(完整word版)重組質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)在實(shí)現(xiàn) DNA 體外重組過程中，正確選擇合適的載體和限制性內(nèi)切酶并能對限制性核酸 內(nèi)切酶對載體和目的 DNA 進(jìn)行切割，產(chǎn)生利于連接的合適末端。學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)構(gòu)建重組 DNA 分子的基本方法，掌握載體和外源目的 DNA 酶切的操作。 學(xué)習(xí)利用 T4DNA 連接酶把酶切后的載體片段和外源目的 DNA 片段連接起來， 構(gòu)建體外 DNA 分子的技術(shù)，了解并掌握幾種常用的連接方式。掌握利用 Cacl2 感受態(tài)細(xì)胞的方法。 學(xué)習(xí)掌握熱擊法轉(zhuǎn)化 E.coli 的原理和方法。 掌握互補(bǔ)篩選法和 PCR檢測法篩選重組子的方法。 并鑒定體外導(dǎo)入目的 DNA 片段的大小。

2、學(xué)習(xí)和掌握 PCR 反應(yīng)的基本原理和操作技術(shù)，了解引物設(shè)計(jì)的基本要求。實(shí)驗(yàn)原理：外源 DNA 與載體分子的連接即為 DNA 重組技術(shù)，這樣重新組合的 DNA 分子叫做重組子。 重組的 DNA 分子式在 DNA 連接酶的作用下， 有 Mg2+ 、ATP 存在的連接緩沖系統(tǒng)中， 將分 別經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切的載體分子和外源 DNA 分子連接起來。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞 中，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以通過 互補(bǔ)篩選法篩選出重組子，并可通 過酶切電泳及 PCR 檢驗(yàn)的方法進(jìn)行重組子的鑒定。重組子的構(gòu)建 酶切時(shí)首先要了解目的基因的酶切圖譜， 選用的限制性內(nèi)切酶不能目的基因內(nèi)部有專一的識 別

3、位點(diǎn)， 否則當(dāng)用一種或兩種限制性內(nèi)切酶切割外源工體DNA 時(shí)不能得到完整的目的基因。其次要選擇具有相應(yīng)的單一酶切位點(diǎn)質(zhì)?；蛘呤删w載體分子。 常用的酶切方法有雙酶切法 和單酶切法兩種。本實(shí)驗(yàn)采用單酶切法，即只用一種限制性內(nèi)切酶切割目的 DNA 片段，酶 切后的片段兩端將產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端，再選用同樣的限制性內(nèi)切酶處理載體。在 構(gòu)建重組子時(shí)，除了形成正常的重組子外，還可能出現(xiàn)目的 DNA 片段以相反方向插入載體 分子中，或目的 DNA 串聯(lián)后再插入載體分子中，甚至出現(xiàn)載體分子自連，重新環(huán)化的現(xiàn)象。 單酶切法簡單易行單是后期篩選工作比較復(fù)雜。各種限制性內(nèi)切酶都有去最佳反應(yīng)條件，最 主要的因

4、素是反應(yīng)溫度和緩沖液的組成， 在雙酶切體系中， 限制性內(nèi)切酶在使用時(shí)應(yīng)遵循 “先 低鹽后高鹽，先低溫后高溫”的原則進(jìn)行反應(yīng)。（要達(dá)到高效率的連接，必須酶切完全，酶切的 DNA 數(shù)量要適當(dāng)。另外，酶切反應(yīng)的規(guī)模 也取決于需要酶切的 DNA 的量，以及相應(yīng)的所需酶的量。可以適當(dāng)增加酶的用量，但是最 高不能超過反應(yīng)總體積的 10% ，因?yàn)橄拗菩院怂醿?nèi)切酶一般是保存在 50% 甘油的緩沖液中， 如果酶切反應(yīng)體系中甘油的含量超過5% ，就會抑制酶的活性。 ）連接反應(yīng)總是緊跟酶切反應(yīng)， 外源 DNA 片段與載體分子連接的方法即 DNA 分子體外重組技 術(shù)主要依賴限制性核算內(nèi)切酶和 DNA 連接酶催化完成的

5、。 DNA 連接酶催化兩雙鏈 DNA 片 段相鄰的 5 -磷酸和 3 -OH 間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的 DNA 連接酶是來 自 T4 噬菌體的 T4 DNA 連接酶，它可以連接黏性末端和平末端。連接反應(yīng)時(shí)，載體 DNA 和外源 DNA 的摩爾數(shù)之比控制在 1:（13）之間， 可以有效地解決 DNA 多拷貝插入的現(xiàn)象。 反應(yīng)溫度介于酶作用速率和末端結(jié)合速率之間，一般是16，用常用的連接時(shí)間為 12-16h 。感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 構(gòu)建好的重組 DNA 轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的現(xiàn)象就是轉(zhuǎn)化。能進(jìn)行轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞必 須是感受態(tài)細(xì)胞，即受體細(xì)胞最容易接受外源 DNA 片段實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化

6、的生理狀態(tài)，它決定于受 體菌的遺傳特性，同時(shí)與菌齡、外界環(huán)境等因素有關(guān)。人工轉(zhuǎn)化是通過人為誘導(dǎo)的方法使細(xì) 胞具有攝取 DNA 的能力，或人為地將 DNA 導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)， 該過程與細(xì)菌自身的遺傳控制無關(guān)，常用熱擊法，電穿孔法等。能否實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒 DNA 的轉(zhuǎn)化還與受體細(xì)胞的遺傳特性有關(guān)，所用 的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)的缺陷變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。 目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有 CaCl2 法，制備好的感受態(tài)細(xì)胞可以加入終濃度為 15% 的無菌甘油， -70可保存半年至一年。經(jīng)過CaCl2 處理的細(xì)胞細(xì)胞膜通透性增加，允許外源 DNA 分子進(jìn)入。 在低溫下， 將攜帶有外源 D

7、NA 片段的載體與感受態(tài)細(xì)胞混合， 經(jīng)過熱擊 或電穿孔技術(shù)，使載體分子進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入受體細(xì)胞的外源 DNA 分子通過復(fù)制、表達(dá)，使 受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將這些轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，即可篩選出重組 子。本實(shí)驗(yàn)以 E.coli DH 5菌株為受體細(xì)胞，用 CaCl2 處理，使其處于感受態(tài)，然后將重 組后的 PUC19 質(zhì)粒在 42下熱擊 90s，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。重組子的篩選鑒定重組 DNA 轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后， 并非所有的受體細(xì)胞都能被導(dǎo)入重組 DNA 分子， 一般僅有少數(shù) 重組 DNA 分子能進(jìn)入受體細(xì)胞， 同時(shí)也只有極少數(shù)的受體細(xì)胞在吸納重組 DNA 分子之后能 良好增殖。并且它們是與

8、其他大量未被轉(zhuǎn)化的受體菌細(xì)胞混雜在一起。再者，在這些被轉(zhuǎn)化 的受體細(xì)胞中，除部分含有我們所期待的重組 DNA 分子外，另外一些還可能是由于載體自 身或一個(gè)載體與多個(gè)外源 DNA 片段形成非期待重組 DNA 分子導(dǎo)入所致。 因此必須使用各種 篩選及鑒定手段區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子， 并從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群體中分理出帶有目的基因的重組 子。本實(shí)驗(yàn)中采用的方法是平板篩選法電泳篩選法及 PCR 檢測方法。 抗藥性篩選主要用于重組質(zhì)粒 DNA 分子的轉(zhuǎn)化子的篩選， 而不含重組質(zhì)粒 DNA 分子的受體 菌則不能存活， 互補(bǔ)篩選法是根據(jù)菌落顏色篩選含有充足質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。質(zhì)粒 PUC19 攜 帶有氨芐青霉素抗性基因（

9、Ampr ）,在含有氨芐青霉素平板上篩選轉(zhuǎn)化子。沒有導(dǎo)入質(zhì)粒 PUC19 的受體細(xì)胞， 在含有氨芐青霉素的平板上不生長。 質(zhì)粒 PUC19 進(jìn)入 E.coli DH 5后， 通過 -互補(bǔ)作用，形成完整的 -半乳糖苷酶。在麥康凱培養(yǎng)基平板上，轉(zhuǎn)化子利用-半乳糖苷酶分解培養(yǎng)基中的乳糖產(chǎn)生有機(jī)酸， pH 降低，培養(yǎng)集中的指示劑變紅，轉(zhuǎn)化子的菌落 變紅。不含質(zhì)粒的 E.coli DH 5 ，沒有 -半乳糖苷酶活性，不能利用培養(yǎng)集中的乳糖產(chǎn)生 有機(jī)酸，而是利用培養(yǎng)集中的有機(jī)碳源，不使培養(yǎng)基 pH 降低，在不含有氨芐青霉素的麥康 凱培養(yǎng)基上形成白色菌落。 重組后的載體 DNA 因?yàn)槟康幕虻牟迦胛稽c(diǎn)在 P

10、UC19 乳糖利用 基因內(nèi)部， 不能形成 -互補(bǔ)作用， 所以也不能利用培養(yǎng)集中的乳糖產(chǎn)生有機(jī)酸， 在含有氨芐 青霉素的麥康凱培養(yǎng)基上形成白色菌落。挑選在氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長的白色菌落， 通過擴(kuò)增培養(yǎng)。 因?yàn)樵S多菌落存在假陽性情況， 在氨芐青霉素培養(yǎng)基上的白色菌落可能是導(dǎo)入的重組載體 DNA 菌落，也可能是載體自連后 發(fā)生突變的菌落，所以還要鑒定轉(zhuǎn)化子中重組質(zhì)粒 DNA 分子的大小，可將重組的載體 DNA 提取出來，進(jìn)行后續(xù)的酶切、電泳檢驗(yàn)。也以提取的重組質(zhì)粒為模板，利用現(xiàn)有的引物，進(jìn)行那個(gè) PCR 擴(kuò)增，檢測個(gè)噢偶見的質(zhì)粒 是否是所期望的重組質(zhì)粒。PCR 技術(shù)PCR （ Polymerase

11、 chain reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其原理類似于DNA 的體內(nèi)復(fù)制，又叫做“體外基因擴(kuò)增” 。反應(yīng)體系包括：模板 DNA 、寡核苷酸引物、 Mg2+ ，4 種脫氧核糖核 酸（dNTP ）、DNA 聚合酶和合適的緩沖體系。反應(yīng)基本程序包括DNA 變性、引物復(fù)性及引物延伸三個(gè)基本過程。這三個(gè)反應(yīng)構(gòu)成一個(gè)循環(huán)，反復(fù)進(jìn)行。每一輪循環(huán)擴(kuò)增的產(chǎn)物可作為 下一輪擴(kuò)增反應(yīng)的模板。 理論上每一輪循環(huán)可使 DNA 數(shù)量增加一倍， 反復(fù) 30 次，特異 DNA 序列片段以指數(shù)方式可擴(kuò)增 105106。通過此技術(shù)可以使非常微量的DNA 產(chǎn)生大量的 PCR產(chǎn)物，因此這個(gè)技術(shù)是一項(xiàng)在體外大量生產(chǎn)目的基因的技

12、術(shù)。 現(xiàn)在普遍通用的是一種從水生嗜熱桿菌中提取的 Taq DNA 聚合酶，而且大大提高了擴(kuò)增片 段的特異性、 靈敏性和擴(kuò)增效率。 反應(yīng)中用的引物有兩段， 一條稱為上游引物或者正向引物，一條稱為下游引物或者反向引物。引物的設(shè)計(jì)十分重要，在設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)遵循以下原則：長度一 般為 18 到 24 個(gè)堿基； G+C 的百分含量在 40%60% ；單條引物內(nèi)部避免含有二級結(jié)構(gòu)，避 免形成引物二聚體；最好以 1到 2個(gè) G 或 C 堿基開始或結(jié)束；引物的 5端可以被修飾，但 是 3 端絕對不能進(jìn)行任何修飾，而且引物的3端要避開密碼子的第三位。模板的濃度不能太大， dNTP 的濃度為 2.5mmol/L ，金屬

13、離子的濃度為 1.5mmol/L ，緩沖液為 pH 為 7.28.0 的 Tris HCl 溶液。實(shí)驗(yàn)材料：菌株： E.coli DH 5 培養(yǎng)基： LB 培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基（加入氨芐青霉素）試劑材料：酶切反應(yīng)：（DNA PUC19 質(zhì)粒，酶切 10buffer ， Hind ,重蒸水， DNA。） 連接反應(yīng)：（酶切后的 DNA PUC19 質(zhì)粒和 DNA ，連接 10 buffer ，T4 連接酶，重蒸水。） 感受態(tài)細(xì)胞的制備： （0.1M CaCl2 ） 轉(zhuǎn)化：（連接液和感受態(tài)細(xì)胞， 0.1M CaCl2 ，冰塊。） 重組菌的挑選、檢驗(yàn)：試劑盒（含有 Rnase A 的溶液，溶液，溶液，

14、 HB buffer,DNA washing buffer ， elution buffer ） ,酶切后的 DNA PUC19 質(zhì)粒，試劑盒抽提的 DNA ，酶切 10buffer ，Hind ,重蒸水，瓊脂糖， TAE 緩沖液。上樣緩沖液， EB 染液。PCR 檢測 ： 10PCR buffer,dNTP, 模板，引物 1，引物 2，水， Taq DNA 聚合酶，瓊脂糖， TAE 、溴化乙錠（ EB）4. 儀器器材：20、 200、 1000ul 的槍和槍尖， 1.5 ml 的 Ep 管，恒溫培養(yǎng)箱，水浴鍋，平板，三角瓶，試 管，接種環(huán)，牙簽，酒精燈，火柴，冰箱，離心機(jī)，電泳槽，紫外儀，

15、PCR 擴(kuò)增儀 試驗(yàn)流程 載體與外源片段的酶切連接感受態(tài)細(xì)胞的制備質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與重組子的篩選重組子的 挑取與復(fù)證重組質(zhì)粒的提取與電泳檢測 PCR 檢測注意事項(xiàng)： 本實(shí)驗(yàn)屬于微量操作， 用量極少的步驟必須嚴(yán)格注意吸取量的準(zhǔn)確性并確保樣品全部加入反 應(yīng)體系中。實(shí)驗(yàn)中所用塑料器材都必須是新的，并且經(jīng)過高溫滅菌，操作時(shí)打開使用，操作過程中要注 意環(huán)境干凈，戴手套操作，盡量減少走動(dòng)，縮短 Ep 管開蓋的時(shí)間。 不論是酶切還是連接反應(yīng)，加樣的順序應(yīng)該是，先加重蒸水，其次是緩沖液和 DNA ，最后 加酶。且前幾步要把樣品加到管底的側(cè)壁上，加完后用力將其甩到管底，而酶液要在加入前從 -20的冰箱取出， 酶管放置冰

16、上， 取酶液時(shí)吸頭應(yīng)從表面吸取， 防止由于插入過深而使吸 頭外壁沾染過多的酶液。取出的酶液應(yīng)立即加入反應(yīng)混合液的液面以下，并充分混勻。Ep 管的蓋子應(yīng)蓋緊，防止水浴過程中水汽進(jìn)入管內(nèi)，并做好標(biāo)記以防樣品混淆。 轉(zhuǎn)化過程要防止雜菌和其他 DNA 的污染，整個(gè)操作過程應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。 電泳時(shí)使用的緩沖液最好是現(xiàn)配現(xiàn)用，以免影響電泳效果。 制備凝膠時(shí)，應(yīng)避免瓊脂糖溶液在微波爐里加熱時(shí)間過長，否則溶液將會暴沸蒸發(fā)，影響瓊 脂糖濃度。制膠時(shí)要除去氣泡。拔梳子時(shí)要特別小心，以防凝膠與支持物脫離。 上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞康哪z刺穿。也不要快速擠出吸頭內(nèi)的樣品，避免擠出的空氣將樣品沖

17、出樣品孔。 溴化乙錠是一種強(qiáng)烈的誘變劑，有毒性，使用含有這種染料的溶液時(shí)，應(yīng)帶上乳膠手套進(jìn)行 操作。勿將溶液滴灑在臺面上，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用水徹底沖洗干凈。紫外線對眼睛和皮膚均有傷害， 對眼睛尤甚。 觀察電泳條帶時(shí)要確保紫外光源得到適當(dāng)遮蔽， 并應(yīng)戴好目鏡或眼罩，避免皮膚直接暴露在紫外線下。實(shí)驗(yàn)中加樣后應(yīng)及時(shí)更換吸頭，以避免試劑的污染。PCR 反應(yīng)高度靈敏，應(yīng)設(shè)法避免污染，如戴一次性手套操作，使用一次性 PCR 管和吸頭， 反應(yīng)加樣區(qū)應(yīng)與 DNA 模板制備區(qū)及 PCR 產(chǎn)物電泳檢測區(qū)分開。PCR 管單加樣時(shí)，對于非常微量的樣品一定將樣品加在管壁上或者液體中，防止漏樣。 實(shí)際操作時(shí)，為了防止少加樣，可

18、以保存每次用過的槍尖，通過數(shù)槍尖知道自己加到哪一步 了。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析1、酶切電泳圖的結(jié)果及分析1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1817,18 泳 道分別是標(biāo) 準(zhǔn) DNA 酶 切和自己的 DNA 酶切后的產(chǎn)物的條帶。 15 泳道為 marker ，16 泳道是未酶切的 DNA 的條帶。 12， 13,14 泳道分別是 pUC19 和商品 pUC19 酶切。1泳道為我們的樣品，是經(jīng)酶切過的 DNA PUC19 質(zhì)粒，從圖中可以看出只有有一條主帶， 這條是被 Hind III 切開的線性 DNA PUC19 質(zhì)粒，與 DNA marker 比較查

19、資料可知分子量為 2322，且可根據(jù)亮度看出含量不是很高。但是可以判斷出我們組的載體質(zhì)粒PUC19 酶切很徹底。其他組的條帶有些下面還有一條很淺的帶是超螺旋DNA PUC19 質(zhì)粒，即沒有被切開的質(zhì)粒，分子量為 2027。2 重組子篩選結(jié)果 轉(zhuǎn)化后， 10 個(gè)平板的菌落狀況：順序平板現(xiàn)象解釋（感受態(tài)細(xì)胞）50ul麥?zhǔn)?Ap-培養(yǎng)基呈橙紅色，菌落 布滿平板呈白色，無單 菌落DN5 是氨芐 敏感 型 ，不 能在AP+的平板上生長（感受態(tài)細(xì)胞）50ul麥?zhǔn)螦P+培養(yǎng)基呈紅色，無菌落生長（感受態(tài)細(xì)胞+puc19）50ul麥?zhǔn)螦P+生長了較多的單菌落，菌落呈現(xiàn)紫紅色Puc19 是氨芐抗性，導(dǎo)入受體細(xì) 胞

20、，與受體 DH5 發(fā)生 互補(bǔ)作 用分解乳酸，培養(yǎng)基 PH 下降， 指示劑變紅，轉(zhuǎn)化子菌落變紅（感受態(tài)細(xì)胞 + 連 接 DNA ） 50ul麥?zhǔn)螦P+既有白色單菌落又有紅 色單菌落。接種的體積 越多，但菌落數(shù)量越多。部分轉(zhuǎn)化子導(dǎo)入的是發(fā)生自連的 完整的 puc19 質(zhì)?？砂l(fā)生 互補(bǔ) 100ul麥?zhǔn)螦P+作用使菌落變紅，部分轉(zhuǎn)化子導(dǎo) 入了重組質(zhì)粒（即重組子） ，載體 多克隆位點(diǎn)插入外源片段后不能 利用乳糖而是利用其他營養(yǎng)物質(zhì) 使菌落呈現(xiàn)白色。 150ul麥?zhǔn)螦P+ 200ul麥?zhǔn)螦P+3 重組質(zhì)粒電泳結(jié)果 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Re-pUC19 電泳

21、檢測：（ L1-2 ： lamda/HIII ，L3-14:1-6 組樣品各 2 個(gè)； L15 ：空載體） 13,14泳道為本組重組質(zhì)粒電泳結(jié)果。 根據(jù)每條帶的亮度可以看出 DNA 片段的含量。 與 DNA marker 對比帶的位置可以比較 DNA 片段的大小。與 15 泳道的空載體對照可以看出， 我們篩選到的重組質(zhì)粒中插入了外源 DNA 片段。 重組質(zhì) 粒中分別插入了較小的基因片段 （14）和較大的基因片段 （13），對照 DNA marker lamda/HIII ， 我們推測載體 pUC19 中插入的片段可能分別是 125bp 和 6557bp 大小的片段。 結(jié)果還有待于 進(jìn)一步酶切驗(yàn)

22、證和 PCR 檢測。4 酶切驗(yàn)證電泳結(jié)果 下圖分別是經(jīng)過試劑盒提取的插入大片段和小片段的重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證電泳圖。1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 121314Re-pUC19 的 酶 切鑒定大片段 （ 1-11: 各 組 樣 品 ； L12 ： lamda/HIII ； L13 ：pUC19/III ）大小分別為： 5000,3000,2000,1000,750,500,250,100 ）Re-pUC19 的酶切 鑒定小片段（ 1-12： 各 組 樣 品 ； 13： pUC19 ； 14 ： DL2000 plus ； 15-25 ：各組樣品） （ DL2000 plus 的第一張圖中 4 泳道是我們組插入大片段的重組質(zhì)粒酶切電泳條帶，第二張圖中的 7,8 泳 道分別是我們的插入小片段的重組質(zhì)粒的酶切前后的電泳條帶， 其中酶切前的電泳結(jié)果作為 對照。從圖中可以看出插入大片段的重組質(zhì)粒酶切后（ 4 號泳道），上面有緊鄰的兩條帶，與 DNA marker lamda/HIII 比較可知其分子量大小在 6557bp 左右，與上一步實(shí)驗(yàn)中的推測相符合。 因此可以判定此重組質(zhì)粒中插入了 6557bp 大小的 DNA 片段。理論上上方應(yīng)該只出現(xiàn)一條帶， 而我們的