以kdr為靶點(diǎn)的靶向超聲微泡對(duì)裸鼠乳腺癌新生血管分子靶

1、靶向超聲微泡對(duì)腫瘤新生血管分子顯像的研究 摘要 目的 探討以kdr為靶點(diǎn)的靶向超聲微泡對(duì)裸鼠結(jié)腸癌新生血管靶向顯像效果。方法 “生物素-親和素”橋接法將與vegf的主要受體kdr特異性結(jié)合的小肽k237與脂質(zhì)微泡偶聯(lián)構(gòu)建靶向微泡。以kdr陰性表達(dá)的人結(jié)腸癌ls174t細(xì)胞株建立人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型。裸鼠經(jīng)尾靜脈隨機(jī)注射靶向微泡、攜隨機(jī)序列對(duì)照肽的對(duì)照微泡，5min后行超聲造影檢查，觀察各組微泡在腫瘤組織造影增強(qiáng)情況，測量腫瘤組織的聲強(qiáng)度（vi）。另取6只裸鼠預(yù)先注射k237肽后再注射靶向微泡，觀察微泡的顯像效果。免疫組化技術(shù)檢測kdr在腫瘤組織表達(dá)及分布規(guī)律。結(jié)果 成功制備了靶向微泡。注射超

2、聲微泡5min顯示靶向微泡組腫瘤組織顯像明顯增強(qiáng)，vi值與對(duì)照微泡組（vi）及封閉組(vi)比較均有顯著差異（p0.05）；免疫組化顯示，裸鼠結(jié)腸癌新生血管內(nèi)皮細(xì)胞kdr表達(dá)較正常組織內(nèi)皮細(xì)胞kdr表達(dá)顯著增加。結(jié)論 以kdr為靶點(diǎn)的靶向超聲微泡可以與腫瘤新生血管內(nèi)皮特異性粘附并有效評(píng)價(jià)腫瘤新生血管形成。關(guān)鍵詞 靶向微泡；超聲造影；結(jié)腸癌；kdrmolecular imaging of tumor angiogenesis with targeted microbubbles 【abstract】 objective to evaluate effect of tumor neo-vascul

3、arization imaging in nude mice model of colon cancer by contrast ultrasound molecular imaging (umi) of kdr expression.methods a targeted microbubble（mbp）was builded by conjugding the small peptide k237 which has a high degree afffinity of kdr to liposome microbubbles through the bridging of biotin-a

4、vidin. a xenografted model of ls174t human colon cancer in nude mice was established.twelve mice were injected intravenous of mbp and control microbubbles （mbc）in random order. mbp were injected in another six mice after k237-peptide blockage.after 5 minutes of intravenous injection of microbubble,

5、ultrasound imaging was performed in all mice to observe the imaging difference and measure the vi (video intensity) of tumor tissues in different mb groups.immunohistochemistry was applied to detect the expression and distribution of kdr in breast tumor tissue and adjacent tumor tissues.results k237

6、 peptide can be successfully conjugated to the surface of microbubbles through biotin-avidin mediation.ultrasound imaging signal was significantly high in mbp group. and the vi of tumor tissues in mbp group showed remarkable difference compared to that in mbc group and k237-peptide blockage group (p

7、0.05).immunohistochemistry showed kdr was highly expressed in tumor tissue and there was no significant expression of kdr in tissue surrounding tumor.conclusion kdr-targeted liposome contrast agent could specifically and efficiently combine with tumor vascular endothelial cells in vivo .it is a good

8、 method to assess tumor angiogenesis. 【key words】targeted microbubbles；contrast-enhanced ultrasound；colon cancer；kdr實(shí)體瘤的生長和轉(zhuǎn)移是血管依賴性的，以新生血管相關(guān)分子為靶點(diǎn)進(jìn)行分子靶向超聲顯像以了解腫瘤血管生成狀態(tài)，對(duì)評(píng)估預(yù)后、預(yù)測轉(zhuǎn)移潛能、指導(dǎo)抗血管生成治療及療效監(jiān)測有著重要意義。作為最重要的血管生長因子vegf的主要受體,介導(dǎo)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、血管通透性增加等血管生成活性，在腫瘤血管生成過程尤其是早期階段起著關(guān)鍵作用1-2。高表達(dá)于多數(shù)腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，而在正常組

9、織血管內(nèi)皮細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，提示kdr可能成為多數(shù)實(shí)體瘤新生血管特異性分子顯像的靶標(biāo)3-4。我們前期以生物素-親和素橋接法將從噬菌體肽庫中篩選到的與kdr有高親和活性的12肽k237與脂質(zhì)體微泡偶連，構(gòu)建了靶向微泡，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)靶向微泡具有與靶細(xì)胞結(jié)合的高度特異性3。為進(jìn)一步證實(shí)靶向微泡體內(nèi)腫瘤新生血管靶向特異性，我們選擇kdr陰性表達(dá)的人結(jié)腸癌ls174t細(xì)胞株【6-7】建立人結(jié)腸癌ls174t裸鼠移植瘤模型，探討以腫瘤新生血管內(nèi)皮為靶點(diǎn)進(jìn)行靶向超聲顯像的可行性。材料與方法一、實(shí)驗(yàn)材料與儀器1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 18只免疫缺陷型雌性小鼠，6-8周齡，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于spf級(jí)

10、環(huán)境；人結(jié)腸癌細(xì)胞株ls174t，南方醫(yī)院病理科實(shí)驗(yàn)室保存。2主要試劑 生物素化十二肽k237（杭州中肽公司）、二棕櫚酰磷脂酰膽堿膽（dppc，sigma，美國）、聚乙二醇（peg，sigma，美國）、生物素化脂質(zhì)體（dspe-peg-biotin，sigma，美國）、親和素（avidin，美國）、抗kdr抗體工作液（博士德）、新生小牛血清、0.25%胰蛋白酶、rimp1640培養(yǎng)液。3實(shí)驗(yàn)儀器 熒光顯微鏡（nikon eclipe ti-s，japan）， sequoia512超聲診斷儀(siemens，germany)二、實(shí)驗(yàn)方法1超聲微泡的制備將dppc、peg、dspepegbioti

11、n交聯(lián)物等按比例溶于蒸餾水，導(dǎo)入全氟丙烷氣體，機(jī)械振蕩處理，靜置分層，棄下清液，純化微泡3次，制備得到生物素化脂質(zhì)微泡。參照文獻(xiàn)【8】合成與kdr 有高親和活性的氨基酸序列為“htmyyhhyqhhl”的生物素化12肽k237及合成隨機(jī)序列的對(duì)照肽（杭州中肽公司合成）。生物素化脂質(zhì)微泡按比例加入鏈親和素，純化洗滌后再分別加入生物素化12肽或?qū)φ针?，制備出靶向微?mbp)和對(duì)照微泡(mbc)。按照我們之前建立的方法進(jìn)行靶向微泡體外靶向性能鑒定【5,9】。2動(dòng)物模型的建立 人結(jié)腸癌細(xì)胞株ls174t無菌培養(yǎng)于含10%新生牛血清的rimp1640培養(yǎng)基中，37、5%co2條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集

12、處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞制成濃度為2.0x107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。6-8周齡雌性裸鼠18只，接種ls174t細(xì)胞，每鼠無菌條件下局部消毒，于裸鼠皮下第三對(duì)乳腺脂肪墊處緩慢注射0.2ml的瘤細(xì)胞懸液，見局部形成隆丘后退針，定期觀察腫瘤生長情況。3超聲造影檢查瘤細(xì)胞接種10天行腫瘤超聲造影檢查。隨機(jī)選取12只裸鼠以4%的戊巴比妥鈉0.2ml腹腔麻醉，麻醉后裸鼠仰臥位固定于自制平臺(tái)上，將探頭放于支架上并調(diào)整探頭使腫瘤能夠良好顯像后，固定探頭，保證實(shí)驗(yàn)過程中探頭位置不變。所有裸鼠經(jīng)尾靜脈分別隨機(jī)注射2.0x108個(gè)/ml靶向微泡、對(duì)照微泡（各組微泡注射間隔30min【10】）。探頭發(fā)射頻率為10.0mh

13、z，機(jī)械指數(shù)（mechanical index, mi）為0.14，實(shí)驗(yàn)過程中各項(xiàng)參數(shù)保持不變。注入微泡5min后獲取腫瘤聲學(xué)造影第一幀圖像，此后，以高mi連續(xù)超聲發(fā)射23s破壞微泡后，繼續(xù)存儲(chǔ)圖像3-4幀。取剩余6只瘤鼠，以0.2mlk237小肽（1mg/ml）預(yù)先注射30min封閉kdr結(jié)合位點(diǎn)后再注射2.0x108/ml靶向微泡0.2ml，造影方法及圖像處理同前。4超聲造影圖像分析應(yīng)用mce軟件對(duì)超聲圖像進(jìn)行分析，測量實(shí)驗(yàn)裸鼠腫瘤顯造影圖像的聲強(qiáng)度（video intensity, vi），其中第一幀圖像的聲強(qiáng)度值代表微泡在組織及循環(huán)中的總濃度，包括腫瘤組織的粘附和體內(nèi)血液循環(huán)的微泡，高

14、機(jī)械指數(shù)超聲波破壞后的聲強(qiáng)度值為血液循環(huán)中的微泡濃度，前者減去后者即得到粘附在腫瘤組織中的微泡濃度。采用彩色編碼技術(shù)制作腫瘤組織彩色編碼圖像。5免疫組化檢查完成實(shí)驗(yàn)后處死裸鼠，所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，免疫組化檢測腫瘤組織及距腫瘤2cm處正常組織內(nèi)kdr表達(dá)及分布規(guī)律（sp法）。結(jié)果判定以胞漿或胞膜有明確棕黃色著色為陽性。6統(tǒng)計(jì)分析采用spss13.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以 x s表示。靶向微泡組、對(duì)照微泡組、小肽預(yù)先封閉組在腫瘤組織的vi值比較采用one-way anova，組間多重比較采用lsd檢驗(yàn)。p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié) 果1超聲微泡理化性質(zhì)制備得

15、到的靶向微泡(mbp)和對(duì)照微泡(mbc)光鏡觀察分布均勻，無聚集現(xiàn)象，單個(gè)微泡外觀圓整。庫爾特計(jì)數(shù)儀測得mbp濃度約為(5.171.0)x108個(gè)/ml，粒徑為（2.010.93）m，mbc濃度約為（5.371.07）x108個(gè)/ml，粒徑為（2.101.03）m。2動(dòng)物模型情況注射腫瘤細(xì)胞10d左右，18只裸鼠均于注射部位形成肉眼可見的實(shí)體瘤，瘤體直徑3-6mm，平均直徑4.5mm。3超聲造影檢查彩色編碼及vi值分析 彩色編碼圖像顯示，注入微泡5min后可見mbp在腫瘤組織邊緣及由邊緣向內(nèi)部延伸的顯著超聲造影增強(qiáng)，而mbc在腫瘤組織僅見輕度超聲顯影，k237小肽封閉后再注入mbp 5min

16、在腫瘤組織僅見輕度超聲顯影。注入微泡5min后mbp在腫瘤組織的vi值明顯增高，而mbc在腫瘤組織的vi值未見明顯增高，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；經(jīng)小肽預(yù)先封閉后，mbp在腫瘤組織的vi值明顯降低，與未封閉組有顯著差異（p0.05）。裸鼠腫瘤組織內(nèi)彩色編碼圖見圖1，聲強(qiáng)度值見表1。 圖1 裸鼠結(jié)腸癌移植瘤模型超聲造影彩色編碼圖，a為注入微泡5min后，靶向微泡在腫瘤組織造影圖像，為不均勻增強(qiáng)，以腫瘤周邊為著；b為注入微泡5min后，對(duì)照微泡在腫瘤組織見輕度造影增強(qiáng)；c為小肽預(yù)先封閉后，注入靶向微泡5min后在腫瘤組織見輕度造影增強(qiáng)。 表1 裸鼠腫瘤超聲造影檢查聲強(qiáng)度值分組 n meanstd.er

17、rormbp1832.6811.28mbc188.284.74*block+ mbp69.233.44*f33.120p0.00*與mbp組比較 p 0.054免疫組化結(jié)果同一腫瘤組織免疫組化結(jié)果顯示，腫瘤組織邊緣見大量新生血管，新生血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿及胞膜呈棕色著色，可見kdr顯著陽性表達(dá)，距腫瘤組織2cm處的正常組織內(nèi)新生血管少，kdr呈陰性或弱陽性表達(dá)。見圖2ab 圖2a ls174t結(jié)腸癌腫瘤組織邊緣見大量新生血管，新生血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿及胞膜呈棕色著色，kdr呈陽性表達(dá)；圖2b為距l(xiāng)s174t結(jié)腸癌腫瘤組織2cm處正常組織內(nèi)新生血管少，kdr呈陰性或弱陽性表達(dá)。討 論血管新生是指從微血管

18、床上芽生新生毛細(xì)血管為主的血管系統(tǒng)的過程，在腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中血管新生起著關(guān)鍵性的作用【11-12】。研究證實(shí)腫瘤內(nèi)mvd及vegf and/or vegfr2的表達(dá)與乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等惡性腫瘤預(yù)后不良密切相關(guān)，是評(píng)價(jià)上述多種腫瘤預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)【13-14】。目前主要是通過檢測組織學(xué)上微血管密度（mvd）、相關(guān)血管生長因子以及受體的表達(dá)來評(píng)價(jià)腫瘤新生血管，但是鑒于不同研究中采用的微血管標(biāo)記抗體及計(jì)數(shù)方法不同,使mvd檢測的臨床病理意義缺乏可比性。加之腫瘤血管分布不均 ,呈明顯異質(zhì)性,這就增加了尋找 mvd“熱點(diǎn)”區(qū)域的困難。此外上述指標(biāo)的都是基于穿刺活檢或術(shù)后獲取標(biāo)本的檢測，

19、因此探索一種能夠無創(chuàng)性客觀、準(zhǔn)確評(píng)估腫瘤血管生成狀態(tài)而又方便實(shí)用的手段對(duì)于術(shù)前腫瘤治療方案的選擇，預(yù)后評(píng)價(jià)有著重要意義。運(yùn)用靶向超聲分子顯像技術(shù)評(píng)價(jià)腫瘤血管生成已日益成為國內(nèi)外超聲領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)并取得初步成果。之前應(yīng)用較多的腫瘤新生血管分子顯像的靶目標(biāo)是整合素v3，v3在新生腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞及部分高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞呈高表達(dá)，在成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞幾乎不表達(dá)，主要在腫瘤侵襲性生長的邊緣富集【15-16】。有學(xué)者將與整合素v3結(jié)合的含rgd識(shí)別序列的肽類配體或抗體與超聲微泡連接，在小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤型中實(shí)現(xiàn)了靶向顯影。leong-poi【17】等構(gòu)建了攜帶抗integrin v單抗（mabs agains

20、t the integrin v chain，integrin v）的靶向超聲微泡，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該靶向微泡與基質(zhì)膠新生血管的結(jié)合率明顯高于正常血管內(nèi)皮細(xì)胞，并可有效評(píng)價(jià)老鼠基質(zhì)膠的血管新生；ellegala【18】等構(gòu)建攜echistatin的靶向微泡證實(shí)該靶向微泡可以有效評(píng)價(jià)大鼠惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型的新生血管形成。由于抗v3單抗、echistatin以及含rgd識(shí)別序列的肽類配體除能與v3結(jié)合外，還可與整合素家族的其它分子結(jié)合，因此顯像特異性欠佳。研究表明：同樣作為腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性靶點(diǎn)，kdr可能更適合于早期微小腫瘤血管的靶標(biāo)顯影【19-20】。willmann21等構(gòu)建攜抗vegf2單

21、抗的靶向超聲微泡評(píng)價(jià)小鼠血管肉瘤新生血管，結(jié)果表明可使腫瘤顯影強(qiáng)度明顯增強(qiáng)并可用于抗腫瘤血管生成治療療效監(jiān)測。我們選取kdr陰性表達(dá)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株ls174t建立裸鼠皮下移植瘤模型，生物素-親和素橋接法構(gòu)建攜與kdr有高親和活性小肽k237的靶向微泡，裸鼠結(jié)腸癌移植瘤模型成功實(shí)現(xiàn)了腫瘤靶向顯像。靜脈注射微泡5分鐘后靶向微泡在腫瘤組織可見顯著的超聲顯像增強(qiáng)，而注射對(duì)照微泡及k237小肽預(yù)先封閉后再注射靶向微泡5分鐘后腫瘤組織僅見輕度超聲造影增強(qiáng)，靶向微泡組腫瘤聲強(qiáng)度（vi值）與對(duì)照微泡組及預(yù)先封閉組比較有顯著性差異，免疫組化檢測提示ls174t結(jié)腸癌新生血管內(nèi)皮細(xì)胞呈kdr高表達(dá)，同時(shí)ls17

22、4t結(jié)腸癌細(xì)胞本身呈kdr陰性表達(dá)，提示腫瘤靶向顯像效果是通過小肽與癌組織內(nèi)新生血管內(nèi)皮特異性地結(jié)合而促使靶向微泡粘附于腫瘤血管床內(nèi)實(shí)現(xiàn)的。小肽預(yù)先封閉實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)靶向微泡與靶點(diǎn)特異性結(jié)合具有可飽和性，從另一方面提示靶向微泡制備的步驟中，必須注意洗脫游離的小肽以純化微泡，否則游離的小肽將會(huì)與靶向微泡外殼上連接的小肽競爭結(jié)合靶器官的相應(yīng)靶點(diǎn)，從而降低靶向超聲微泡在靶器官的黏附，導(dǎo)致靶向超聲分子成像敏感性下降。我們研究過程中發(fā)現(xiàn)，同類腫瘤不同個(gè)體或同一腫瘤不同區(qū)域，都存在靶向超聲造影效果的差異，實(shí)際上是腫瘤血管異質(zhì)性的表現(xiàn)。腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤血管異質(zhì)性不僅表現(xiàn)為腫瘤新生血管與非腫瘤血管的差

23、異，還包括腫瘤演進(jìn)階段及不同腫瘤之間、同種腫瘤不同個(gè)體之間，同一腫瘤不同區(qū)域之間的血管異質(zhì)性22-23。新近的研究24表明靶向超聲微泡可有效評(píng)價(jià)不同腫瘤發(fā)生與演進(jìn)的不同階段新生血管分子標(biāo)記物表達(dá)水平的差異，不僅有潛力用于腫瘤預(yù)后評(píng)價(jià)，更對(duì)腫瘤的早期診斷及療效監(jiān)測有著重要價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)采用小肽作為與靶點(diǎn)連接的配體分子，與大分子抗體相比，以小分子肽作導(dǎo)向分子能明顯降低免疫反應(yīng)，且對(duì)受體的親和性比抗體和抗體片段高，易于合成和修飾，能很快從血液中清除，具有分子質(zhì)量小,制備簡單、經(jīng)濟(jì),抗原性弱,性能穩(wěn)定，毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)【25-26】,在腫瘤分子影像領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。參 考 文 獻(xiàn)1 yakes f

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