Westernblot實驗步驟及注意事項1

1、Westernblot實驗步驟及注意事項Westernblot 實驗步驟1. 組織塊稱重2. 利用液氮、研缽粉碎組織塊3. 加入PolytronRIPA 緩沖液（每克組織3 ml RIPA ）， PMSF （每克組織進(jìn)一步勻漿（15,000 轉(zhuǎn) /分 *1 分鐘）維持430 l， 10 mg/ml PMSF），利用4. 加入 PMSF （每克組織 30 l， 10 mg/ml PMSF ），冰上孵育 30 分鐘5. 移入 離心管 4 約 20,000 g （約 15,000 轉(zhuǎn)） 15 分鐘6. 上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20保存7. 進(jìn)行 Bradford 比色法測定蛋白質(zhì)濃度8. 取相同質(zhì)

2、量的細(xì)胞裂解液（體積* 蛋白質(zhì)濃度），并加等體積的2電泳加樣緩沖液9. 沸水浴中 3 分鐘10. 上樣11. 電泳（濃縮膠20mA ，分離膠35mA ）12. 電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（ 100mA 40 分鐘）13. 膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍(lán)染色14. Westernblot 試劑 盒顯色15. 分析比較記錄western blot 的實驗步驟及注意事項的資料1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。1）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡。2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間

3、，保持濕潤和沒有氣泡。3）將此濾紙 /凝膠 /薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠。5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移。6）轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。3. 用 100ml 水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。4. 膜置印跡緩沖液中于37保溫 1 小時。5. 室溫下，用 PBS-Tween 緩沖液洗滌薄膜。6. 用封口機將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。7袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。8混合： NGS(100 微升 )，

4、印跡緩沖液中的抗體 （ 10 毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動2 小時（或 4過夜）9用總體積 300ml PBS-Tween 緩沖液，分4 次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml 。10 將連接生物素的羊抗兔IgG （ 40 微升溶于 10 毫升印跡緩沖液 /100 微升 NGS ）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動1 小時。11 按步驟9 洗滌。12 加入抗生素蛋白 -HRP （ 40微升溶于10 毫升印跡緩沖液 /100 微升 NGS ），于室溫下?lián)u動。注意事項：western blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用于 western blot 檢測

5、。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行western blot 。實驗中取膠和膜需帶手套。Western 實驗步驟Western，也稱 Western blot 、Western blotting 、Western 印跡， 是用 抗體 檢測蛋白的重要方法之一。Western 可以參考如下步驟進(jìn)行操作。1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation)O 可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖?，例如碧云天生產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋

6、白等，胞組份蛋白，也可以使用試劑 盒進(jìn)行抽提，例如碧云天生產(chǎn)的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)試劑 盒。O 收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。 因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用碧云天生產(chǎn)的 Western 及 IP 細(xì)胞裂解液，可以使用BCA 蛋白濃度測定試劑 盒。2. 電泳 (Electrophoresis)(1) SDS-PAGE 凝膠配制O SDS-PAGE 凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的SD

7、S-PAGE 凝膠配制試劑 盒。該 試劑 盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑 以及配制各種濃度SDS-PAGE 的配方。(2) 樣品處理O 在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液。 例如 2X 或 5X 的 SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X 的 SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X) 。O 100 或沸水浴加熱3-5 分鐘，以充分變性蛋白。(3) 上樣與電泳O 冷卻到室溫后，把蛋白樣品

8、直接上樣到SDS-PAGE 膠加樣孔內(nèi)即可。O 為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。O 電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于 Bio-Rad 的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V ，高電壓可以設(shè)置在120V 左右。 SDS-PAGE 可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求，也可以采用碧云天的多功能電泳儀(帶定時 )。為了電泳方便起見，也可以采用整個SDS-PAGE 過程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V ，然后設(shè)定定時時間為90 120 分鐘。設(shè)置定時可以避免經(jīng)常發(fā)生的

9、電泳過頭。O 通常電泳時溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。3. 轉(zhuǎn)膜 (Transfer)O 我們推薦在 Western 實驗中選用 PVDF 膜。硝酸纖維素膜 (NC 膜 )也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。O 通常如果使用Bio-Rad 的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為30-60 分鐘。也可以在15-20mA 轉(zhuǎn)膜過300-400mA，轉(zhuǎn)膜時間為夜。轉(zhuǎn)膜時也可以使用碧云天的多功能電泳儀(帶定時)。具體的轉(zhuǎn)膜時間要根

10、據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。O 在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時，通常會有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。O 轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量最大的1-2 條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對膜進(jìn)行染色，以觀察實際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE 膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。4. 封閉 (Blocking)O 轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western 洗滌液中，漂洗1-2 分鐘，以洗去膜上的

11、轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。O 用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，加入Western 封閉液，在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60 分鐘。對于一些背景較高的抗體，可以在4封閉過夜。在整個Western 過程中我們推薦使用碧云天生產(chǎn)的側(cè)擺搖床，側(cè)向擺動速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。5. 一抗孵育 (Primary antibody incubation)O 參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western 一抗稀釋液稀釋一抗。O 用微型臺式真空泵吸盡封閉液， 立即加入稀釋好的一抗， 室溫或 4在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育

12、一小時效果不佳，可以在4緩慢搖動孵育過夜。O 回收一抗。加入Western 洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10 分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10 分鐘。共洗滌3 次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。6. 二抗孵育 (Secondary antibody inucubation)O 參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western 二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP) 標(biāo)記的二抗。O 用微型臺式真空泵吸盡洗滌液， 立即加入稀釋好的二抗， 室溫或 4在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。O 回收二抗。加入Western 洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10 分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10 分鐘。共洗滌3 次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。7. 蛋白檢測 (Detection of