丙酮丁醇梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁醇實驗設(shè)計1

1、丙酮丁醇梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁醇丙酮丁醇梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁醇試驗的研究試驗的研究低成本生產(chǎn)丁醇的必要性低成本生產(chǎn)丁醇的必要性 生物燃料是可替代汽油等石油燃料的清潔能源。生物燃料生物燃料是可替代汽油等石油燃料的清潔能源。生物燃料主要包括生物柴油、生物乙醇和生物丁醇等。生物丁醇是一種極主要包括生物柴油、生物乙醇和生物丁醇等。生物丁醇是一種極具潛力的新型生物燃料，被稱為第二代生物燃料。與生物乙醇相具潛力的新型生物燃料，被稱為第二代生物燃料。與生物乙醇相比，它具有能量高于乙醇，有較好的燃料經(jīng)濟(jì)性，可提高汽車燃比，它具有能量高于乙醇，有較好的燃料經(jīng)濟(jì)性，可提高汽車燃料效率和行車?yán)锍虜?shù)等優(yōu)點(diǎn)。丁醇的性質(zhì)更接近于烴類，因此

2、與料效率和行車?yán)锍虜?shù)等優(yōu)點(diǎn)。丁醇的性質(zhì)更接近于烴類，因此與汽油的配伍性好，無需改造汽車。作為新型的生物燃料，全球?qū)ζ偷呐湮樾院?，無需改造汽車。作為新型的生物燃料，全球?qū)τ谏锒〈嫉男枨罅恐鹉暝黾?，生物丁醇的研究也因此成為?dāng)前于生物丁醇的需求量逐年增加，生物丁醇的研究也因此成為當(dāng)前可再生資源開發(fā)利用的熱點(diǎn)之一可再生資源開發(fā)利用的熱點(diǎn)之一 傳統(tǒng)發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇主要以玉米和糖蜜為原料，但對中國傳統(tǒng)發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇主要以玉米和糖蜜為原料，但對中國這樣的人口大國來說，糧食關(guān)系到國計民生，確保糧食安全是社這樣的人口大國來說，糧食關(guān)系到國計民生，確保糧食安全是社會穩(wěn)定最基本的需求。開發(fā)糧食替代資源，不與人爭糧

3、，不與糧會穩(wěn)定最基本的需求。開發(fā)糧食替代資源，不與人爭糧，不與糧爭地，是我國大規(guī)模生物煉制技術(shù)開發(fā)和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基本國策。爭地，是我國大規(guī)模生物煉制技術(shù)開發(fā)和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基本國策。原始農(nóng)作物玉米秸稈 植物秸稈主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。其中,纖維素、半纖維素是可發(fā)酵糖的來源,含量占66% 75%(纖維質(zhì)原料的絕干重量)。 但丙酮丁醇梭菌是無法直接利用木質(zhì)纖維素為底物進(jìn)行丁醇發(fā)酵,它需將木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)生葡萄糖、木糖等單糖再用于丁醇發(fā)酵。本實驗所用菌種丙酮丁醇梭菌（clostridiumacetobutylicum ） 一種革蘭染色陽性、細(xì)胞呈梭狀、能產(chǎn)生丙酮和丁醇等溶劑的厭氧芽抱桿菌。細(xì)胞

4、大小(0.6一0.9)um* (2.4一4.7)um，常含細(xì)菌淀粉粒。以周生鞭毛運(yùn)動。芽抱卵圓形，次端生。表面菌落圓形、突起，直徑3一5mm，邊緣不規(guī)則，色灰白，半透明，表面有光澤。嚴(yán)格厭氧。能分解蛋白質(zhì)和糖類;生物素和對氨基苯甲酸作生長因子試驗內(nèi)容一、玉米秸稈水解實驗設(shè)計一、玉米秸稈水解實驗設(shè)計二、丙酮丁醇梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁醇培養(yǎng)基及發(fā)酵二、丙酮丁醇梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁醇培養(yǎng)基及發(fā)酵 條件優(yōu)化條件優(yōu)化三、以玉米秸稈水解液為底物發(fā)酵產(chǎn)丁醇的三、以玉米秸稈水解液為底物發(fā)酵產(chǎn)丁醇的 研究研究一、一、玉米秸稈水解實驗設(shè)計 實驗研究玉米秸稈經(jīng)不同試劑預(yù)處理后對其酶水解的影響,以及ph值、時間、酶用量、底物濃度等因素

5、對酶水解率的影響,從而得出最佳酶解條件。并利用最佳條件下的水解液進(jìn)行丁醇發(fā)酵,從而達(dá)到農(nóng)業(yè)秸稈的資源化利用。1. 試驗材料：玉米秸稈、纖維素酶、及其他試劑和器材試驗材料：玉米秸稈、纖維素酶、及其他試劑和器材2. 試驗方法：試驗方法：（1）玉米秸稈的預(yù)處理。堿浸泡法）玉米秸稈的預(yù)處理。堿浸泡法: 3%的的naoh,固液比固液比 為為1 10,室溫浸泡室溫浸泡24 h,過濾過濾,濾渣洗凈后于濾渣洗凈后于60 烘干水分至恒烘干水分至恒重。氨水浸泡重。氨水浸泡: 10%的氨水的氨水,固液比為固液比為1 10,室溫浸泡室溫浸泡24h,過濾過濾,濾濾渣洗凈后于渣洗凈后于60 烘干水分至恒重。以不作處理玉米

6、秸稈作為對烘干水分至恒重。以不作處理玉米秸稈作為對照。照。（2）酶水解反應(yīng)條件。稱?。┟杆夥磻?yīng)條件。稱取1 g秸稈于秸稈于250 ml錐形瓶錐形瓶,加入纖維加入纖維素酶溶液素酶溶液(0. 05 mol/l, ph值值4. 8的檸檬酸的檸檬酸- 檸檬酸鈉緩沖溶液檸檬酸鈉緩沖溶液) ,將三角瓶置于恒溫水浴振蕩搖床上進(jìn)行酶解反應(yīng)將三角瓶置于恒溫水浴振蕩搖床上進(jìn)行酶解反應(yīng),溫度溫度50 ,轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速100 r/min,反應(yīng)時間反應(yīng)時間36 h。反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)結(jié)束,離心取上清液進(jìn)行還原糖的離心取上清液進(jìn)行還原糖的分析分析。（一）實驗材料與方法(1)秸稈成分分析。測定預(yù)處理前后1 g秸稈粉中的 纖維素、半

7、纖維素及木質(zhì)素含量。(2)還原糖的測定。dns法。(3)酶水解率測定。 酶水解率(%) = a 0. 9m (1 - w) 100 式中, a為還原糖質(zhì)量,m 為秸稈質(zhì)量,w為含水率。（二）（二） 分析方法設(shè)計因素：1.粉碎程度對酶水解的影響： 該試驗采用15目、60目和200目的秸稈粉碎程度考察粒徑大小對酶水解的影響。2. 溫度對酶水解的影響： 設(shè)計30 、35、40 、45 、50 、55 。七個梯度對酶水解的影響。( (三三) )酶水解工藝的優(yōu)化酶水解工藝的優(yōu)化3.纖維素酶的用量對酶水解的影響： 分別設(shè)置200、400、600、800、1000、1200u g 六個梯度。4.ph值對酶水

8、解的影響: 分別設(shè)置ph=3、4、5、6、7、8進(jìn)行試驗。5.底物濃度對酶水解的影響： 設(shè)置固液比為1：10、1：20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70幾種底物濃度做試驗。二、丙酮丁醇梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁醇培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)二、丙酮丁醇梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁醇培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化化（一）實驗設(shè)計：1.培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法(1)培養(yǎng)基a 種子培養(yǎng)基: 5%玉米醪，ph自然;b 原始發(fā)酵培養(yǎng)基: 葡萄糖 50 gl kh2po4 0.5l 醋酸胺 3 g/ l mgso7h2o 0.2g/l k2hpo4 0.5 g/ l 鄰氨基苯甲酸 0.01 g/ l ph 自然c 單因素實驗發(fā)酵培養(yǎng)基(g/ l

9、):以原始培養(yǎng)基為基礎(chǔ)組分，分別改變初始糖濃度、初始ph值、碳氮比、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、鄰氨基苯甲酸濃度;糖濃度:40 、 60 、 80 、 100 、 120 g/lph值: 4 、 5 、 6 、 7 、 8碳氮比: 37、42、47、52、57鄰氨基苯甲酸濃度:0.0005、0.001、 0.0015、0.002、 0.0025和 0.003g/l發(fā)酵溫度:32 、 34 、 36 、 38 、 40轉(zhuǎn)速: 150、160、170、180、200r/mind 正交設(shè)計實驗發(fā)酵培養(yǎng)基(g/ l ): 培養(yǎng)基選取葡萄糖為碳源，醋酸按為無機(jī)氮源，并添加適量鄰氨基苯甲酸。由于培養(yǎng)基的碳氮比c/n、

10、初始ph、發(fā)酵溫度以及生長因子對微生物的丙酮、丁醇合成影響很大，故對發(fā)酵培養(yǎng)基的c/n ，初始ph，鄰氨基苯甲酸濃度，發(fā)酵溫度進(jìn)行均勻設(shè)計實驗，以達(dá)到優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的目的。按照實驗設(shè)計按下表配制; 試驗號12345678910111213141516 c/n37373737424242424747474752525252 ph4567456745674567鄰氨基苯甲酸濃度g/l0.00050.0010.00150.0020.00050.0010.00150.0020.00050.0010.00150.0020.00050.0010.00150.002 發(fā)酵溫度32343638323

11、436383234363832343638a.菌種活化培養(yǎng):將lml菌種接種于 20ml玉米醪試管培養(yǎng)基中，沸水浴下熱處理1一2min，37下厭氧活化培養(yǎng)。b.搖瓶培養(yǎng)(單因素實驗):將活化好菌種以體積比10%的接種量接種于 100ml單因素實驗發(fā)酵培養(yǎng)基中，充氮?dú)?10min，于37， 150r/min搖床培養(yǎng)。c.搖瓶培養(yǎng)(正交設(shè)計實驗):將活化好菌種以體積比10%的接種量接種于 100ml正交設(shè)計實驗發(fā)酵培養(yǎng)基中，充氮?dú)?10min，于37， 150r/min搖床培養(yǎng)。（2）培養(yǎng)方法d.d.搖瓶培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)( (優(yōu)化驗證實驗優(yōu)化驗證實驗):):將活化好菌種將活化好菌種以體積比以體積比10

12、%10%的接種量接種于的接種量接種于 100ml100ml優(yōu)化優(yōu)化培養(yǎng)基中，初始培養(yǎng)基中，初始phph值值5.55.5，充氮?dú)?，充氮?dú)?10min10min，于于37.537.5， 150r/min150r/min搖床培養(yǎng)。搖床培養(yǎng)。e.e.發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng): :將將llll優(yōu)化培養(yǎng)基加入優(yōu)化培養(yǎng)基加入1.5l1.5l發(fā)發(fā)酵罐中，酵罐中，121121下飽和蒸汽滅菌下飽和蒸汽滅菌20min20min，冷卻后，將活化好菌種以體積比冷卻后，將活化好菌種以體積比10%10%的接的接種量加入發(fā)酵罐內(nèi)，通氮?dú)夥N量加入發(fā)酵罐內(nèi)，通氮?dú)?30min30min，設(shè)，設(shè)定溫度為定溫度為37.537.5，轉(zhuǎn)速，

13、轉(zhuǎn)速150r/min150r/min，初始，初始phph值值5.55.5的條件下發(fā)酵的條件下發(fā)酵(1)葡萄糖、果糖濃度的測定 采用dns法測定 (2)丙酮、丁醇、乙醇濃度的測定 用氣相色譜測定， (3)含氮量的測定 采用凱氏定氮法測定。(4)菌體生物量的測定 采用酶標(biāo)儀測定620nm下的菌體濃度（二）實驗結(jié)果分析（2）對照組培養(yǎng)基: 碳源分別為葡萄糖和果糖，濃度和玉米秸稈水解液保持一致，添加醋酸按(調(diào)好c/n比)，培養(yǎng)基中其他組成同玉米秸稈培養(yǎng)基，初始ph5.5。以上培養(yǎng)基均在121飽和蒸汽下滅菌15min。三、以玉米秸稈水解液為底物發(fā)酵產(chǎn)丁醇的研究三、以玉米秸稈水解液為底物發(fā)酵產(chǎn)丁醇的研究實驗方法1.培養(yǎng)基的制備 玉米秸稈水解液的制備:根據(jù)先前玉米秸稈水解實驗，按優(yōu)化的最佳條件水解，調(diào)最終濃度分別為5%，6%和8%。（1）玉米秸稈水解液培養(yǎng)基 玉米秸稈水解液、mnso4、 kh2po4、 mgso7h2o 、 k2hpo4、 鄰氨基苯甲酸（1 1）不同底物發(fā)酵過程中主要產(chǎn)物分析）不同底物發(fā)酵過程中主要產(chǎn)物分析（2 2）不同底物發(fā)酵過程中副產(chǎn)物分析）不同底物發(fā)酵過程