狀態(tài)監(jiān)控流式細胞儀分選要素流式細胞儀分選要素高靈敏度高靈敏度-弱表達樣本檢測弱表

12、達樣本檢測Dim staining PE population visibleDim staining高靈敏度高靈敏度稀有樣本檢測稀有樣本檢測待測細胞細胞群的比例待測細胞細胞群的比例并不總是這么高并不總是這么高有時，很低有時，很低十萬分之一十萬分之一此時，靈敏度和分辨率至關(guān)重要此時，靈敏度和分辨率至關(guān)重要傳統(tǒng)透射光路傳統(tǒng)透射光路采用長通采用長通/短通濾光片短通濾光片光信號經(jīng)過一次透射，信號損失光信號經(jīng)過一次透射，信號損失15-20%多色分析時，熒光檢測靈敏度降低多色分析時，熒光檢測靈敏度降低八角形八角形/三角形接收裝置三角形接收裝置-BD專利專利采用全反射雙色光鏡采用全反射雙色光鏡光信號經(jīng)過一

13、次反射，信號損失僅光信號經(jīng)過一次反射，信號損失僅5%保證多色分析時的熒光檢測靈敏度保證多色分析時的熒光檢測靈敏度光電倍增管帶通濾光片長通雙色反光鏡細胞通過激光束的流速變慢，激光細胞通過激光束的流速變慢，激光照射時間更長，提高了激光激發(fā)效照射時間更長，提高了激光激發(fā)效率率流動池被光膠耦合在熒光接收物鏡流動池被光膠耦合在熒光接收物鏡上，提高了熒光收集效率，保證多上，提高了熒光收集效率，保證多色應(yīng)用中最佳的靈敏度和分辨率色應(yīng)用中最佳的靈敏度和分辨率固定光路，無需每日調(diào)節(jié)，機器隨固定光路，無需每日調(diào)節(jié)，機器隨開隨用，減少人為可變性，提高實開隨用，減少人為可變性，提高實驗重復(fù)性驗重復(fù)性石英杯流動池石英杯

14、流動池 開機光路無需調(diào)整開機光路無需調(diào)整 一鍵式操作一鍵式操作 無需操作者的豐富經(jīng)驗無需操作者的豐富經(jīng)驗 實驗結(jié)果的可重復(fù)性好實驗結(jié)果的可重復(fù)性好實測檢測靈敏度：實測檢測靈敏度：FITC: 10 MESF PE:10 MESF實測分辨率：實測分辨率：CV=1.6% 二極管激光器，安裝在分選模塊裝置左側(cè)二極管激光器，安裝在分選模塊裝置左側(cè) 可以提供側(cè)液流圖像的照相機可以提供側(cè)液流圖像的照相機 用于觀察用于觀察BD AccudropTM 微球熒光的發(fā)射光濾光片微球熒光的發(fā)射光濾光片Accudrop微球是一種熒光微球，被位于偏轉(zhuǎn)板微球是一種熒光微球，被位于偏轉(zhuǎn)板下方的紅激光激發(fā)后，發(fā)射光可以透過側(cè)液

15、流監(jiān)下方的紅激光激發(fā)后，發(fā)射光可以透過側(cè)液流監(jiān)視器前方的濾光片，用于測量視器前方的濾光片，用于測量drop delay。該系。該系統(tǒng)由統(tǒng)由下列部分構(gòu)成：下列部分構(gòu)成：Interrogation pointDrop delayBreakoffNozzle+Cells injected+-LaserDrop delay定義：定義：Drop delay即液滴延遲時即液滴延遲時間間，指細胞通過檢測區(qū)到液滴分離，指細胞通過檢測區(qū)到液滴分離的間隔時間的間隔時間 意義：意義： Drop delay如果能夠被準如果能夠被準確確定，就可以保證包裹細胞的液滴確確定，就可以保證包裹細胞的液滴表面不會充上相反的電荷，

16、表面不會充上相反的電荷，從而實現(xiàn)從而實現(xiàn)最高的分選純度及細胞得率最高的分選純度及細胞得率耗時：耗時：0.5到到1.5小時小時輔助材料：熒光微球、熒光顯微鏡、輔助材料：熒光微球、熒光顯微鏡、 玻片、計算器玻片、計算器傳統(tǒng)液滴延遲時間確定傳統(tǒng)液滴延遲時間確定BD 獨有專利獨有專利 Accudrop 技術(shù)：技術(shù)： Accudrop微球是一種熒光微球，被微球是一種熒光微球，被位于偏轉(zhuǎn)板下方的紅激光激發(fā)后，發(fā)射光可以透過側(cè)液流監(jiān)視器前位于偏轉(zhuǎn)板下方的紅激光激發(fā)后，發(fā)射光可以透過側(cè)液流監(jiān)視器前方的濾光片，用于測量方的濾光片，用于測量drop delay。預(yù)先分選預(yù)先分選Accudrop熒光微球熒光微球自動

17、準確設(shè)置最佳液滴延遲時間自動準確設(shè)置最佳液滴延遲時間無需手動調(diào)節(jié)，減少人為誤差無需手動調(diào)節(jié)，減少人為誤差保證實驗的分選純度和得率保證實驗的分選純度和得率Sweet Spot自動監(jiān)控自動監(jiān)控功能功能 液滴斷點監(jiān)測窗口液滴斷點監(jiān)測窗口 自動調(diào)節(jié)振幅，維持斷點穩(wěn)定自動調(diào)節(jié)振幅，維持斷點穩(wěn)定 維持維持最佳液滴延遲狀態(tài)最佳液滴延遲狀態(tài) 儀器阻塞報警，保護分選樣本不受污染儀器阻塞報警，保護分選樣本不受污染，實現(xiàn)分選時無人看管，實現(xiàn)分選時無人看管分選模式分選模式 Yield Mask：如果目標顆粒位于該設(shè)定范圍內(nèi)，則含有目標顆粒的液滴和相鄰的液滴都被分選。 Purity Mask：如果非目標顆粒位于該設(shè)定范

18、圍內(nèi)，則與其相鄰的含有目標顆粒的液滴將不被分選。 Phase Mask：如果目標顆粒位于該設(shè)定范圍內(nèi)，則含有目標顆粒的液滴將不被分選。AccudropPlate sortingEnrichment2-Way sorting4-Way sorting影響分選細胞的活性的因素：影響分選細胞的活性的因素： 細胞本身細胞本身 激光功率激光功率 液路系統(tǒng)（噴嘴）液路系統(tǒng)（噴嘴） 分選系統(tǒng)的潔凈程度及溫度控制分選系統(tǒng)的潔凈程度及溫度控制石英杯激發(fā)保證了用小功率激石英杯激發(fā)保證了用小功率激光的效率遠遠大于大功率空氣光的效率遠遠大于大功率空氣激發(fā)的效率，光毒性小，很好激發(fā)的效率，光毒性小，很好的保證細胞活性。

19、的保證細胞活性。穩(wěn)定而零剪切力液流系統(tǒng)設(shè)計最大程度的保穩(wěn)定而零剪切力液流系統(tǒng)設(shè)計最大程度的保證了細胞的活性，同時專利的噴嘴設(shè)計，進證了細胞的活性，同時專利的噴嘴設(shè)計，進一步保證了細胞活性。一步保證了細胞活性。既有樣本溫控系統(tǒng)也有收集倉溫控既有樣本溫控系統(tǒng)也有收集倉溫控Aria 自動無菌消毒清洗自動無菌消毒清洗軟件向?qū)逑醋詣訄?zhí)行軟件向?qū)逑醋詣訄?zhí)行無菌分選結(jié)果保證，文獻支持無菌分選結(jié)果保證，文獻支持 全自動標準化的無菌清洗流程，密閉式的上全自動標準化的無菌清洗流程，密閉式的上樣和分選收集倉，執(zhí)行一次可以保證整個管樣和分選收集倉，執(zhí)行一次可以保證整個管路系統(tǒng)在以后連續(xù)路系統(tǒng)在以后連續(xù)4天內(nèi)菌量為

20、天內(nèi)菌量為0的最佳效果。的最佳效果。采用一管采用一管CS&T微球，方便檢測微球，方便檢測微球染料可以被任意激光激發(fā)，涵蓋常微球染料可以被任意激光激發(fā)，涵蓋常用染料熒光波譜用染料熒光波譜自動調(diào)整自動調(diào)整PMT報告儀器性能參數(shù)：報告儀器性能參數(shù)：Qr，Br，CV，跟，跟蹤儀器狀態(tài)蹤儀器狀態(tài)自動調(diào)整激光延遲和面積因子自動調(diào)整激光延遲和面積因子BD公司專利技術(shù)公司專利技術(shù)Cytometer Setup & Tracking SystemCS&T儀器質(zhì)控程序及儀器狀態(tài)監(jiān)控儀器質(zhì)控程序及儀器狀態(tài)監(jiān)控流式細胞術(shù)操作流程流式細胞術(shù)操作流程 樣品制備樣品制備 流式染色、檢測流式染色、檢測 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析細胞懸

21、液的制備細胞懸液的制備 單細胞懸液（天然，機械研磨單細胞懸液（天然，機械研磨/ /消化）消化） 5 510105 51 110106 6cells/mlcells/ml，約，約0.50.51ml1ml，300300目篩網(wǎng)過濾目篩網(wǎng)過濾 陰性對照：陰性對照：自發(fā)熒光自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細胞內(nèi)部熒光分子經(jīng)光照發(fā)出的，即不經(jīng)熒光染色細胞內(nèi)部熒光分子經(jīng)光照發(fā)出的熒光。自發(fā)熒光信號為噪聲信號。熒光。自發(fā)熒光信號為噪聲信號。 同型對照：同型對照：自發(fā)熒光非特異熒光自發(fā)熒光非特異熒光，使用與一抗相同種屬來源、相同亞，使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合產(chǎn)生

22、的背型、相同劑量的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合產(chǎn)生的背景染色景染色 實驗樣本：實驗樣本：自發(fā)熒光特異熒光非特異熒光自發(fā)熒光特異熒光非特異熒光 補償對照：補償對照：雙色或多色分析中，熒光素發(fā)射光譜重疊時，雙色或多色分析中，熒光素發(fā)射光譜重疊時，使用單種熒光使用單種熒光素標記的單克隆抗體和其余熒光素對應(yīng)的同型對照抗體分別進行染色，素標記的單克隆抗體和其余熒光素對應(yīng)的同型對照抗體分別進行染色，糾正熒光素發(fā)射光譜重疊，即從一個被檢測的熒光信號中去除任何其他糾正熒光素發(fā)射光譜重疊，即從一個被檢測的熒光信號中去除任何其他的干擾熒光信號的干擾熒光信號設(shè)置對照及染色設(shè)置對照及染色 用同型對照或陰用

23、同型對照或陰性對照管調(diào)節(jié)電性對照管調(diào)節(jié)電壓使陰性群位于壓使陰性群位于“左下角左下角” 用單陽性管依次用單陽性管依次調(diào)節(jié)相鄰熒光之調(diào)節(jié)相鄰熒光之間補償，如間補償，如 FL1-%FL2， FL2-%FL1 染色體分選染色體分選 單克隆細胞分選單克隆細胞分選 腫瘤干細胞分選腫瘤干細胞分選 轉(zhuǎn)染細胞分選轉(zhuǎn)染細胞分選 免疫或免疫相關(guān)細胞分選免疫或免疫相關(guān)細胞分選 細胞生理學研究細胞生理學研究 細胞膜表面標記細胞膜表面標記 細胞內(nèi)標記細胞內(nèi)標記 細胞周期分析細胞周期分析 凋亡分析凋亡分析 流式細胞術(shù)的應(yīng)用流式細胞術(shù)的應(yīng)用細胞生理學研究細胞生理學研究 細胞相對大小和顆粒性分析細胞相對大小和顆粒性分析細胞生理學研究細胞生理學研究 細胞內(nèi)細胞內(nèi)PHPH值檢測值檢測細胞生理學研究細胞生理學研究 CaCa2+2+流動性檢測：流動性檢測：CaCa2+2+是非常重要的細胞內(nèi)離子，在細是非常重要的細胞內(nèi)離子，在細胞膜到細胞漿的信號傳導中起重要的作用。細胞受到刺胞膜到細胞漿的信號傳導中起重要的作用。細胞受到刺激后，胞內(nèi)激后，胞內(nèi)CaCa2+2+濃度會發(fā)生改變。濃度會發(fā)生改變。 最常用的染料：最常用的染料：Indo-1,Fluo-3,Fura redIndo-1,Flu