第二節(jié)動物細(xì)胞工程

1、商丘一高：劉東商丘一高：劉東1. .概念：概念： 動物細(xì)胞融合也稱細(xì)胞雜交，是指動物細(xì)胞融合也稱細(xì)胞雜交，是指兩個或兩個或多個多個動物細(xì)胞結(jié)合形成動物細(xì)胞結(jié)合形成一個一個細(xì)胞的過程。細(xì)胞的過程。 融合后形成的具有兩個或多個細(xì)胞遺傳融合后形成的具有兩個或多個細(xì)胞遺傳信息的信息的單核細(xì)胞單核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞。，稱為雜交細(xì)胞。2、動物細(xì)胞融合基本原理：、動物細(xì)胞融合基本原理：與植物原生質(zhì)體融合的基本原理相同，與植物原生質(zhì)體融合的基本原理相同，即細(xì)即細(xì)胞膜的流動性胞膜的流動性3、誘導(dǎo)方式、誘導(dǎo)方式物理法：物理法：化學(xué)法：化學(xué)法：生物法：生物法： 滅活的病毒滅活的病毒（喪失感染性、保留抗原結(jié)構(gòu)）（喪失

2、感染性、保留抗原結(jié)構(gòu)） 動物細(xì)胞融合過程示意圖動物細(xì)胞融合過程示意圖不同不同DNADNA的的兩個細(xì)胞兩個細(xì)胞 滅活的病滅活的病毒毒有絲分裂有絲分裂兩個完整的兩個完整的雜交細(xì)胞雜交細(xì)胞 化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體提問？1.1.抗體是由何種細(xì)胞產(chǎn)生的？抗體是由何種細(xì)胞產(chǎn)生的？ 效應(yīng)效應(yīng)B B細(xì)胞（漿細(xì)胞）細(xì)胞（漿細(xì)胞）2.2.一個淋巴細(xì)胞一個淋巴細(xì)胞( (漿細(xì)胞漿細(xì)胞) )能分泌多種抗體嗎？能分泌多種抗體嗎？ 每一個淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。每一個淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。3.3.某一動物體內(nèi)，由機(jī)體免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體只有一某一動物體內(nèi)，由機(jī)體免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗

3、體只有一種嗎？種嗎？ 動物在免疫反應(yīng)過程中，體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類可多達(dá)百萬種以上。動物在免疫反應(yīng)過程中，體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類可多達(dá)百萬種以上。4. 4. 簡述獲得抗體的傳統(tǒng)途徑？簡述獲得抗體的傳統(tǒng)途徑？ 抗原抗原 動物體動物體 抗體抗體 抗原不純抗原不純 抗體不純抗體不純刺激漿細(xì)胞6.6.如何獲得化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體？如何獲得化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體？ 體外培養(yǎng)單個淋巴細(xì)胞，提取分泌的抗體體外培養(yǎng)單個淋巴細(xì)胞，提取分泌的抗體7.7.體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞能無限增殖嗎體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞能無限增殖嗎? ?怎樣解決這個問題？怎樣解決這個問題？5.5.這種方法獲得的抗體有什么缺陷？這種方法

4、獲得的抗體有什么缺陷？ 產(chǎn)量低，純度低，特異性差產(chǎn)量低，純度低，特異性差免疫小鼠免疫小鼠培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞注射特定注射特定抗原蛋白抗原蛋白 單克隆抗體制備過程示意圖單克隆抗體制備過程示意圖B B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞融合融合 單克隆抗體制備過程示意圖單克隆抗體制備過程示意圖多種雜交細(xì)胞多種雜交細(xì)胞選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)專一抗體專一抗體檢驗陽性檢驗陽性克隆雜交細(xì)胞克隆雜交細(xì)胞專一抗體專一抗體檢驗陽性檢驗陽性 單克隆抗體制備過程示意圖單克隆抗體制備過程示意圖分開不同雜交細(xì)胞，克隆分開不同雜交細(xì)胞，克隆專一抗體，檢驗陽性細(xì)胞專一抗體，檢驗陽性細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)注射到

5、小鼠體內(nèi)體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)單克隆抗體單克隆抗體 單克隆抗體制備過程示意圖單克隆抗體制備過程示意圖單克隆抗體的應(yīng)用：單克隆抗體的應(yīng)用： 在疾病診斷、治療和預(yù)防方面，具有在疾病診斷、治療和預(yù)防方面，具有 生物導(dǎo)彈生物導(dǎo)彈具有具有位置準(zhǔn)確、療效高、副位置準(zhǔn)確、療效高、副 作用小作用小特異性強(qiáng)、靈敏度高特異性強(qiáng)、靈敏度高 等優(yōu)越性。等優(yōu)越性。知識結(jié)構(gòu)知識結(jié)構(gòu)兩個過程兩個過程動物細(xì)胞培養(yǎng)過程動物細(xì)胞培養(yǎng)過程單克隆抗體制備過程單克隆抗體制備過程三個三個“一一”一個誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法一個誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法 滅活的病毒滅活的病毒一個新細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞一個新細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞一個優(yōu)勢單克隆抗體特異性一個優(yōu)勢單克隆抗

6、體特異性 強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢1. 1. 單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細(xì)胞和單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細(xì)胞和B B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞，在誘導(dǎo)融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞，在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細(xì)胞是這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細(xì)胞是 （ ）淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 小鼠骨髓瘤細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞 B B淋巴細(xì)胞自身融合細(xì)胞淋巴細(xì)胞自身融合細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞自身融合細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞自身融合細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞A.A. B. B.C.C. D.D. C C 2.科學(xué)家用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與某種細(xì)胞融合，得科學(xué)家用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與某種

7、細(xì)胞融合，得到雜交細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)可產(chǎn)生大量的單克隆抗體，到雜交細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)可產(chǎn)生大量的單克隆抗體，與骨髓疤細(xì)胞融合的是（與骨髓疤細(xì)胞融合的是（ ） A.經(jīng)過免疫的經(jīng)過免疫的B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 B.沒經(jīng)過免疫的沒經(jīng)過免疫的T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 C.經(jīng)過免疫的經(jīng)過免疫的T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 D.沒經(jīng)過免疫的淋巴細(xì)沒經(jīng)過免疫的淋巴細(xì)A謝謝指導(dǎo)！謝謝指導(dǎo)！單克隆抗體單克隆抗體由單個由單個B淋巴細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖（克?。馨图?xì)胞經(jīng)過無性繁殖（克?。涡纬苫蛐拖嗤募?xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生成基因型相同的細(xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體稱為單克的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體稱為單克隆抗體

8、。隆抗體。 用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒早早孕診斷試劑盒”，靈敏，靈敏度很高，在妊娠第度很高，在妊娠第8 8天就可以做出診斷，比原來的診斷方法提前了天就可以做出診斷，比原來的診斷方法提前了1010天左右，天左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準(zhǔn)確率在方法檢測的準(zhǔn)確率在9090以上。以上。篩選培養(yǎng)基得到的專一陽性克隆需再次克隆的原因：可以簡單理解為：可以簡單理解為：1.可能含有不分泌抗體的細(xì)胞或有多株分泌抗體的細(xì)胞可能含

9、有不分泌抗體的細(xì)胞或有多株分泌抗體的細(xì)胞 2.剛?cè)诤系募?xì)胞不穩(wěn)定剛?cè)诤系募?xì)胞不穩(wěn)定一般再經(jīng)三次克隆選擇后，才能達(dá)到100%陽性克隆。細(xì)解做法為：細(xì)解做法為：第一次篩選培養(yǎng)（HAT）：去除無關(guān)細(xì)胞，得到雜交瘤細(xì)胞。將融合的細(xì)胞懸浮于HAT培養(yǎng)基中，加入到96孔板內(nèi)，根據(jù)情況2-3天換液一次，每次吸去二分之一到三分之二培養(yǎng)液，再加入等量新鮮培養(yǎng)液。7-14天改用HT培養(yǎng)液，14天以后用普通的RPMI1640完全培養(yǎng)液。因為雜交瘤數(shù)量很少，多半不易存活，所以通常要加入飼養(yǎng)細(xì)胞才能使其繁殖，常用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞。能釋放某些生長刺激因子，并能滿足雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密度的依賴性。 （有的死

10、，有的活，活的有些可以用單一抗體檢驗陽性，但陽性孔可能由1多個細(xì)胞克隆得到）第二次篩選：初篩陽性克隆可能含有不分泌抗體的細(xì)胞或有多株分泌抗體的細(xì)胞，且剛?cè)诤系募?xì)胞不穩(wěn)定，故應(yīng)盡早進(jìn)行克隆?？寺『蟮募?xì)胞集團(tuán)生物學(xué)特性完全相同。（將其單個分開）融合后的雜交瘤細(xì)胞要經(jīng)過三次克隆化才能達(dá)到100%的陽性克隆。常用方法：有限稀釋法和軟瓊脂法。有限稀釋法，把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后，加入到96孔板中，理論上每孔一個細(xì)胞，第一次克隆化時用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可以用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液。也要加入飼養(yǎng)細(xì)胞。軟瓊脂法，在培養(yǎng)液中加入0.5%左右的瓊脂糖凝膠，細(xì)胞分裂后形成小球樣團(tuán)塊，由于培養(yǎng)基是半固體

11、的，可用毛細(xì)管將小球吸出，團(tuán)塊經(jīng)打碎后，移入96孔板繼續(xù)培養(yǎng)?？偨Y(jié)：比較植物體細(xì)胞雜交和動物細(xì)胞融總結(jié)：比較植物體細(xì)胞雜交和動物細(xì)胞融合合已知細(xì)胞合成已知細(xì)胞合成DNA有有D和和S兩條途徑，其中兩條途徑，其中D途徑能被途徑能被氨基嘌呤氨基嘌呤阻斷。阻斷。B淋巴細(xì)胞中有這兩條淋巴細(xì)胞中有這兩條DNA合成途徑，但一般不分裂增合成途徑，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤細(xì)胞中盡管沒有殖。鼠骨髓瘤細(xì)胞中盡管沒有S途徑，但能不斷分裂增殖，途徑，但能不斷分裂增殖，將將這兩種細(xì)胞在試管中混合，加聚乙二醇促融，獲得雜種細(xì)胞。這兩種細(xì)胞在試管中混合，加聚乙二醇促融，獲得雜種細(xì)胞。請回答：請回答：（1 1）試管中除融合的

12、雜種細(xì)胞外，還有）試管中除融合的雜種細(xì)胞外，還有_種融合細(xì)胞。種融合細(xì)胞。（2 2）設(shè)計一方法（不考慮機(jī)械方法），從培養(yǎng)液中分離出雜）設(shè)計一方法（不考慮機(jī)械方法），從培養(yǎng)液中分離出雜種細(xì)胞，并說原理。種細(xì)胞，并說原理。方法：方法：原理：原理： 思考：如何進(jìn)行細(xì)胞的篩選？思考：如何進(jìn)行細(xì)胞的篩選？2 培養(yǎng)液中加入氨基嘌呤，收集增殖的細(xì)胞；培養(yǎng)液中加入氨基嘌呤，收集增殖的細(xì)胞；加入氨基嘌呤后，使加入氨基嘌呤后，使D合成途徑阻斷，僅有合成途徑阻斷，僅有D合成途徑的合成途徑的骨髓瘤細(xì)胞及其彼此融合的細(xì)胞就不能增殖，但人淋巴骨髓瘤細(xì)胞及其彼此融合的細(xì)胞就不能增殖，但人淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后的雜種細(xì)胞

13、中可以利用淋巴細(xì)細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后的雜種細(xì)胞中可以利用淋巴細(xì)胞中的胞中的S途徑合成途徑合成DNA而增殖。而增殖。資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段計的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內(nèi)分泌的傳染病、免疫性疾病、血液病、內(nèi)分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個必然趨勢。另外，用單克隆抗段，是一個必然趨勢。另外，用單克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體內(nèi)體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體內(nèi)“病病灶灶”也引起人們的注意，目前，主要用于也引起人們的注意，目

14、前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。單克隆抗體制備過程單克隆抗體制備過程 注射抗原注射抗原B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合、細(xì)胞融合、篩選篩選雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)篩選篩選、繼續(xù)培養(yǎng)、繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群特定抗體的細(xì)胞群體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔單克隆抗體單克隆抗體（選擇性培養(yǎng)基）（選擇性培養(yǎng)基）免疫小鼠培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì)胞B淋巴細(xì)胞注射特定抗原蛋白選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)專一抗體檢驗陽性專一抗體檢驗陽性注射到小鼠體內(nèi)體外培養(yǎng)單克隆抗體單克隆抗體克隆雜交細(xì)胞分開不同雜交細(xì)胞，克隆專一抗體，檢驗陽性細(xì)胞 單克隆抗體制備過程示意圖單克隆抗體制備過程示意圖多種雜交細(xì)胞動物細(xì)胞動物細(xì)胞融合技術(shù)融