化學發(fā)光法的原理技術要點及評價應用

1、2021/6/161 化學發(fā)光免疫技術化學發(fā)光免疫技術第一節(jié)第一節(jié) 發(fā)光與化學發(fā)光劑發(fā)光與化學發(fā)光劑第二節(jié)第二節(jié) 發(fā)光酶免疫測定（發(fā)光酶免疫測定（C CLEIALEIA）（chemiluminescence enzyme immunoasssaychemiluminescence enzyme immunoasssay） 第三節(jié)第三節(jié) 化學發(fā)光免疫測定技術化學發(fā)光免疫測定技術(CLIA)(CLIA)（chemiluminescence immunoassaychemiluminescence immunoassay） 第四章第四章 電化學發(fā)光免疫測定技術電化學發(fā)光免疫測定技術( (ECLI)E

2、CLI)(electrochemiluminescence immunoassay)(electrochemiluminescence immunoassay)2021/6/162 化學發(fā)光免疫技術：化學發(fā)光免疫技術：集靈敏的化學集靈敏的化學 發(fā)光分析和特異的抗原抗體免疫測發(fā)光分析和特異的抗原抗體免疫測 定于一體的檢測技術。定于一體的檢測技術。概概 念念 特點：特點： 特異性高、敏感性高、分離簡便、特異性高、敏感性高、分離簡便、 快速、試劑無毒、安全穩(wěn)定、快速、試劑無毒、安全穩(wěn)定、 可自動化。可自動化。2021/6/163化學發(fā)光免疫技術的類型化學發(fā)光免疫技術的類型 按發(fā)光劑不同分為按發(fā)光劑不

3、同分為 1.1.發(fā)光酶免疫測定（發(fā)光酶免疫測定（C CLEIALEIA） chemiluminescence enzymeimmunoasssaychemiluminescence enzymeimmunoasssay 2. 2.化學發(fā)光免疫測定技術化學發(fā)光免疫測定技術(CLIA)(CLIA) chemiluminescence immunoassay chemiluminescence immunoassay 3. 3.電化學發(fā)光免疫測定技術電化學發(fā)光免疫測定技術( (ECLI)ECLI) electrochemiluminescence immunoassay electrochemilu

4、minescence immunoassay 按分離方法不同分按分離方法不同分 1.1.微粒子化學發(fā)光免疫測定微粒子化學發(fā)光免疫測定 2.2.磁顆?；瘜W發(fā)光免疫測定磁顆?；瘜W發(fā)光免疫測定2021/6/164第一節(jié)第一節(jié) 發(fā)光與化學發(fā)光劑發(fā)光與化學發(fā)光劑一、發(fā)光一、發(fā)光 一種物質由電子激發(fā)態(tài)回復到基態(tài)時，一種物質由電子激發(fā)態(tài)回復到基態(tài)時， 釋放出的能量表現為光的發(fā)射。釋放出的能量表現為光的發(fā)射。1.1.光照發(fā)光光照發(fā)光: :發(fā)光劑經短波長入射光照射后進入激發(fā)光劑經短波長入射光照射后進入激 發(fā)態(tài)，當回復至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。發(fā)態(tài)，當回復至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。2.2.生物發(fā)光生物發(fā)光

5、: :反應底物在熒光素酶的催化下利用反應底物在熒光素酶的催化下利用 ATPATP產能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回產能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回 復到基態(tài)時多余的能量以光子形式放出。復到基態(tài)時多余的能量以光子形式放出。3.3.化學發(fā)光化學發(fā)光: :在常溫下由化學反應產生的光的發(fā)射。在常溫下由化學反應產生的光的發(fā)射。 化學發(fā)光是一個多步驟的過程。化學發(fā)光是一個多步驟的過程。2021/6/165 熒光素酶熒光素酶ATP；O2；Mg2+氧化螢火蟲熒光素氧化螢火蟲熒光素螢火蟲熒光素螢火蟲熒光素光光 + AMP+ O2 + CO2 +2021/6/166化學發(fā)光化學發(fā)光 機制：機制：某些化合

6、物可以利用化學反應產生的能某些化合物可以利用化學反應產生的能 量使其產物分子或反應中間態(tài)分子上升至電子量使其產物分子或反應中間態(tài)分子上升至電子 激發(fā)態(tài)。當此產物分子或中間態(tài)分子衰退至基激發(fā)態(tài)。當此產物分子或中間態(tài)分子衰退至基 態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）。態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）。 化學發(fā)光劑或發(fā)光底物：化學發(fā)光劑或發(fā)光底物：在化學發(fā)光反應中參在化學發(fā)光反應中參 與能量轉移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量與能量轉移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量 的化合物。的化合物。 發(fā)光劑分為發(fā)光劑分為熒光素、生物發(fā)光劑、化學發(fā)光劑熒光素、生物發(fā)光劑、化學發(fā)光劑2021/6/167

7、能參與化學發(fā)光反應；能參與化學發(fā)光反應； 與抗原或抗體偶聯(lián)后形成穩(wěn)定的結合物試劑；與抗原或抗體偶聯(lián)后形成穩(wěn)定的結合物試劑； 偶聯(lián)后仍保留高的量子效應和反應動力；偶聯(lián)后仍保留高的量子效應和反應動力； 應不改變或極少改變被標記物的理化特性，應不改變或極少改變被標記物的理化特性， 特別是免疫活性。特別是免疫活性?；瘜W發(fā)光劑應符合以下幾個條件化學發(fā)光劑應符合以下幾個條件2021/6/1681.1.酶促反應的發(fā)光底物酶促反應的發(fā)光底物 是指經酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物。是指經酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物。 CLEIACLEIA中常用的酶有中常用的酶有HRPHRP和和APAP HRP HRP

8、的發(fā)光底物有魯米諾、對的發(fā)光底物有魯米諾、對- -羥基苯乙酸羥基苯乙酸 APAP的發(fā)光底物有的發(fā)光底物有AMPPDAMPPD、4-MUP4-MUP（熒光底物）（熒光底物） 特點：可作標記物、也可作過氧化物酶的底物特點：可作標記物、也可作過氧化物酶的底物 1.1 1.1 魯米諾魯米諾H2O2 /OH HRP+N2 + H2O +光光2021/6/169對對- -羥基苯乙酸（羥基苯乙酸（HPAHPA） HPA HPA在在H H2 2O O2 2存在下被存在下被HRPHRP氧化成氧化二聚體（熒光氧化成氧化二聚體（熒光 物質），在物質），在350nm350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出激發(fā)光作用下，發(fā)出450

9、nm450nm波長波長 的熒光，可用熒光光度計測量。的熒光，可用熒光光度計測量。 1.2 HPA 1.2 HPAH2O2HRP+熒熒 光光COOHHOCHCOOHHOCH22氧化二聚體氧化二聚體2021/6/1610AMPPDAMPPD AMPPD AMPPD在堿性條件下，被在堿性條件下，被APAP酶解生成相當穩(wěn)定的酶解生成相當穩(wěn)定的 AMP-DAMP-D陰離子，其有陰離子，其有2 230min30min的分解半衰期，發(fā)的分解半衰期，發(fā) 出波長為出波長為470nm470nm的持續(xù)性光，在的持續(xù)性光，在15min15min時其強度時其強度 達到高峰，達到高峰，151560min60min內光強度

10、保持相對穩(wěn)定。內光強度保持相對穩(wěn)定。 光光AP /OH HPO4 2O OOCH3O- 1.3 AMPPD 1.3 AMPPD2021/6/16114-MUP4-MUP 4-MUP 4-MUP被被APAP催化生成催化生成4-4-甲基傘形酮，在甲基傘形酮，在360nm360nm的的 激發(fā)光的作用下，發(fā)出激發(fā)光的作用下，發(fā)出448nm448nm的熒光，可用熒的熒光，可用熒 光光度計進行測量。光光度計進行測量。熒熒光光AP 1.4 4-MUP 1.4 4-MUP4-MU4-MU360nm360nm激發(fā)光激發(fā)光H H3 3POPO4 4 + +2021/6/16122.2.直接化學發(fā)光劑直接化學發(fā)光劑

11、特點：特點：不需催化劑，只需改變溶液的不需催化劑，只需改變溶液的pHpH等條件等條件 就能發(fā)光的物質。反應迅速、背景低、就能發(fā)光的物質。反應迅速、背景低、 信比高，發(fā)光量與信比高，發(fā)光量與AEAE濃度呈線性關系。濃度呈線性關系。 常用試劑：常用試劑：吖啶酯（吖啶酯（acridinium，AEAE）+ CO+ CO2 2+ + 光光NCH3COORHO+2-NCH3C OORONCH3C OOO2021/6/16133.3.電化學發(fā)光劑電化學發(fā)光劑 是指通過在電極表面進行電化學反應而發(fā)出是指通過在電極表面進行電化學反應而發(fā)出 光的物質。光的物質。特點：特點：反應在電極進行；反應在電極進行； 電子

12、供體為：三丙胺（電子供體為：三丙胺（TPATPA） 化學發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕化學發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕三聯(lián)毗啶釕三聯(lián)毗啶釕分子結構圖分子結構圖NNNNNNRuOONOO2021/6/1614第二節(jié)第二節(jié) 發(fā)光酶免疫測定發(fā)光酶免疫測定（CLEIA）一、原理一、原理 屬于酶免疫測定的一種。只是最后一屬于酶免疫測定的一種。只是最后一 步酶反應所用底物為發(fā)光劑，通過發(fā)光反應步酶反應所用底物為發(fā)光劑，通過發(fā)光反應 發(fā)出的光在特定的儀器上進行測定。發(fā)出的光在特定的儀器上進行測定。二、技術類型二、技術類型 根據酶促反應底物不同可分為：根據酶促反應底物不同可分為： 1.1.熒光酶免疫測定技術熒光酶免疫測定技術 2.

13、2.化學發(fā)光酶免疫測定技術化學發(fā)光酶免疫測定技術 根據免疫學反應模式分根據免疫學反應模式分 1.1.雙抗體夾心法和雙抗原夾心法雙抗體夾心法和雙抗原夾心法 3.3.固相抗原競爭法：固相抗原競爭法： 2021/6/1615熒光酶免疫測定技術反應原理圖熒光酶免疫測定技術反應原理圖EEEEE 洗滌洗滌棄上清棄上清EE堿性磷酸酶 標記抗體E抗體包被塑料微珠樣本抗原 4MU激發(fā)熒光E 是利用理想的酶熒光底物，生成的產物穩(wěn)定并有是利用理想的酶熒光底物，生成的產物穩(wěn)定并有 強的熒光強度，通過測定熒光強度進行定量。強的熒光強度，通過測定熒光強度進行定量。2021/6/1616化學發(fā)光酶免疫測定技術反應原理圖化學

14、發(fā)光酶免疫測定技術反應原理圖EEEEE 洗滌洗滌棄上清棄上清EE堿性磷酸酶 標記抗體E抗體包被塑料微珠樣本抗原AMPPDEAMPPD發(fā)光 是利用酶對發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光，是利用酶對發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光， 通過光強度的測定而直接進行定量。通過光強度的測定而直接進行定量。2021/6/1617電化學發(fā)光原理圖電化學發(fā)光原理圖 這一過程可在電極表面周而復始地進行這一過程可在電極表面周而復始地進行 產生許多光子，使光信號增強產生許多光子，使光信號增強 激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定不穩(wěn)定TPA+TPARu(bpy)3+Ru(bpy)Ru(bpy)2+光子(620nm)333*基態(tài)基態(tài)電極電極2021/

15、6/16181.1.抗原抗體結合反應抗原抗體結合反應 將已包被了抗體的乳膠微將已包被了抗體的乳膠微 粒和待測標本加入反應杯中，經溫育一定時間粒和待測標本加入反應杯中，經溫育一定時間 后后, ,再加入再加入APAP標記抗體，溫育標記抗體，溫育, ,形成固相包被抗形成固相包被抗 體體- -抗原抗原- -酶標抗體復合物酶標抗體復合物 技術要點技術要點 2.2.分離技術分離技術 將復合物轉移到玻璃纖維上，用緩將復合物轉移到玻璃纖維上，用緩 沖液洗滌，沒結合的抗原被洗脫，酶標抗體沖液洗滌，沒結合的抗原被洗脫，酶標抗體- -抗抗 原原- -膠乳微?？贵w復合物則被保留在纖維膜上。膠乳微?？贵w復合物則被保留在

16、纖維膜上。3.3.酶促發(fā)光反應酶促發(fā)光反應 加入加入4-MUP4-MUP，酶標抗體上，酶標抗體上APAP將將 4-MUP4-MUP分解，形成分解，形成4-MU4-MU，它在，它在360nm360nm激發(fā)光的照激發(fā)光的照 射下，發(fā)出射下，發(fā)出448nm448nm的熒光，經熒光儀記錄，放大，的熒光，經熒光儀記錄，放大， 根據標準曲線由電腦計算出所測物質的含量根據標準曲線由電腦計算出所測物質的含量2021/6/16191.1.磁顆粒分離法：磁顆粒分離法：用抗原或抗體包被磁顆粒用抗原或抗體包被磁顆粒, ,與標與標 本中相應抗原或抗體和酶標的抗體或抗原通過本中相應抗原或抗體和酶標的抗體或抗原通過 一定模

17、式的免疫學反應后一定模式的免疫學反應后, ,最終通過磁場將結合最終通過磁場將結合 酶標記物酶標記物ICIC和游離酶標記物進行分離的技術。和游離酶標記物進行分離的技術。 分離技術分離技術2.2.微粒子捕獲法：微粒子捕獲法：所用顆粒是無磁性微粒子作為所用顆粒是無磁性微粒子作為 抗體或抗原的包被載體抗體或抗原的包被載體, , 然后用纖維膜柱子進然后用纖維膜柱子進 行酶標記物的結合狀態(tài)和游離狀態(tài)的分離。行酶標記物的結合狀態(tài)和游離狀態(tài)的分離。3.3.包被珠分離法：包被珠分離法：用聚苯乙稀等材料制成小珠用聚苯乙稀等材料制成小珠, ,在在 小珠上包被抗原或抗體小珠上包被抗原或抗體, ,經抗原抗體反應后經抗原

18、抗體反應后, ,將將 結合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標記物進行分離結合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標記物進行分離. . 2021/6/1620第三節(jié)第三節(jié) 化學發(fā)光免疫測定技術化學發(fā)光免疫測定技術（CLIA）一、原理一、原理 用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體, ,與與 待測標本中相應待測標本中相應AbAb或或AgAg、磁顆粒性的、磁顆粒性的AgAg或或AbAb反反 應，通過磁場把結合狀態(tài)（沉淀部分）和游離應，通過磁場把結合狀態(tài)（沉淀部分）和游離 狀態(tài)的化學發(fā)光劑標記物分離開來，然后加入狀態(tài)的化學發(fā)光劑標記物分離開來，然后加入 發(fā)光促進劑進行發(fā)光反應，通過對發(fā)光強度的發(fā)光促進劑進行發(fā)光

19、反應，通過對發(fā)光強度的 檢測進行定量或定性檢測檢測進行定量或定性檢測 。二、技術類型二、技術類型 1.1.分離方法分離方法 常用磁顆粒分離技術常用磁顆粒分離技術 2.2.免疫學反應模式免疫學反應模式 同酶發(fā)光免疫測定技術同酶發(fā)光免疫測定技術 3.3.不同只是相應標記物是吖啶酯而不是酶不同只是相應標記物是吖啶酯而不是酶 2021/6/16211.1.抗原抗體結合反應抗原抗體結合反應 將包被將包被McAbMcAb的磁顆粒和待的磁顆粒和待 測標本加入到反應管中，標本中待測測標本加入到反應管中，標本中待測AgAg與磁珠與磁珠 上上AbAb結合，再加上結合，再加上AEAE標記標記AbAb，經過溫育，形成

20、，經過溫育，形成 磁珠磁珠AbAb- -AgAg-AE-AE標記標記AbAb復合物。復合物。 技術要點技術要點 2.2.分離技術分離技術 在電磁場中進行在電磁場中進行2-32-3次洗滌后，很快次洗滌后，很快 地將未結合的多余地將未結合的多余AgAg和標記和標記AbAb洗去。洗去。3.3.化學發(fā)光反應化學發(fā)光反應 經洗滌的磁經洗滌的磁珠珠中，加入中，加入H H2 2O O2 2和和 pHpH糾正液糾正液NaOHNaOH，這時，這時AEAE不需要催化劑即分解并不需要催化劑即分解并 發(fā)光，由集光器接收，經光電倍增管放大，記發(fā)光，由集光器接收，經光電倍增管放大，記 錄錄1 1S S內所產生的光子能，其

21、積分與被測物含量內所產生的光子能，其積分與被測物含量 成正比，按標準曲線，儀器可計算出被測物含量。成正比，按標準曲線，儀器可計算出被測物含量。 2021/6/1622 1.AE 1.AE其低背景噪音、化學反應簡單、快速而無催其低背景噪音、化學反應簡單、快速而無催 化劑?；瘎７椒ㄔu價方法評價 2.AE2.AE與大分子的結合并無減少所產生的光量，與大分子的結合并無減少所產生的光量， 從而增加靈敏度，靈敏度可達從而增加靈敏度，靈敏度可達10-15g/ml10-15g/ml。3.AE3.AE標記試劑有效期長，可達一年。標記試劑有效期長，可達一年。4.4.固相分離劑為極為幼細的磁粉，除增大包被固相分離

22、劑為極為幼細的磁粉，除增大包被 面積，加快反應外，亦同時使清洗及分離更面積，加快反應外，亦同時使清洗及分離更 簡易、快捷。簡易、快捷。2021/6/1623第四節(jié)第四節(jié) 電化學發(fā)光免疫測定技術電化學發(fā)光免疫測定技術（ECLI）一、原理一、原理 是一種在電極表面由電化學引發(fā)的特是一種在電極表面由電化學引發(fā)的特 異性化學發(fā)光反應，實際上包括了電化學和化異性化學發(fā)光反應，實際上包括了電化學和化 學發(fā)光二個過程。學發(fā)光二個過程。ECLECL是電啟動發(fā)光反應，而是電啟動發(fā)光反應，而CLCL 是通過化合物混合啟動發(fā)光反應。用化學發(fā)光是通過化合物混合啟動發(fā)光反應。用化學發(fā)光 劑三聯(lián)吡啶釕劑三聯(lián)吡啶釕Ru(b

23、py)3Ru(bpy)32+2+標記標記AbAb，通過，通過Ag-AbAg-Ab 反應和磁珠分離技術，根據三聯(lián)吡啶釕在電極反應和磁珠分離技術，根據三聯(lián)吡啶釕在電極 上發(fā)出的光強度對待測的上發(fā)出的光強度對待測的AgAg或或AbAb進行定量進行定量/ /定性。定性。二、技術類型二、技術類型 1.1.分離方法分離方法 常用磁顆粒分離技術常用磁顆粒分離技術 2.2.免疫學反應模式免疫學反應模式 同酶發(fā)光免疫測定技術同酶發(fā)光免疫測定技術 3.3.相應標記物是三聯(lián)吡啶釕而不是酶相應標記物是三聯(lián)吡啶釕而不是酶 2021/6/1624 1. 1.三聯(lián)吡啶釕標記抗體和生物素標記抗體與待測標本三聯(lián)吡啶釕標記抗體和生物素標記抗體與待測標本 同時加入一個反應杯中孵育反應同時加入一個反應杯中孵育反應 技術要點技術要點 2. 2.將鏈霉親和素（將鏈霉親和素（SASA）包被磁珠加入反應杯中，再次）包被磁珠加入反應杯中，再次 孵育，使生物素（孵育，使生物素（B B）通過與親和素（）通過與親和素（A A）的結合，）的結合， 將磁珠、將磁珠、AbAb連接為一體，形成雙連接為一體，形成雙AbAb夾心法。夾心法。 3. 3.蠕動泵將形成的蠕動泵將形成的 Ru(bpy)Ru(bpy)3 3 2+2+-Ab-Ag-Ab-B-SA-Ab-Ag-Ab-B-SA-磁珠磁珠 復合體吸