第七章色譜分離技術(shù)離子疏水2

1、第七章 吸附分離技術(shù)（1）吸附分離的分類與原理（2）吸附分離的影響因素和操作模式（3）吸附分離的基本理論（4）吸附分離的應(yīng)用（1）吸附分離的分類與原理吸附（adsorption）：是指溶質(zhì)從液相或氣相轉(zhuǎn) 移到固相的現(xiàn)象。固相 吸附劑（adsorbent）：一般為多孔顆粒。按吸附作用力的不同將吸附分為三個類型：l物理吸附：依靠吸附劑表面與溶質(zhì)間的范德華力l化學吸附：吸附劑表面活性點與溶質(zhì)間發(fā)生化學結(jié) 合、產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移現(xiàn)象l功能基吸附：通過吸附劑表面固定化的功能基團吸 附目標溶質(zhì)物理吸附吸附劑：主要指以物理吸附為主的固體吸附材料。吸附原理：主要依靠吸附劑與待分離物質(zhì)間的分子間引 力，即范德華力。特

2、點： （1）選擇性差 （2）吸附和解吸速度快吸附本質(zhì)： u范德華=u定向+u誘導+u色散定向力：由于極性分子的永久偶極矩產(chǎn)生的分子間的靜 電引力；誘導力：極性分子與非極性分子之間的吸引力，極性分 子產(chǎn)生的電場會誘導非極性分子極化，產(chǎn)生誘 導偶極矩。色散力：指非極性分子間的引力l吸附劑類型：功能基吸附l離子交換吸附劑：靜電作用l疏水吸附劑：疏水作用l親和吸附劑：親和作用離子交換吸附原理原理：吸附劑表面由極性分子或離子組成，能夠吸附溶液中帶相反電荷的離子形成雙電層，同時在吸附劑與溶液間發(fā)生離子交換，即吸附劑吸附離子后，同時要放出相應(yīng)摩爾數(shù)的離子于溶液中。溶質(zhì)的電荷是交換吸附的決定因素，所帶電荷越多

3、，在吸附劑表面相反電荷點上的吸附力越強。離子交換法: 是利用帶電的被分離物質(zhì)與離子交換填料上的離子交換能力的不同而進行分離的方法。 離子交換樹脂離子交換劑 離子交換層析材料離子交換劑的組成離子交換劑的組成：三部分l惰性的不溶性的高分子固定骨架，也稱載體；l與載體以共價鍵連接的不能移動的活性基團，也稱功能基團；l與功能基團以離子鍵連接的可移動的活性離子，也稱平衡離子。1、離子交換樹脂載體：苯乙烯-二乙烯苯型 最常用 丙烯酸-二乙烯基苯 酚醛樹脂 多乙烯多胺-環(huán)氧氯丙烷樹脂特點：（1）強度好，流速較高 （2）較高的離子交換 當量（3）耐強酸、強堿 （4）抗污染能力強適用范圍適用范圍：（1）中小生物

4、物質(zhì)的純化：氨基酸、抗生素、 部分中藥有效成分等；（2）除鹽、除重金屬離子（如去離子水）、去 色素等。缺點：由于離子交換樹脂疏水性強、交聯(lián)度高、 孔隙小、電荷密度高，容易導致蛋白質(zhì)和 酶的失活，不適于生物大分子的分離。 國產(chǎn)離子交換樹脂的骨架代號及分類代號代 號分類名稱骨架名稱代 號分類名稱骨架名稱 0 1 2 3強酸性弱酸性強堿性弱減性苯乙烯系丙烯酸系酚醛系環(huán)氧系 4 5 6螯合性兩 性氧化還原乙烯吡啶系脲醛系氯乙烯系國產(chǎn)離子交換樹脂的命名原則： d 交聯(lián)度數(shù)字 順序號 聯(lián)接符號 骨架代號 順序號 分類代號 骨架代號 大孔型代號 分類代號 1 100 為強酸性陽離子交換樹脂101 200為弱

5、酸性陽離子交換樹脂201 300為強堿性陰離子交換樹脂301 400為弱堿性陰離子交換樹脂如：001 7是凝膠型苯乙烯系強酸性陽離子交換樹脂，交聯(lián)度7%；d201是大孔型苯乙烯系季胺 i 型強堿性陰離子交換樹脂2、離子交換層析材料、離子交換層析材料載體：載體：葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、纖維素和親水性聚乙 烯等。特點特點：（1）大分子能自由在骨架之間自由擴散和交換，親水性 強、表面積大，易吸附大分子；（2）交換基團稀疏，對大分子的實際交換容量大；（3）吸附力弱，交換和洗脫條件緩和，不易引起變性；（4）分辨力強，能分離復雜的生物大分子混合物。應(yīng)用： 用于分離蛋白質(zhì)、酶等大分子的生物活性物 質(zhì)。缺點：

6、（1）強度較差，流速低；（2）強酸、強堿容易破壞天然多糖的結(jié)構(gòu)；（3）易污染，易被微生物降解。 強陽 陽離子交換劑 弱陽離子交換劑 強陰 陰離子交換劑 弱陰 離子交換劑的類型 能與陽離子進行交換的離子交換劑。l強陽強陽（強酸性）離子交換劑 活性基團是磺酸基團（-so3h）或次甲基磺酸基團-(ch2)2so3h。都是強酸性基團，其電離程度大且不受溶液ph的影響，當ph值在1-14范圍內(nèi)時，均能進行離子交換反應(yīng)。中和：rso3-h+ + na+oh- r-so3- na+ +h2o中性鹽分解： rso3-h+ + na+cl r-so3- na+ +hcl復分解： r-so3- na+ + k+c

7、l- r-so3- k+ +nacl 利用復分解原理，可將青霉素鉀鹽轉(zhuǎn)成青霉素鈉鹽 r-so3-na+ + pen-k+ r-so3- k + + pen-na+l弱陽弱陽（弱酸性）離子交換劑： 活性基團是羧酸基團-cooh、氧-och2cooh、酚羥基團c6h5oh及-雙酮基團-coch2coch3等。都是弱酸性基團，其電離程度受溶液ph的變化影響很大，在酸性溶液中幾乎不發(fā)生交換反應(yīng)，其交換能力隨ph的下降而減少，隨ph的升高而遞增。 羧酸陽離子交換樹脂必須在ph 7的環(huán)境中才能正常工作，對于酸性更弱的酚羥基吸附劑，則應(yīng)在ph 9的環(huán)境中才能正常反應(yīng)。 羧酸陽離子交換樹脂在不同ph下的交換容

8、量中和：rcoo-h+ + na+oh- rcoo-na+ + h2o復分解： rcoo-na+ + k+cl- rcoo-k+ + na+cl-利用復分解原理提取鏈霉素 r(coo-na+)3 + str 3h+cl- r(coo-)3str3h+ + 3nacl ph 5 6 7 8 9交換容量/（meq/g） 0.8 2.5 8.0 9.0 9.0陰離子交換劑 能與陰離子進行交換的離子交換劑l強陰（強堿性）離子交換劑：強陰（強堿性）離子交換劑： 活性基為季氨基團，有三甲胺基團rn+(ch3)3oh-(i型）和二甲基-羥基乙基胺基團-rn+(ch3)2(c2h4oh)oh- (ii型）和強

9、酸性離子交換相似，其活性基團電離程度較強，不受溶液ph變化的影響，在ph= 1-14范圍內(nèi)均可使用。中和： r-n+(ch3)3oh- + h+cl- r-n+(ch3)3cl- + h2o中性鹽分解：r-n+(ch3)3oh- + na+cl- r-n+(ch3)3cl- + na+oh-復分解： r-n+(ch3)3cl- + na2so42- rn+(ch3)32so42- + 2na+cl- 主要用于制備無鹽水（除去sio2-、co32-等弱酸根）及卡那霉素、巴龍霉素、新霉素等的精制。l弱陰（弱堿性）離子交換劑弱陰（弱堿性）離子交換劑： 活性基有伯胺基團-nh2，仲胺-nhr和叔胺-n

10、（r）2以及吡啶c6h5n等基團， 如二乙氨乙基-(ch2)2n+h(c2h5)2 (deae)就是在分離蛋白上常用的弱陰離子交換基團。基團的電離程度弱，和弱酸陽離子樹脂一樣交換能力受ph的變化影響很大，ph越低，交換能力越高，故在ph7的溶液中使用。中和：rn+h3oh- + hcl rn+h3cl- + h2o復分解：r(n+h3cl-)2 + na2+so42- r(n+h3)2so42- + 2nacl離子交換劑的性能評價1、交換容量：是指單位質(zhì)量的干燥離子交換劑或單位 體積的濕離子交換劑所能吸附的一價離 子的毫摩爾數(shù)，是表征離子交換能力的 主要因素。 測定方法：對于陽離子交換劑，先用

11、鹽酸將其處理成 氫型后，稱重并測其含水量，同時稱數(shù)克 離子交換劑，加入過量已知濃度的naoh， 靜止24小時或數(shù)日，測定剩余的naoh摩爾 數(shù)。就可求得該陽離子交換劑的交換容量。滴定曲線其它性能l孔徑、孔徑分布、比表面積和孔隙率的表征l吸附常數(shù)（吸附動力學）吸附等溫線 假設(shè)只考慮溶質(zhì)在表面的吸附，而忽略溶劑在表面的吸附作用，則在恒定溫度下，吸附量只和溶質(zhì)的濃度有關(guān)。（b） 單分子層吸附（c）多分子層吸附)(cfm 不同溶質(zhì)對吸附劑親和力大小的評價： 在這種情況下，a組分比b組分的親和力低，它將首先從柱中脫附下來。bamcbbmclangmuir等溫線： 也被稱為單分子層吸附等溫線。假設(shè)：吸附在

12、吸附劑的活性中心上進行 吸附物分子間無相互作用 每一個活性中心只能吸附一個分子 但在實際的吸附中，特別是在蛋白質(zhì)的吸附中，上述假設(shè)很難成立。在這種情況下，吸附方程可用如下方程描述。 assaadka未被吸附的溶質(zhì)分子s吸附劑表面未被占有的活性位點as占據(jù)活性點的吸附劑分子kad平衡熱力學常數(shù)理想條件下：langmuir提出了表面占據(jù)分率的概念：saasaaaksaasad1akaksasasadad假如a占據(jù)了吸附劑表面上的所有活性位點，則將上述兩式結(jié)合，則得到 langmuir 等溫方程：maxasas1maxakakasasadadadeaackcqqmax影響離子交換分離的因素離子交換的

13、選擇性用交換常數(shù)表示：l（1）水合離子半徑的影響l 對無機離子而言，離子水合半徑越小，離子l對樹脂活性基的親合力越大，也就容易被吸附。l按水化半徑次序，各種離子對樹脂親合力大小的l次序為:l對一價陽離子：l li na+、k+nh4+ rb+ cs+ ag+ pb2+l對二價陽離子：l mg2+ zn2+ cu2+ ni2+ co2+ ca2+ sr2+ pb2+ ba2+l對一價陰離子：l f- hco3- cl- hso3- br- no3- i clo4- 如果是強酸或強堿樹脂，h+和oh-的序位與li+相當或在f-之前，而對弱酸或弱堿樹脂，其交換序列在同價離子之后。（2）離子化合價 若

14、交換離子的價電數(shù)大于平衡離子時，若溶液較稀，有利于離子的交換，交換離子的吸附量將增大。溶液中離子濃度（meq/ml）鏈霉素的吸附量（ meq/g）溶液中離子濃度（meq/ml）鏈霉素的吸附量（ meq/g）鏈霉素鈉鏈霉素鈉0.005170.002581.5000.750 0.256 0.8000.001030.000520.3000.150 1.93 2.76當有鈉離子存在時，溶液的稀釋對苯氧乙酸-酚-甲醛樹脂吸附鏈霉素的影響（樹脂對鏈霉素的交換容量為3.17meq/g)可見，在較稀的溶液中，樹脂幾乎僅吸附高價離子。（3）溶液的ph值 由于溶液的ph值直接決定樹脂交換基團及交換離子的解離程度，

15、進而影響樹脂對交換的選擇性和吸附容量。對于強酸、強堿性樹脂，溶液ph主要左右交換離子的解離度，決定它帶何種電荷以及電荷量，決定被樹脂吸附或吸附的強弱。對于弱酸、弱堿性樹脂，溶液的ph還是影響樹脂解離程度和吸附能力的重要因素。但過強的交換能力有時會影響到交換的選擇性，同時增加洗脫難度。 對生物活性分子而言，過強的吸附以及劇烈的洗脫條件會增加變性失活的機會。另外，樹脂的解離程度與活性基團的水合程度也有密切關(guān)系。水合度高的溶漲度大，選擇吸附能力下降。這就是為什么在分離蛋白質(zhì)或酶時較少選用強酸、強堿樹脂的原因。(4)離子強度 高的離子濃度必與目的物離子進行競爭，減少有效交換容量。另一方面，離子的存在會

16、增加蛋白質(zhì)分子以及樹脂活性基團的水合作用，降低吸附選擇性和交換速度。所以一般在保證目的蛋白質(zhì)的溶解度和溶液緩沖能力的前提下，盡可能采用低離子強度。 荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)可用下式表示：i 流動相的離子強度，a和b為常數(shù)， 為離子強度無限大時溶質(zhì)的分配系數(shù)，是靜電相互作用以外的非特異性吸附引起的溶質(zhì)在離子交換劑上的分配。 對于蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)，在物理意義上，b為溶質(zhì)的靜電荷數(shù)與離子價數(shù)之比。在ph偏離等電點的溶液中，蛋白質(zhì)溶質(zhì)的靜電數(shù)常為兩位數(shù)以上，故b值較大，即蛋白質(zhì)的分配系數(shù)對離子強度非常敏感。在同一離子強度下，不同蛋白質(zhì)的分配系數(shù)相差非常大（幾個數(shù)量級)。 對于蛋白質(zhì)的離子交換

17、層析分離常采用deae、cm等較弱的離子交換吸附劑。 miaimb)(m(5)有機溶劑的影響 離子交換樹脂在水和非水體系中的行為是不同的。有機溶劑的存在會使樹脂收縮，也會使有機物的電離度降低，不利于分子量較大的有機物的吸附。利用這個特性，常在洗滌劑中加適當有機溶劑來洗脫難洗脫的有機物質(zhì)。(6)交聯(lián)度、膨脹度、分子篩 對凝膠型樹脂來說，交聯(lián)度大、結(jié)構(gòu)緊密、膨脹度小。樹脂篩分能力大，促使吸附量增加，其交換常數(shù)亦大。相反，交聯(lián)度小、結(jié)構(gòu)松弛、膨脹度大，吸附量減少，交換常數(shù)值亦減少子不受阻礙。對于交聯(lián)度大的凝膠型樹脂有機大分子與無機離子在樹脂內(nèi)擴散速度不等，利用這一原理將大分子和無機離子分開的方法稱為

18、分子篩法。在抗生素，如鏈霉索、慶大雷索、去甲基萬古霉素生產(chǎn)中，利用高交聯(lián)度的114樹脂去除ca2+、mg2+，能達到降低灰分，減少抗生素的損失的目的。(7)樹脂與離子間的輔助力 離子交換樹脂與被吸附離子間的作用力除靜電力外，還存在一種輔助力，這一輔助力存在于被交換離子是有機離子的情況下。通常，無機離子進行交換時的交換常數(shù)k多在110之間，而有機離子交換時，相對分子質(zhì)量越大，交換常數(shù)越大，k值有時可高達102 - 103 ，這種現(xiàn)象單純采用靜電吸附力無法解釋，實際上是由于存在著一些輔助力。四環(huán)素族抗生素分子中酰胺基(一conh2)上的h和磺酸樹脂的功能基(一so3h)上的氧易形成氫鍵，所以k值明

19、顯增大，尿素是一種中性物質(zhì)，因能形成氫鍵，所以尿素溶液很容易將青霉素從磺酸樹脂上洗脫下來。 除氫鍵外，亦存在著樹脂與被交換離子間的范德華力。例如，骨架內(nèi)含有脂肪烴、苯環(huán)和萘環(huán)的樹脂，它對芳香族化合物的吸附能力依次相應(yīng)增加；酚硝酸樹脂對一價季胺鹽類陽離子的親和力隨離子的水合半徑的增加而增加，這種現(xiàn)象與天機離子交換情況相反，這是由于吸附大分子時起主導作用的是范德華力而不是靜電力。 另有一些研究表明，樹脂吸附較大離子后，在被吸附離子間存在輔助力，樹脂吸附的大離子愈多，輔助力愈大。離子交換吸附分離的操作方法（1）離子交換吸附劑的選擇 保證分離目標物和主要雜質(zhì)對吸附劑的吸附力有足夠的保證分離目標物和主要

20、雜質(zhì)對吸附劑的吸附力有足夠的差異。差異。l目的物具有較強的堿性和酸性時，宜選用弱酸性弱堿性的吸附劑，有利于提高選擇性，并便于洗脫。l目的物是弱酸性或弱堿性的小分子物質(zhì)時，往往選用強堿、強酸樹脂。如氨基酸的分離多用強酸樹脂，以保證有足夠的結(jié)合力。l對于蛋白質(zhì)類生物大分子的分離多采用弱堿或弱酸性層析材料，以減少生物大分子的變性，有利于洗脫，并提高選擇性。 小分子選用離子交換樹脂，蛋白質(zhì)等生物大分子選用小分子選用離子交換樹脂，蛋白質(zhì)等生物大分子選用離子交換層析材料。離子交換層析材料。l吸附條件 （1）調(diào)整ph值使目標物與吸附劑離子交換功 能基帶相反電性 （2）低的離子強度或低鹽濃度上樣l洗脫條件 調(diào)

21、整ph值或增加離子強度(高鹽濃度洗脫）。離子交換(iec)的應(yīng)用及特點 iec 是蛋白質(zhì)、肽和核酸等生物產(chǎn)物的主要純化 手段iec分離的特點：（1）料液處理量大，具有濃縮作用，可在較高流速下操作；（2）應(yīng)用范圍廣泛，優(yōu)化操作條件可大幅度提高分離的 選擇性，所需柱長較短；（3）產(chǎn)品回收率高；（4）商品化的離子交換劑種類多，選擇余地大，價格也遠低 于親合吸附劑。疏水作用層析（色譜）一、原理疏水作用層析(hydrophobic interaction chromatography, hic) 是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團的疏水吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進行蛋白

22、質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法。二、疏水性吸附劑 將下表所列的各種凝膠過濾介質(zhì)偶聯(lián)上疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑。 常用的疏水性配基： 苯基、短鏈烷基（c3c8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。吸附特點： 疏水性吸附作用的大小與配基的疏水性（疏水鏈長度）和配基密度成正比，故配基修飾密度應(yīng)根據(jù)配基的疏水性而異，疏水性高的配基較疏水性低的配基修飾密度低。一般配基修飾密度在10 40mol/ml，配基修飾密度過小則疏水性吸附不足，密度過大則洗脫困難。三、hic操作上樣及洗脫的一般規(guī)律上樣及洗脫的一般規(guī)律： 在高鹽濃度條件下，蛋白質(zhì)與固定相疏水締合；濃度降低時，疏水作用減弱，逐步被洗脫下來。一般用

23、ph 6-8的鹽水溶液如（nh4）2so4。鹽的濃度影響蛋白質(zhì)的疏水性，從而影響蛋白質(zhì)的保留值。鹽：na2so4，kh2po4，nahpo4，(nh4)2so4，nh4oac，koac，naoac，nacl 鹽析作用增強 洗脫能力增強 1、影響疏水性吸附的因素 蛋白質(zhì)的疏水性與其荷電性質(zhì)相比復雜得多，不易定量掌握。除疏水性吸附劑的性質(zhì)(疏水性配基的結(jié)構(gòu)和修飾密度)外，流動相的組成以及操作溫度對蛋白質(zhì)疏水性吸附的強弱均產(chǎn)生重要影響。(1)離子強度及種類 蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用隨離子強度提高而增大。離子的種類亦影響蛋白質(zhì)的疏水性吸附。疏水性吸附與鹽析沉淀一樣，在高價陰離子的存在下作用力較高。因此h

24、ic分離過程中主要利用硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等鹽溶液為流動相，在略低于鹽析點的鹽濃度下進料，然后逐漸降低流動相離子強度進行洗脫分離。(2)破壞水化作用的物質(zhì) , ,和 等離子半徑較大、電荷密度低的陰離子可減弱水分子之間相互作用。這類陰離子與上述鹽析作用強的高價陰離子(如 ， 等)的作用正好相反，前者稱為離液離子(chaotropic ion)，后者稱為反離液離子(antichaotropic ion)。在離液離子存在下疏水性吸附減弱，蛋白質(zhì)易于洗脫。 除離液離子外，乙二醇和丙三醇等含羥基的物質(zhì)也具有影響水化的作用，降低蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用，經(jīng)常用做洗脫促進劑，洗脫疏水吸附強烈、僅靠降低鹽濃度

25、難于洗脫的高疏水性蛋白質(zhì)。scn4cloi24so24hpo(3)表面活性劑 表面活性劑可與吸附劑及蛋白質(zhì)的疏水部位結(jié)合，從而減弱蛋白質(zhì)的疏水性吸附。根據(jù)這一原理，難溶于水的膜蛋白質(zhì)可添加一定量的表面活性劑使其溶解，利用hic法進行洗脫分離。但此時選用表面活性劑的種類和濃度應(yīng)當適宜：濃度過小則膜蛋白不溶解，過大則抑制蛋白質(zhì)的吸附。 (4)溫度 一般吸附為放熱過程，溫度越低吸附結(jié)合常數(shù)越大。但疏水性吸附與一般吸附相反，吸附結(jié)合作用隨溫度升高而增大。蛋白質(zhì)疏水部位的失水有利于疏水性吸附，而失水是吸熱過程，即疏水性吸附為吸熱過程, 0h因為：所以吸附平衡常數(shù)k隨溫度的升高而增大。2，蛋白質(zhì)的分離 蛋

26、白質(zhì)與hic填料之間的作用很復雜，有時不能完全用疏水性相互作用來解釋，有時配基苯環(huán)還會與蛋白質(zhì)分子上的芳香族氨基酸產(chǎn)生-鍵。因此，在利用hic分離蛋白質(zhì)混合物時，需事先利用各種小型預裝柱進行吸附與洗脫實驗，確定最佳吸附劑和洗脫劑。2lnrthdtkd羥基磷灰石層析羥基磷灰石（hydroxyapatite, hap): 是一種磷酸鈣晶體，基本分子結(jié)構(gòu)為26410)()(ohpoca 一般認為，hap的吸附主要基于鈣高子和磷酸根離子的靜電引力，即在hap晶體表面存在兩種不同的吸附晶面，各存在吸附點c點和p點，前者起陰離于交換作用，后者起陽離于交換作用因此，在中性ph環(huán)境下酸性蛋白質(zhì)(pi7)主要吸

27、附于p點利用磷酸鹽緩沖液(k2hp04+kh2po4）為流動相洗脫展開時，磷酸根離子在c點競爭性吸附，交換出酸性蛋白質(zhì)，而k+在p點競爭性吸附，交換出堿性蛋白質(zhì)。所以hap層析通常以磷酸鹽緩沖液為流動相，采用提高鹽濃度的線性梯度洗脫法。應(yīng)用： 由于hap晶體表面結(jié)構(gòu)特別，吸附機理特殊，因此可用于識別dna及rna的單鏈和雙鏈，分離iec和hic難于分離的蛋白質(zhì)物系。例如，人腫瘤壞死因子(human tumour necrosis factor,htnf)中構(gòu)成蛋白質(zhì)分子的差異很小, 利用iec法、高效rpc法和電泳法只能得到一個洗脫峰或電泳帶，而利用hap層析可分離得到4個洗脫峰。 hap吸附劑價格便宜，遠低于高子交換劑，適用于大規(guī)模分離純化過程，已成為單克降抗體的主要純化手段。灌注層析(perfusion chromatograph