組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)教案

1、實(shí)驗(yàn)一 組培實(shí)驗(yàn)室常用洗滌滅菌方法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅褐参锝M織培養(yǎng)是一項(xiàng)十分細(xì)致的工作，為了保證植物外植體不受污染，第一關(guān)就是要對(duì)各種器皿進(jìn)行清洗和消毒，使它們保持無(wú)菌狀態(tài)，做這些工作同樣有一套科學(xué)的方法和需要熟練的技巧，因此每個(gè)學(xué)生必須學(xué)好這套基本功。在進(jìn)行各類具體的組培實(shí)驗(yàn)前，首先了解組培室的結(jié)構(gòu)及主要設(shè)備的用途和性能是十分必要的，總體上的了解有利于以后各實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行以及正確的使用各種儀器和設(shè)備。通過實(shí)際操作，學(xué)會(huì)洗滌劑的配制和各種器皿的清洗和滅菌方法。二、儀器設(shè)備：天平、燒杯、容量瓶、量筒、移液管、培養(yǎng)瓶、烘箱三、試劑：過氧化氫、高錳酸鉀、漂白粉、次氯酸鈉、酒精四、實(shí)驗(yàn)步驟：1. 講解實(shí)驗(yàn)

2、室的構(gòu)建情況。2. 講解內(nèi)部?jī)x器設(shè)備的名稱及作用。3. 組培實(shí)驗(yàn)室常用器械的洗滌和滅菌。（一）玻璃器皿的洗滌1. 新購(gòu)置的玻璃器皿的洗滌（學(xué)習(xí)、操作）因有游離堿性物質(zhì)，使用前先用 1%稀鹽酸浸泡一夜，然后用肥皂水洗凈，清水沖洗，最后用蒸餾水沖洗一次，干后備用。2. 已用過玻璃器皿先將殘?jiān)?；用清水洗凈，再用熱肥皂水或洗衣粉洗凈，清水沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗一次，干后備用。3. 對(duì)一些不宜刷洗的玻璃器皿如：吸管，滴管及較臟的器皿等先用去污粉和去油劑刷洗，自來(lái)水沖干凈后，晾干，再浸入硫酸重鉻酸鉀洗液中浸泡若干小時(shí)，用夾子取出在自來(lái)水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗 13 遍，稍晾不滴水后置于干燥箱內(nèi)烘

3、干備用。4. 對(duì)帶有凡士林，石蠟，或膠布的器皿選用特殊方法處理后，再用常規(guī)方法洗滌。帶有凡士林的器皿須先用廢紙把凡士林擦去，再用汽油擦洗干凈，然后用熱肥皂水煮沸半小時(shí)，刷洗后，自來(lái)水沖干凈。若帶有石蠟，可在玻璃器皿下墊幾層廢紙，放入 6070溫箱中加熱12 小時(shí)，待石蠟融化后，再用廢紙反復(fù)擦 23 次即去石蠟再泡入洗衣粉的熱水中洗干凈最后用自來(lái)水沖洗，蒸餾水沖洗干凈若有膠布粘著物，先用 70%酒精棉球擦數(shù)遍，溶解粘膠物，并用少許去污粉刷抺，再用洗衣粉煮沸半小時(shí)，刷洗干凈，自來(lái)水沖洗，晾干，再泡入洗液。（二）金屬器皿新購(gòu)置金屬器皿因其上有潤(rùn)滑油或防繡油，用蘸有四氯化碳（CCl4）布擦去油脂，再用

4、濕布擦凈，干燥備用。二、滅菌（一）器皿和用具常用滅菌方法：1. 熱壓滅菌法（學(xué)習(xí)操作）將洗凈的培養(yǎng)器皿，用具，用牛皮紙包好，放入高壓消毒鍋中，1.1 個(gè)大氣壓下滅菌 2030 分鐘。2. 干熱滅菌法洗凈的玻璃器皿置于電熱干燥箱中，15040 分鐘或 120兩小時(shí)，待冷卻后使用。（二）無(wú)菌室滅菌（接種室、培養(yǎng)室）1. 紫外燈照射 40min 后，用新潔爾滅擦抺工作臺(tái)，70%酒精擦拭超凈工作臺(tái)。2. 薰蒸（學(xué)習(xí)操作）用甲醛、高錳酸鉀提前 13 天薰蒸密封房間方法 1：甲醛倒入蒸發(fā)皿加熱，用量 10ml/m2。方法 2：甲醛（HCHO）與高錳酸鉀（KMn4）以 10：1 比例混合。3. 接種前用 7

5、075%酒精噴霧，使飄在空氣中的塵埃沉積下來(lái)。4. 用紫外光燈進(jìn)行照射滅菌（波長(zhǎng) 26502660A 最好）接種箱及用具 3040 分鐘。實(shí)驗(yàn)二 MS培養(yǎng)基的制備及高壓滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅和ㄟ^實(shí)驗(yàn)使學(xué)生認(rèn)識(shí)掌握配置與保存培養(yǎng)基的基本技能。二、儀器設(shè)備：天平、燒杯、容量瓶、量筒、冰箱、電爐、高壓蒸汽滅舉鍋、移液管、培養(yǎng)瓶、標(biāo)簽。三、試劑：待配各種培養(yǎng)基的組成成分、瓊脂、蔗糖四、實(shí)驗(yàn)步驟：1.母液的稱取2.生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的量取3.固化劑的稱取4.蔗糖的稱取5.定容6.調(diào)pH7.分裝8.滅菌培養(yǎng)基母液的配制和保存 MS培養(yǎng)基含有近30種營(yíng)養(yǎng)成分，為了避免每次配制培養(yǎng)基都要對(duì)這幾十種成分進(jìn)行稱量，可將

6、培養(yǎng)基中的各種成分，按原量的20倍或200倍分別稱量，配成濃縮液，這種濃縮液叫做培養(yǎng)基母液。這樣每次使用時(shí)，取其總量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀釋，制成培養(yǎng)液。現(xiàn)將制備培養(yǎng)基母液所需的各類物質(zhì)的量列出，供配制時(shí)使用。大量元素(母液) mgLNH4NO3 33000 KNO3 38000 CaCl22H2O 8800 MgSO47H2O 7400 KH2PO4 3400微量元素(母液)KI 166 H3BO3 1240 MnSO44H2O 4460ZnSO47H2O 1720Na2MoO42H2O 50CuSO45H2O 5CoCl26H2O 5鐵鹽(母液)FeSO4

7、7H2O 5560Na2-EDTA2H2O 7460有機(jī)成分(母液)A肌醇 20000B煙酸 100鹽酸吡哆醇(維生素B6) 100鹽酸硫胺素(維生素B1) 100甘氨酸 400以上各種營(yíng)養(yǎng)成分的用量，除了母液為20倍濃縮液外，其余的均為200倍濃縮液。上述幾種母液都要單獨(dú)配成1 L的貯備液。其中，母液、母液及母液的配制方法是：每種母液中的幾種成分稱量完畢后，分別用少量的蒸餾水徹底溶解，然后再將它們混溶，最后定容到1 L。母液的配制方法是：將稱好的FeSO47H2O和Na2-EDTA2H2O分別放到450 mL蒸餾水中，邊加熱邊不斷攪拌使它們?nèi)芙?，然后將兩種溶液混合，并將pH調(diào)至5.5，最后定

8、容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。各種母液配完后，分別用玻璃瓶貯存，并且貼上標(biāo)簽，注明母液號(hào)、配制倍數(shù)、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。MS培養(yǎng)基中還需要加入2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6芐基嘌呤(6BA)等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，并且分別配成母液(0.1 mg/mL)。其配制方法是：分別稱取這3種物質(zhì)各10 mg，將2，4-D和NAA用少量(1 mL)無(wú)水乙醇預(yù)溶，將6BA用少量(1 mL)的物質(zhì)的量濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解過程需要水浴加熱，最后分別定容至100 mL，即得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的母液。配制培養(yǎng)液 用量筒或移液管從各種母液中分別取

9、出所需的用量：母液為50 mL，母液、A和B各5 mL。再取2，4D 5 mL、NAA 1 mL，與各種母液一起放入燒杯中。配制培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)注意：在使用提前配制的母液時(shí)，應(yīng)在量取各種母液之前，輕輕搖動(dòng)盛放母液的瓶子，如果發(fā)現(xiàn)瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應(yīng)立即淘汰這種母液，重新進(jìn)行配制；用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤(rùn)洗2次；量取母液時(shí)，最好將各種母液按將要量取的順序?qū)懺诩埳希咳?種，劃掉1種，以免出錯(cuò)。溶化瓊脂 用粗天平分別稱取瓊脂9 g、蒸糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸餾水750 mL，用電爐加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液

10、體呈半透明狀。然后再將配好的混合培養(yǎng)液加入到煮沸的瓊脂中，最后加蒸餾水定容至1 000 mL，攪拌均勻。需要注意的是，在加熱瓊脂、制備培養(yǎng)基的過程中，操作者千萬(wàn)不能離開，否則沸騰的瓊脂外溢，就需要重新稱量、制備。此外，如果沒有搪瓷量杯，可用大燒杯代替。但要注意大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時(shí)燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。調(diào)pH 用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時(shí)用精密的pH試紙(5.47.0)測(cè)培養(yǎng)基的pH，一直到培養(yǎng)基的pH為5.8為止(培養(yǎng)基的pH必須嚴(yán)格控制在5.8)。培養(yǎng)基的分裝 溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。分裝時(shí)，

11、先將培養(yǎng)基倒入燒杯中，然后將燒杯中的培養(yǎng)基倒入錐形瓶(50 mL或100 mL)中。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/51/4。每1 000 mL培養(yǎng)基，可分裝2530瓶。培養(yǎng)基分裝完畢后，應(yīng)及時(shí)封蓋瓶口。用2塊硫酸紙(每塊大小約為9 cm9 cm)中間夾1層薄牛皮紙封蓋瓶口，并用線繩捆扎。最后在錐形瓶外壁貼上標(biāo)簽。高壓滅菌 培養(yǎng)基的高壓滅菌包括以下幾個(gè)步驟。1 碼放錐形瓶。將裝有培養(yǎng)基的錐形瓶直立于金屬小筐中，再放入高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)。如果沒有金屬小筐，可以在兩層錐形瓶之間放一塊玻璃板隔開。2放置其他需要滅菌的物品。將其他需要滅菌的物品也放入高壓蒸氣滅菌鍋

12、內(nèi)，如裝有蒸餾水的錐形瓶、帶螺口蓋的玻璃瓶、燒杯、廣口瓶(以上物品都要用牛皮紙封口)，用牛皮紙包裹的培養(yǎng)皿、剪刀、解剖刀、鑷子、濾紙、鉛筆3滅菌。待需要滅菌的物品碼放完畢，蓋上鍋蓋。在98 kPa、121.3 下，滅菌20 min。4滅菌后取出錐形瓶，讓其中的培養(yǎng)基自然冷卻凝固。最好放置1 d后再使用。實(shí)驗(yàn)三 胡蘿卜愈傷組織的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制2 胡蘿卜愈傷組織的誘導(dǎo)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 通過本次實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步熟悉配制培養(yǎng)基的流程及操作中應(yīng)注意的事項(xiàng)，學(xué)會(huì)設(shè)計(jì)和篩選胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方。2. 通過本次實(shí)驗(yàn)，能夠熟練掌握外植體的表面消毒技術(shù)和無(wú)菌操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原

13、理、實(shí)驗(yàn)流程或裝置示意圖1. 實(shí)驗(yàn)原理（1）將事先配制好的培養(yǎng)基母液按一定比例稀釋至濃度為培養(yǎng)基中規(guī)定的使用濃度，再加入瓊脂、蔗糖、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)等，制備成符合要求的培養(yǎng)基。（2）將胡蘿卜的貯藏根（根的變態(tài)）表面消毒后切割成小塊接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織。2. 實(shí)驗(yàn)流程配置胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基 接種胡蘿卜肉質(zhì)根誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察記錄三、實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料1. 實(shí)驗(yàn)用具和儀器冰箱、普通天平、三角瓶、果醬瓶、移液管、量筒、燒杯、容量瓶、玻璃棒、醫(yī)用口杯、精密pH試紙（pH5.47.0）、藥勺、稱量紙、標(biāo)簽紙、封口膜、橡皮筋、棉線、電爐、高壓蒸汽滅菌鍋、電磁爐等

14、。酒精棉球、小塊紗布、已滅菌濾紙、槍狀鑷子、手術(shù)剪、解剖刀、已滅菌培養(yǎng)皿、酒精燈、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、100ml三角瓶、500或1000ml搪瓷杯、50ml量筒、1ml、2ml、5ml、10ml吸管等。2. 藥品和試劑：MS培養(yǎng)基母液、常用試劑母液、瓊脂、蔗糖、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、蒸餾水、1molL-1HCl、1molL-1NaOH、胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、無(wú)菌水、75酒精、0.1%HgCl2，、愈傷組織繼代培養(yǎng)基、蒸餾水等。3. 材料：胡蘿卜肉質(zhì)直根、處于脫分化進(jìn)程中的胡蘿卜愈傷組織四、實(shí)驗(yàn)方法步驟及注意事項(xiàng)1. 實(shí)驗(yàn)步驟：（1）胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方及配制體積A、培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì)：a

15、根據(jù)培養(yǎng)的目的選擇一種培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。b確定培養(yǎng)基中各種激素的濃度及相對(duì)比例B配方：MS基本培養(yǎng)基 1mg/L 2,4-D0.5mg/L 6-BA0.7瓊脂3蔗糖C配制體積：每小組配制0.5L，每人用50ml三角瓶分裝5瓶，每瓶約裝25ml培養(yǎng)基。(2)胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制步驟A. 藥品及用具的準(zhǔn)備B. 培養(yǎng)基配制a.根據(jù)需要配制的培養(yǎng)基的量稱好所需的瓊脂（3.5g），放入醫(yī)用口杯中，加入適量的蒸餾水（估計(jì)加入母液后不超過配制總量）置于電磁爐上加熱溶解，邊加熱邊用玻棒攪動(dòng)。b.MS基本培養(yǎng)基配置：（配置前先檢查各母液情況，如發(fā)現(xiàn)有霉菌和沉淀結(jié)晶產(chǎn)生，就不能再使用）。大量元素母液：

16、25ml；微量元素母液：2.5ml；鐵鹽母液：2.5ml；有機(jī)物母液：各2.5ml。0.5mg/L 2,4-D取1ml， 0.5mg/L 6-BA取2.5ml?；靹?。c.待瓊脂完全溶解后，加入規(guī)定用量的蔗糖（15g），繼續(xù)加溫并不斷攪拌，待瓊脂煮透后端離火源，再加入所需用量的母液（可事先取好放于一燒杯中），最后加蒸餾水至所需體積，即500ml。C.調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的酸堿性至pH5.8培養(yǎng)基配制好后應(yīng)立即進(jìn)行pH值的調(diào)整。用精密pH試紙測(cè)試。培養(yǎng)基若偏酸時(shí)用lmolL-1 NaOH來(lái)調(diào)節(jié)，偏堿則可用lmolL-1 HCl來(lái)調(diào)節(jié)。D.培養(yǎng)基的分裝配制好的培養(yǎng)基要趁熱分裝，培養(yǎng)基分裝完后，用封口膜封嚴(yán)瓶口

17、，并用棉線扎緊。本次實(shí)驗(yàn)中500ml分裝到20個(gè)三角瓶，每人5瓶。E.培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基分裝后應(yīng)立即置于高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行滅菌。消毒滅菌時(shí)，壓力表讀數(shù)約為1.06kgfcm-2或0.105 MPa （可在0.105 0.12MPa間，但不得超過0.14 MPa），溫度121時(shí)保持1530 min左右即可。F.無(wú)菌蒸餾水和接種工具準(zhǔn)備用果醬瓶裝自來(lái)水，用不透氣的封口膜封口滅菌后即為無(wú)菌水。接種工具也是用紙包好滅菌。（3）接種前準(zhǔn)備工作A外植體表面滅菌前的準(zhǔn)備工作10mina 接種室的清潔和消毒以及超凈工作臺(tái)的開機(jī)和消毒：超凈工作臺(tái)消毒（75%酒精）, 紫外燈+風(fēng)機(jī) 關(guān)紫外燈，并保持風(fēng)機(jī)吹風(fēng)狀態(tài)

18、；將各組的培養(yǎng)基，無(wú)菌水、解剖刀、鑷子等操作工具放到超凈臺(tái)上，并進(jìn)行消毒待用。b消毒溶液、無(wú)菌水、裝材料的容器、解剖刀、鑷子、培養(yǎng)皿、計(jì)時(shí)器、待用培養(yǎng)基等的準(zhǔn)備。c配置消毒溶液：1g HgCl2 +1000ml蒸餾水，配置成0.1%的HgCl2。（1000毫升的2份）B 實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備a 準(zhǔn)備新鮮健康的胡蘿卜肉質(zhì)直根作實(shí)驗(yàn)材料；b 實(shí)驗(yàn)材料的修整、刷洗、沖洗； c 用洗衣粉水或肥皂水浸洗后再用自來(lái)水沖凈。每組12根胡蘿卜，用試管刷和肥皂洗凈，進(jìn)行初次表面清潔；洗凈后用干凈的燒杯盛放，用小刀切成合適大小的4段（每人1段），轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)待用。（4）植物材料的表面滅菌和接種A. 操作人員洗手消毒B. 裝材料的容器及玻璃棒用酒精表面消毒C. 將待消毒的材料浸入75的酒精中10秒，取出轉(zhuǎn)入無(wú)菌水沖洗干凈。（酒精單獨(dú)一個(gè)杯子裝，消毒完畢轉(zhuǎn)下一組使用）D. 將無(wú)菌水倒出，并倒入消毒劑（ 0.1 %HgCl2 ）并計(jì)時(shí)30分鐘；（同一瓶子中操作即可，但注意不要碰到瓶口等關(guān)鍵部位）E. 到預(yù)定時(shí)間（30分鐘）后，倒出消毒液，并用無(wú)菌水清洗4遍，