流式細(xì)胞技術(shù)及其應(yīng)用

1、流式細(xì)胞技術(shù)及其在科研中的應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)及其在科研中的應(yīng)用 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院檢驗科哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院檢驗科 劉彥虹劉彥虹課程內(nèi)容課程內(nèi)容n第一部分第一部分 概要概要n第二部分第二部分 儀器構(gòu)造及工作原理儀器構(gòu)造及工作原理n第三部分第三部分 技術(shù)及方法技術(shù)及方法n第四部分第四部分 應(yīng)用應(yīng)用1.1 基本概念基本概念=流式細(xì)胞技術(shù)（流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry, fcm） 是對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進行多是對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速定量分析和分選的技術(shù)。參數(shù)、快速定量分析和分選的技術(shù)。(熒光顯微鏡技術(shù)的改熒光顯微鏡技術(shù)的改良

2、良)=流式細(xì)胞儀（流式細(xì)胞儀（flow cytometor, fcm）是一項集激光技術(shù)、）是一項集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機技術(shù)以及細(xì)胞熒光電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機技術(shù)以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的檢測儀器?；瘜W(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的檢測儀器。 又稱又稱 (fluorecence activated cell sorter, facs) facsort facscalibur facsvantage 1.2 技術(shù)特點技術(shù)特點 n單細(xì)胞分析：任何單細(xì)胞懸液，如血液、骨髓、單細(xì)胞分析：任何單細(xì)胞懸液，如血液、骨髓、體液中的細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞，實體組織經(jīng)處

3、理后制體液中的細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞，實體組織經(jīng)處理后制成單細(xì)胞懸液。成單細(xì)胞懸液。n快速分析：極短時間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，只要標(biāo)快速分析：極短時間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，只要標(biāo)本中的細(xì)胞數(shù)量足夠，流式細(xì)胞儀可以每秒鐘數(shù)本中的細(xì)胞數(shù)量足夠，流式細(xì)胞儀可以每秒鐘數(shù)十、數(shù)百、數(shù)千個細(xì)胞的速率進行測量，測量的十、數(shù)百、數(shù)千個細(xì)胞的速率進行測量，測量的細(xì)胞總數(shù)可達數(shù)千、數(shù)萬乃至數(shù)百萬個。細(xì)胞總數(shù)可達數(shù)千、數(shù)萬乃至數(shù)百萬個。1.2 技術(shù)特點技術(shù)特點n多參數(shù)分析：可同時分析單個細(xì)胞的多種特征多參數(shù)分析：可同時分析單個細(xì)胞的多種特征, ,當(dāng)當(dāng)同時用多種分子探針同時用多種分子探針, ,如用不同熒光素標(biāo)記的不同如用不同熒光素標(biāo)

4、記的不同單克隆抗體進行多色熒光染色單克隆抗體進行多色熒光染色, ,通過流式細(xì)胞分析通過流式細(xì)胞分析, ,即可獲得單細(xì)胞的多種信息即可獲得單細(xì)胞的多種信息, ,使細(xì)胞亞群的識別、使細(xì)胞亞群的識別、計數(shù)等更為準(zhǔn)確。計數(shù)等更為準(zhǔn)確。n定性或定量分析：通過熒光染色對單細(xì)胞的某些定性或定量分析：通過熒光染色對單細(xì)胞的某些成分如成分如dnadna含量、抗原或受體表達量、含量、抗原或受體表達量、ca2+ca2+濃度等濃度等均可進行單細(xì)胞水平的定性與定量分析。均可進行單細(xì)胞水平的定性與定量分析。 第二部分第二部分 儀器構(gòu)造及工作原理儀器構(gòu)造及工作原理2.1 儀器構(gòu)造儀器構(gòu)造1. 流動室及液流流動室及液流驅(qū)動系

5、統(tǒng)驅(qū)動系統(tǒng)2. 激光光源及光激光光源及光束形成系統(tǒng)束形成系統(tǒng)3. 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)4. 信號檢測與存信號檢測與存貯、顯示、分貯、顯示、分析系統(tǒng)析系統(tǒng)5. 細(xì)胞分選系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)2.2 工作原理工作原理1. 流動室流動室n儀器核心部件，被測樣品在此與激光相交。儀器核心部件，被測樣品在此與激光相交。n流動室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開流動室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個孔徑為一個孔徑為430180um長方形孔，供細(xì)胞長方形孔，供細(xì)胞單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心。單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心。n流動室內(nèi)充滿鞘液，鞘液的作用是將樣品流環(huán)流動室內(nèi)充滿鞘液，鞘液的作用是將樣品流環(huán)包，使樣品

6、流不會脫離液流的軸線方向，并且包，使樣品流不會脫離液流的軸線方向，并且保證每個細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從保證每個細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息。而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息。液流驅(qū)動系統(tǒng)液流驅(qū)動系統(tǒng)將待測細(xì)胞或微粒進行熒光染色后制成懸液標(biāo)將待測細(xì)胞或微粒進行熒光染色后制成懸液標(biāo)本，在一定氣體壓力下將待測樣品壓入流動室，本，在一定氣體壓力下將待測樣品壓入流動室，用不含細(xì)胞或微粒的緩沖液（又稱鞘液）在高用不含細(xì)胞或微粒的緩沖液（又稱鞘液）在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測細(xì)壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測細(xì)胞或微粒流成一定角度，使鞘液包繞著細(xì)胞或胞或微粒流

7、成一定角度，使鞘液包繞著細(xì)胞或微粒高速流動，形成一個圓形的流速（即鞘微粒高速流動，形成一個圓形的流速（即鞘流），待測細(xì)胞在鞘液的包裹下單行排列，依流），待測細(xì)胞在鞘液的包裹下單行排列，依次通過流式細(xì)胞儀的檢測區(qū)域。次通過流式細(xì)胞儀的檢測區(qū)域。2.2 工作原理工作原理2.2 工作原理工作原理2. 激光光源激光光源 目前目前fcm大多采用氬離子氣體激光器，波長為大多采用氬離子氣體激光器，波長為488nm。激光是一種相干光源，它能提供單。激光是一種相干光源，它能提供單波長、高強度及穩(wěn)定性高的光照，是細(xì)胞微弱波長、高強度及穩(wěn)定性高的光照，是細(xì)胞微弱熒光快速分析的理想光源。用聚焦透鏡對激光熒光快速分析的

8、理想光源。用聚焦透鏡對激光光束聚焦后，可以在照射區(qū)得到一個近似扁平光束聚焦后，可以在照射區(qū)得到一個近似扁平的橢圓形光斑，其厚度可達的橢圓形光斑，其厚度可達20m。當(dāng)流動的。當(dāng)流動的細(xì)胞經(jīng)過光斑時才能被激光照射并產(chǎn)生光散射細(xì)胞經(jīng)過光斑時才能被激光照射并產(chǎn)生光散射和發(fā)射熒光。和發(fā)射熒光。 2.2 工作原理工作原理3. 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) fcm的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成，它們分別將不同波光片、小孔組成，它們分別將不同波長的熒光信號送入到不同的電子探測長的熒光信號送入到不同的電子探測器。器。2.2 工作原理工作原理4. 信號檢測信號檢測（1 1）散射光信號散

9、射光信號 前向角散射前向角散射(forward scatter, fsc ) (forward scatter, fsc ) 側(cè)向角散射側(cè)向角散射(side scatter, ssc)(side scatter, ssc)（2 2）熒光信號熒光信號前向角散射光（前向角散射光（fsc）激光器激光器激光器激光器激光探測器激光探測器大顆粒大顆粒小顆粒小顆粒側(cè)向角散射光（側(cè)向角散射光（ssc）激光器激光器側(cè)向散射光探測器側(cè)向散射光探測器流式細(xì)胞儀的檢測信號流式細(xì)胞儀的檢測信號熒光信號熒光信號fitcfitcfitcfitcfitcfitcfitcfitcfitcemitted fluorescence

10、 intensity binding sitesfitcfluorescent intensitynumber of events流式細(xì)胞儀的檢測信號流式細(xì)胞儀的檢測信號熒光信號熒光信號2.2 工作原理工作原理5. 數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析 fcm數(shù)據(jù)存貯的方式均采用列表排數(shù)據(jù)存貯的方式均采用列表排隊方式。隊方式。 數(shù)據(jù)的顯示通常有一維直方圖、二數(shù)據(jù)的顯示通常有一維直方圖、二維點圖等。維點圖等。二維散點圖二維散點圖2.3 細(xì)胞分選原理細(xì)胞分選原理 當(dāng)細(xì)胞懸液形成液流柱經(jīng)流動室，流動室上方的壓電當(dāng)細(xì)胞懸液形成液流柱經(jīng)流動室，流動室上方的壓電晶體產(chǎn)生機械晶體產(chǎn)生機械振動振動帶動

11、流動室以相同頻率進行振動，使帶動流動室以相同頻率進行振動，使液流注斷裂成一連串均勻的液流注斷裂成一連串均勻的液滴液滴，僅少量液滴含有細(xì)胞，僅少量液滴含有細(xì)胞，有大量不含細(xì)胞的空白液滴。當(dāng)實驗設(shè)計中設(shè)定了被分有大量不含細(xì)胞的空白液滴。當(dāng)實驗設(shè)計中設(shè)定了被分選的細(xì)胞的特性參數(shù)時，選的細(xì)胞的特性參數(shù)時， 此類細(xì)胞在形成液滴時會被此類細(xì)胞在形成液滴時會被充電充電，使其帶有正電荷或負(fù)電荷，未被設(shè)定分選參數(shù)的，使其帶有正電荷或負(fù)電荷，未被設(shè)定分選參數(shù)的細(xì)胞及空白液滴不帶電荷。帶電荷的液滴在落入電極偏細(xì)胞及空白液滴不帶電荷。帶電荷的液滴在落入電極偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場，依所帶電荷是正或是負(fù)而發(fā)生向右轉(zhuǎn)板的高壓靜

12、電場，依所帶電荷是正或是負(fù)而發(fā)生向右或向左的或向左的偏轉(zhuǎn)偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器中，完成細(xì)胞分選的，落入指定的收集器中，完成細(xì)胞分選的目的。目的。第三部分第三部分 技術(shù)要點技術(shù)要點3.1 熒光探針的選擇熒光探針的選擇常用熒光染料的特性常用熒光染料的特性熒光染料熒光染料 分子量分子量 激發(fā)波長激發(fā)波長(nm) 發(fā)射波長發(fā)射波長(nm) 顏色顏色 用途用途fitc 390 488 525 深藍深藍 免疫熒光免疫熒光pe 240000 488 575 橙色橙色 免疫熒光免疫熒光percp 35000 488 677 紅色紅色 免疫熒光免疫熒光pecy5 224000 488 670 紅色紅色 免疫熒光

13、免疫熒光pecy7 224000 488 755 深紅色深紅色 免疫熒光免疫熒光pi 488 620 橙紅色橙紅色 免疫熒光免疫熒光 apc 104000 633 670 紅色紅色 免疫熒光免疫熒光 異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，fitc） fitc是一種最為常見的熒光探針，其分子量為是一種最為常見的熒光探針，其分子量為389da，用，用488nm的激光激發(fā)后發(fā)射熒光的峰的激光激發(fā)后發(fā)射熒光的峰值在值在520nm附近，使用附近，使用53015 nm的帶通濾光的帶通濾光片可得到最佳的熒光檢測信號。片可得到最佳的熒光檢測信號。fl1探測器檢測探

14、測器檢測fitc。 藻紅蛋白藻紅蛋白 ( p-phycoerythrin,pe)pe是在紅藻中所發(fā)現(xiàn)的一種可進行光合作用的是在紅藻中所發(fā)現(xiàn)的一種可進行光合作用的自然熒光色素，分子量為自然熒光色素，分子量為240kd的蛋白，當(dāng)使的蛋白，當(dāng)使用用488 nm激光激發(fā)時其發(fā)射熒光峰值約為激光激發(fā)時其發(fā)射熒光峰值約為576 nm，對于單激光器的流式細(xì)胞儀來說，推薦使，對于單激光器的流式細(xì)胞儀來說，推薦使用用58521nm的帶通濾光片，雙激光器的流式的帶通濾光片，雙激光器的流式細(xì)胞儀推薦使用細(xì)胞儀推薦使用57513nm的帶通濾光片。的帶通濾光片。fl2探測器檢測探測器檢測pe。 多甲藻葉綠素蛋白多甲藻葉

15、綠素蛋白（peridinin chlorophyll protein，percp）percp是在甲藻和薄甲藻的光學(xué)合成器中發(fā)現(xiàn)的，是在甲藻和薄甲藻的光學(xué)合成器中發(fā)現(xiàn)的，是一種蛋白復(fù)合物，分子量約為是一種蛋白復(fù)合物，分子量約為35kd，當(dāng)被，當(dāng)被488nm氬離子激光激發(fā)后，發(fā)射光的峰值約為氬離子激光激發(fā)后，發(fā)射光的峰值約為677nm。fl3探測器檢測探測器檢測percp。3.1 熒光探針的選擇熒光探針的選擇 碘化丙啶碘化丙啶 （ propidium iodide，pi） 可選擇性地嵌入核酸（可選擇性地嵌入核酸（dna、rna）的雙）的雙螺旋堿基對中。在對螺旋堿基對中。在對dna染色時，需用染色時

16、，需用rnase對細(xì)胞進行處理，以排除對細(xì)胞進行處理，以排除rna對對dna熒光定量精度的影響。在熒光定量精度的影響。在488nm波波長激發(fā)下，長激發(fā)下，pi的發(fā)射光譜為的發(fā)射光譜為610-620nm。 在在fl2探測器檢測探測器檢測。 fl2探測器檢測探測器檢測pi。3.2 免疫熒光染色免疫熒光染色直接免疫熒光染色法直接免疫熒光染色法 多用于對細(xì)胞表面標(biāo)志的染色分析。選用單克隆熒多用于對細(xì)胞表面標(biāo)志的染色分析。選用單克隆熒光抗體是直接針對細(xì)胞表面抗原特異性標(biāo)志的單一光抗體是直接針對細(xì)胞表面抗原特異性標(biāo)志的單一抗體，一個抗體針對一個抗原。特異性強，熒光標(biāo)抗體，一個抗體針對一個抗原。特異性強，熒

17、光標(biāo)記干擾因素少，但需購買多種熒光標(biāo)記單抗。記干擾因素少，但需購買多種熒光標(biāo)記單抗。間接免疫熒光染色法間接免疫熒光染色法 選用特異性單抗（一抗）與待測細(xì)胞結(jié)合后，再選用特異性單抗（一抗）與待測細(xì)胞結(jié)合后，再用熒光素標(biāo)記的二抗（針對一抗的抗原特異性的）用熒光素標(biāo)記的二抗（針對一抗的抗原特異性的）進行標(biāo)記染色。適用于對一些新的未知抗原的檢測，進行標(biāo)記染色。適用于對一些新的未知抗原的檢測，不需要多種熒光抗體。不需要多種熒光抗體。3.4 光譜重疊的補償光譜重疊的補償n由于細(xì)胞或微球攜帶兩種或兩種以上熒光素，由于細(xì)胞或微球攜帶兩種或兩種以上熒光素，受激光激發(fā)而發(fā)射出兩種不同波長的熒光時，受激光激發(fā)而發(fā)射

18、出兩種不同波長的熒光時， 理論上可選擇濾片使每種熒光僅被相應(yīng)的檢測理論上可選擇濾片使每種熒光僅被相應(yīng)的檢測器檢測，器檢測， 而不會檢測到另一種熒光。而不會檢測到另一種熒光。n由于目前使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性由于目前使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間各自發(fā)射峰值各不相同，質(zhì)，雖然它們之間各自發(fā)射峰值各不相同， 使使用了用了bp（帶通）和（帶通）和lp（長通）濾片后，（長通）濾片后， 發(fā)射發(fā)射光譜范圍仍有一定的重疊?？朔@種誤差最有光譜范圍仍有一定的重疊。克服這種誤差最有效的方法是使用熒光補償，即從一個被檢測的效的方法是使用熒光補償，即從一個被檢測的熒光信號中去除任何其他的干

19、擾熒光信號。熒光信號中去除任何其他的干擾熒光信號。 3.4 光譜重疊的補償光譜重疊的補償 設(shè)置補償?shù)幕静襟E設(shè)置補償?shù)幕静襟En（1）選擇標(biāo)準(zhǔn)熒光微球或正常細(xì)胞。）選擇標(biāo)準(zhǔn)熒光微球或正常細(xì)胞。n（2）調(diào)節(jié)光電倍增管（）調(diào)節(jié)光電倍增管（pmt）電壓，使未染色）電壓，使未染色 細(xì)胞或微球的熒光峰處于細(xì)胞或微球的熒光峰處于10道以內(nèi)。道以內(nèi)。n（3）畫出被分析細(xì)胞或微球的門或區(qū)域。）畫出被分析細(xì)胞或微球的門或區(qū)域。n（4）增加補償設(shè)置，直至陽性和陰性細(xì)胞或）增加補償設(shè)置，直至陽性和陰性細(xì)胞或 微球處于最合適的位置。微球處于最合適的位置。3.4 光譜重疊的補償光譜重疊的補償3.4 光譜重疊的補償光譜重

20、疊的補償3.4 光譜重疊的補償光譜重疊的補償 設(shè)門（設(shè)門（gating）是流式細(xì)胞儀分析中的一）是流式細(xì)胞儀分析中的一種重要技術(shù)，只有通過最佳的設(shè)門方式，種重要技術(shù)，只有通過最佳的設(shè)門方式，才能準(zhǔn)確地獲取和分析。才能準(zhǔn)確地獲取和分析。 “設(shè)門設(shè)門” 是指在細(xì)胞分布圖中，根據(jù)該圖是指在細(xì)胞分布圖中，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群。胞群。 通過通過“設(shè)門設(shè)門”得到不同的得到不同的 區(qū)域區(qū)域（region）。從而對其中的細(xì)胞進行單參）。從而對其中的細(xì)胞進行單參數(shù)或多參數(shù)分析。數(shù)或多參數(shù)分析。設(shè)門策略設(shè)門策略3.5 設(shè)門策略設(shè)門策略設(shè)門策略設(shè)門策略

21、 對血液中淋巴細(xì)胞設(shè)門（對血液中淋巴細(xì)胞設(shè)門（r1）分析其免疫表型）分析其免疫表型設(shè)門策略設(shè)門策略（2）離線設(shè)門）離線設(shè)門 又稱為非實時設(shè)門（又稱為非實時設(shè)門（non-real time gating），）， 是指在流式細(xì)胞儀已獲取數(shù)據(jù)后，通過計算機軟件是指在流式細(xì)胞儀已獲取數(shù)據(jù)后，通過計算機軟件將數(shù)據(jù)調(diào)出，設(shè)定不同的散射光和（或）熒光信號將數(shù)據(jù)調(diào)出，設(shè)定不同的散射光和（或）熒光信號范圍進行數(shù)據(jù)分析的設(shè)門方式。適合于一些需要多范圍進行數(shù)據(jù)分析的設(shè)門方式。適合于一些需要多重設(shè)門并進行較為復(fù)雜分析的數(shù)據(jù)，尤其是對于一重設(shè)門并進行較為復(fù)雜分析的數(shù)據(jù)，尤其是對于一些熒光染色強度不定的樣本，可以采用較大

22、范圍的些熒光染色強度不定的樣本，可以采用較大范圍的散射光閾值設(shè)門，獲取所有信號并儲存在計算機硬散射光閾值設(shè)門，獲取所有信號并儲存在計算機硬盤等介質(zhì)中，再進行離線設(shè)門分析，可以更好地保盤等介質(zhì)中，再進行離線設(shè)門分析，可以更好地保持?jǐn)?shù)據(jù)的完整性。持?jǐn)?shù)據(jù)的完整性。設(shè)門策略設(shè)門策略白細(xì)胞和血小板的光散射設(shè)門白細(xì)胞和血小板的光散射設(shè)門設(shè)門策略設(shè)門策略fl2-w/fl2-a設(shè)門排除雙連體細(xì)胞對設(shè)門排除雙連體細(xì)胞對g2/m期細(xì)胞比例的影響期細(xì)胞比例的影響3.5 設(shè)門策略設(shè)門策略檢測范圍檢測范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞結(jié)構(gòu)=細(xì)胞大小細(xì)胞大小=細(xì)胞粒度細(xì)胞粒度=細(xì)胞表面面積細(xì)胞表面面積=核漿比例核漿比例=dna含量與細(xì)胞周

23、期含量與細(xì)胞周期=rna含量含量=蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞功能細(xì)胞功能=細(xì)胞表面細(xì)胞表面/胞漿胞漿/核的核的特異性抗原特異性抗原=細(xì)胞活性細(xì)胞活性=細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子=酶活性酶活性=激素結(jié)合位點激素結(jié)合位點=細(xì)胞受體細(xì)胞受體第四部分第四部分 應(yīng)應(yīng) 用用4.1 免疫表型分析免疫表型分析n用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體作為分子探針，檢測用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體作為分子探針，檢測細(xì)胞上的特異性抗原分子，稱為免疫表型分析。細(xì)胞上的特異性抗原分子，稱為免疫表型分析?？赏瑫r鑒別單個細(xì)胞上的多種抗原。可同時鑒別單個細(xì)胞上的多種抗原。n國際人類白細(xì)胞抗原協(xié)作組（國際人類白細(xì)胞抗原協(xié)作組（hlda）將細(xì)胞表

24、）將細(xì)胞表面抗原統(tǒng)一編號，用分化群（面抗原統(tǒng)一編號，用分化群（cluster of differentiation, cd）命名，目前已達）命名，目前已達247種。種。 cd分子是細(xì)胞分子是細(xì)胞(白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板及血管白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板及血管內(nèi)皮細(xì)胞等內(nèi)皮細(xì)胞等)在分化成為不同譜系、不同階段細(xì)胞在分化成為不同譜系、不同階段細(xì)胞以及活化過程中或疾病狀態(tài)下出現(xiàn)或消失的細(xì)胞以及活化過程中或疾病狀態(tài)下出現(xiàn)或消失的細(xì)胞表面標(biāo)記。表面標(biāo)記。4.1.1 樣品制備樣品制備n血液或骨髓血液或骨髓 采集使用采集使用edta-k2或或edta-k3抗凝，抗凝抗凝，抗凝劑終濃度為劑終濃度為1.52mg/ml

25、。標(biāo)本采集后室。標(biāo)本采集后室溫保存，溫保存，6h內(nèi)處理。內(nèi)處理。由于標(biāo)本已經(jīng)屬于單細(xì)胞懸液，不需特殊處由于標(biāo)本已經(jīng)屬于單細(xì)胞懸液，不需特殊處理。但一般分析白細(xì)胞時需要用紅細(xì)胞裂解理。但一般分析白細(xì)胞時需要用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，或用特殊方法分離淋巴細(xì)胞液去除紅細(xì)胞，或用特殊方法分離淋巴細(xì)胞或其他白細(xì)胞?；蚱渌准?xì)胞。4.1.1 樣品制備樣品制備n體液和各種灌洗液體液和各種灌洗液 新鮮采集的標(biāo)本，新鮮采集的標(biāo)本，10001500r/min離心離心5min，棄去上清取細(xì)胞沉淀，用含，棄去上清取細(xì)胞沉淀，用含0.1牛血牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液（清白蛋白的磷酸鹽緩沖液（pbs）洗滌）洗滌12次，次

26、，經(jīng)經(jīng)50m的尼龍網(wǎng)過濾后懸浮在的尼龍網(wǎng)過濾后懸浮在0.51ml pbs中待用，一般細(xì)胞濃度為（中待用，一般細(xì)胞濃度為（25）106/ml，當(dāng)細(xì)胞數(shù)不足時可增加標(biāo)本量進，當(dāng)細(xì)胞數(shù)不足時可增加標(biāo)本量進行濃縮。行濃縮。4.1.1 樣品制備樣品制備n各種組織細(xì)胞各種組織細(xì)胞 由于是進行免疫表型分析，應(yīng)使細(xì)胞表面抗原在處由于是進行免疫表型分析，應(yīng)使細(xì)胞表面抗原在處理過程中保持其抗原活性，并且不發(fā)生丟失。因此，理過程中保持其抗原活性，并且不發(fā)生丟失。因此，不宜選用甲醛、乙醇等固定組織，不宜用酶、表面活不宜選用甲醛、乙醇等固定組織，不宜用酶、表面活性劑等處理細(xì)胞。性劑等處理細(xì)胞。 手工剪切法手工剪切法單細(xì)

27、胞儀制備法單細(xì)胞儀制備法 勻漿勻漿50um尼龍網(wǎng)過濾后，用含尼龍網(wǎng)過濾后，用含0.1%bsa的的pbs 10002000r/min 離心離心5min，洗滌，洗滌2次，次，懸浮備用。懸浮備用。4.1.2 抗體選擇抗體選擇n根據(jù)信噪比選擇抗體的滴度：根據(jù)信噪比選擇抗體的滴度：特異性熒光信號特異性熒光信號與非特異性結(jié)合噪音（同型對照）的比值越大，與非特異性結(jié)合噪音（同型對照）的比值越大，表明陽性與對照熒光峰分離越好，可確定為最表明陽性與對照熒光峰分離越好，可確定為最佳抗體滴度。佳抗體滴度。n抗體組合的選擇：抗體組合的選擇：多種熒光素標(biāo)記的單克隆抗多種熒光素標(biāo)記的單克隆抗體組合應(yīng)用之前，必須將每種抗體

28、單獨應(yīng)用和體組合應(yīng)用之前，必須將每種抗體單獨應(yīng)用和組合應(yīng)用的結(jié)果進行比較，無差別結(jié)果時才可組合應(yīng)用的結(jié)果進行比較，無差別結(jié)果時才可組合使用。組合使用。組合應(yīng)用時，注意抗體的稀釋度。單獨使用最組合應(yīng)用時，注意抗體的稀釋度。單獨使用最佳用量為佳用量為20ul，而如，而如3種組合時，總體積增至種組合時，總體積增至60ul，每種抗體被稀釋，不再是最佳用量。，每種抗體被稀釋，不再是最佳用量。 4.1.3 免疫熒光染色免疫熒光染色n直接免疫熒光染色法：直接免疫熒光染色法： 單色免疫熒光染色法單色免疫熒光染色法 多色免疫熒光染色法多色免疫熒光染色法n間接免疫熒光染色法：間接免疫熒光染色法： 單色免疫熒光染色

29、法單色免疫熒光染色法4.1.4 熒光染色對照的設(shè)置熒光染色對照的設(shè)置n陽性對照陽性對照 是指用已知表達某種抗原的細(xì)胞作為樣本檢測，是指用已知表達某種抗原的細(xì)胞作為樣本檢測，應(yīng)出現(xiàn)陽性結(jié)果的對照實驗。是檢查已知陽性標(biāo)應(yīng)出現(xiàn)陽性結(jié)果的對照實驗。是檢查已知陽性標(biāo)本能否用所測條件與方法確定為陽性，否則可能本能否用所測條件與方法確定為陽性，否則可能是單克隆抗體的質(zhì)量與濃度、熒光染色條件、儀是單克隆抗體的質(zhì)量與濃度、熒光染色條件、儀器狀況等存在問題。陽性對照達不到要求時不能器狀況等存在問題。陽性對照達不到要求時不能進行實驗。進行實驗。n陰性對照陰性對照 是指用已知不表達某種抗原的細(xì)胞作為是指用已知不表達某

30、種抗原的細(xì)胞作為樣本檢測，應(yīng)出現(xiàn)陰性結(jié)果的對照實驗。樣本檢測，應(yīng)出現(xiàn)陰性結(jié)果的對照實驗。陰性對照試驗可以避免單克隆抗體的純陰性對照試驗可以避免單克隆抗體的純度不夠或特異性差等因素造成的假陽性度不夠或特異性差等因素造成的假陽性結(jié)果。結(jié)果。4.1.4 熒光染色對照的設(shè)置熒光染色對照的設(shè)置n同型對照同型對照 是指與單克隆抗體相同的、未免疫小鼠的免疫球是指與單克隆抗體相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亞類，若使用直接免疫熒光染色法，同型對照蛋白亞類，若使用直接免疫熒光染色法，同型對照也應(yīng)標(biāo)記熒光素，如：也應(yīng)標(biāo)記熒光素，如：igg1 fitc、igg2a pe等。等。同型對照主要考慮了細(xì)胞的自發(fā)熒光、同型對

31、照主要考慮了細(xì)胞的自發(fā)熒光、fc受體介導(dǎo)受體介導(dǎo)的抗體結(jié)合和非特異性抗體結(jié)合等影響因素。此外，的抗體結(jié)合和非特異性抗體結(jié)合等影響因素。此外，同型對照與單克隆抗體所標(biāo)記的熒光色素、濃度、同型對照與單克隆抗體所標(biāo)記的熒光色素、濃度、標(biāo)記的熒光色素與免疫球蛋白分子的比值（標(biāo)記的熒光色素與免疫球蛋白分子的比值（f/p比比值）應(yīng)該相同為最佳，這對準(zhǔn)確設(shè)定陰性與陽性細(xì)值）應(yīng)該相同為最佳，這對準(zhǔn)確設(shè)定陰性與陽性細(xì)胞的界標(biāo)有重要意義，切忌使用與單克隆抗體不相胞的界標(biāo)有重要意義，切忌使用與單克隆抗體不相匹配的同型對照，最好為同一實驗室、采用相同工匹配的同型對照，最好為同一實驗室、采用相同工藝或方法制備的產(chǎn)品。藝

32、或方法制備的產(chǎn)品。4.1.4 熒光染色對照的設(shè)置熒光染色對照的設(shè)置4.1.6標(biāo)本的固定與保存標(biāo)本的固定與保存n 固定用于延長檢測時間。固定用于延長檢測時間。n熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合后，一些低親和力的熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合后，一些低親和力的抗體在洗滌過程中可能與抗原分離，或不能及抗體在洗滌過程中可能與抗原分離，或不能及時檢測，可導(dǎo)致假陰性或陽性減弱。時檢測，可導(dǎo)致假陰性或陽性減弱。n終濃度為終濃度為1%多聚甲醛，固定多聚甲醛，固定30分鐘。分鐘。n在熒光染色之后進行。在熒光染色之后進行。24小時之內(nèi)檢測。最長小時之內(nèi)檢測。最長可達可達10天。天。4.1.7 免疫表型分析的影響因素免疫表型分析的影

33、響因素n抗體的用量：抗體的用量：使用抗體濃度使用抗體濃度3g/ml時，表明抗體的親時，表明抗體的親和力或特異性低，最好不用。和力或特異性低，最好不用。 最佳濃度一般為最佳濃度一般為0.011 g/ml，相當(dāng)于每個測試，相當(dāng)于每個測試10100ng。n非特異性結(jié)合（非特異性結(jié)合（nsb）：）：是指非抗原抗體的結(jié)合。是指非抗原抗體的結(jié)合。fc受受體結(jié)合抗體是導(dǎo)致其重要因素。任何細(xì)胞上只要存在未結(jié)體結(jié)合抗體是導(dǎo)致其重要因素。任何細(xì)胞上只要存在未結(jié)合的合的fc受體，都可能有受體，都可能有nsb。采用高濃度的純化鼠。采用高濃度的純化鼠igg可可用于阻斷用于阻斷fc受體的受體的nsb。免疫球蛋白聚集可增加

34、。免疫球蛋白聚集可增加nsb。由于冰凍、復(fù)溶和凍干處理，抗體均可出現(xiàn)聚集。對于新由于冰凍、復(fù)溶和凍干處理，抗體均可出現(xiàn)聚集。對于新近購買的抗體，可通過高速離心去除聚集。近購買的抗體，可通過高速離心去除聚集。 n抗原抗體反應(yīng)溫度：抗原抗體反應(yīng)溫度：一般在室溫條件下進行。一般在室溫條件下進行。n死細(xì)胞：死細(xì)胞：可增加抗體的非特異結(jié)合。因此，標(biāo)本采集后應(yīng)可增加抗體的非特異結(jié)合。因此，標(biāo)本采集后應(yīng)盡快進行熒光染色，固定后的保存時間可相對較長。此外，盡快進行熒光染色，固定后的保存時間可相對較長。此外，也可在標(biāo)本制備前計數(shù)死細(xì)胞的百分率。也可在標(biāo)本制備前計數(shù)死細(xì)胞的百分率。4.2 細(xì)胞周期與細(xì)胞周期與dn

35、a倍體分析倍體分析n在生物細(xì)胞核中，在生物細(xì)胞核中，dna含量并非恒定，隨含量并非恒定，隨細(xì)胞增殖周期時相不同而發(fā)生變化。細(xì)胞增殖周期時相不同而發(fā)生變化。n整個細(xì)胞周期從整個細(xì)胞周期從dna含量變化可以描述為含量變化可以描述為g0/g1、s、g2/m期三個細(xì)胞峰。期三個細(xì)胞峰。ng0/g1期細(xì)胞的期細(xì)胞的dna含量相同，均為二含量相同，均為二倍體倍體dna含量。含量。ng2/m期細(xì)胞的期細(xì)胞的dna含量均為四倍體含量均為四倍體dna含量。含量。4.2 細(xì)胞周期與細(xì)胞周期與dna倍體分析倍體分析fcm分析的基本方法分析的基本方法n熒光染料（如熒光染料（如pi）與細(xì)胞）與細(xì)胞dna分子特異結(jié)合，分

36、子特異結(jié)合，而且有一定的量效關(guān)系，即而且有一定的量效關(guān)系，即dna含量的多少與熒含量的多少與熒光染料結(jié)合量成正比，熒光強度與熒光直方圖的光染料結(jié)合量成正比，熒光強度與熒光直方圖的通道數(shù)成正比。通道數(shù)成正比。n在流式細(xì)胞分析在流式細(xì)胞分析dna中，只有在染色體數(shù)目變化中，只有在染色體數(shù)目變化引起引起dna含量與正常細(xì)胞有差異時，才可能有含量與正常細(xì)胞有差異時，才可能有dna異倍體檢出。在異倍體檢出。在dna含量未見異常并不能除含量未見異常并不能除外染色體異常的存在。外染色體異常的存在。細(xì)胞群的細(xì)胞群的dna含量在含量在fcm分析中一般以分析中一般以dna指指數(shù)（數(shù)（dna index，di）表示

37、其相對含量，一個）表示其相對含量，一個正常的二倍體細(xì)胞峰，其正常的二倍體細(xì)胞峰，其 g0/g1期細(xì)胞期細(xì)胞dna含量為含量為2c，di值值1.0。di=樣本樣本g0/g1期細(xì)胞峰平均熒光道數(shù)期細(xì)胞峰平均熒光道數(shù)/正常正常二倍體標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞二倍體標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞g0/g1期細(xì)胞峰平均熒光道數(shù)期細(xì)胞峰平均熒光道數(shù)4.2.1 dna倍體的判定標(biāo)準(zhǔn)倍體的判定標(biāo)準(zhǔn)倍體（倍體（ploidy）原指染色體數(shù)目。）原指染色體數(shù)目。流式細(xì)胞分析中用來描述總的流式細(xì)胞分析中用來描述總的 dna總量?？偭?。根據(jù)根據(jù)di判定判定dna倍體。倍體。 di=1.00.1（0.901.10）為二倍體）為二倍體 di=1.00.15（0.

38、851.15）為近二倍體）為近二倍體 di=2.00.1（1.902.10）為四倍體）為四倍體 di2.10為多倍體為多倍體 其余其余di值均為非整倍體值均為非整倍體1. 單細(xì)胞懸液制備單細(xì)胞懸液制備 n 新鮮或新鮮冰凍標(biāo)本：新鮮或新鮮冰凍標(biāo)本： 白血病標(biāo)本、穿刺液很容白血病標(biāo)本、穿刺液很容易獲得單細(xì)胞懸液。實體腫瘤可在含去污劑的緩沖易獲得單細(xì)胞懸液。實體腫瘤可在含去污劑的緩沖液中手工機械處理，細(xì)胞核可釋放至懸液中。液中手工機械處理，細(xì)胞核可釋放至懸液中。n新鮮固定的標(biāo)本：新鮮固定的標(biāo)本： 標(biāo)本切成標(biāo)本切成12mm2的小塊，在的小塊，在含胃蛋白酶的含胃蛋白酶的0.1mol/l hcl液中孵育或

39、用胰蛋白液中孵育或用胰蛋白酶處理，使其釋放細(xì)胞核。酶處理，使其釋放細(xì)胞核。n甲醛固定、石蠟包埋的標(biāo)本：甲醛固定、石蠟包埋的標(biāo)本： 從包埋組織上切片從包埋組織上切片至少至少50m厚，太薄的切片會含有太多切碎的核，厚，太薄的切片會含有太多切碎的核，從而增加從而增加dna直方圖的碎片干擾。組織切片被脫蠟、直方圖的碎片干擾。組織切片被脫蠟、經(jīng)過乙醇處理并水化后，用蛋白水解酶處理，使其經(jīng)過乙醇處理并水化后，用蛋白水解酶處理，使其釋放細(xì)胞核。釋放細(xì)胞核。2 固定固定 n采用采用70%預(yù)冷乙醇預(yù)冷乙醇(04c)。n運送標(biāo)本時應(yīng)保證樣本完全浸沒在固定劑中。運送標(biāo)本時應(yīng)保證樣本完全浸沒在固定劑中。n由于由于pi

40、不能通過活細(xì)胞進入胞內(nèi)染色，因此要用不能通過活細(xì)胞進入胞內(nèi)染色，因此要用乙醇將細(xì)胞膜打孔，把染料引入胞內(nèi)并將細(xì)胞固乙醇將細(xì)胞膜打孔，把染料引入胞內(nèi)并將細(xì)胞固定。定。n若同時使用抗體鑒別細(xì)胞應(yīng)選擇對抗原無損的固若同時使用抗體鑒別細(xì)胞應(yīng)選擇對抗原無損的固定劑，并在抗體標(biāo)記之后進行固定。定劑，并在抗體標(biāo)記之后進行固定。4.2.2 樣本制備樣本制備4.2.2 樣本制備樣本制備3染色染色 n應(yīng)用應(yīng)用pi染色液。染料要足夠，以保證飽染色液。染料要足夠，以保證飽和結(jié)合。和結(jié)合。pi的推薦濃度至少為的推薦濃度至少為20ug/106細(xì)胞。細(xì)胞。n由于由于pi也與雙鏈也與雙鏈rna結(jié)合，分析前樣本結(jié)合，分析前樣本

41、應(yīng)用應(yīng)用rnase處理。處理。n細(xì)胞用細(xì)胞用50um尼龍網(wǎng)過濾后上機檢測。尼龍網(wǎng)過濾后上機檢測。4細(xì)胞濃度細(xì)胞濃度 單細(xì)胞或細(xì)胞核的最終濃度應(yīng)為單細(xì)胞或細(xì)胞核的最終濃度應(yīng)為 106/ml。濃度太低時，。濃度太低時，流式細(xì)胞儀檢測室樣本的流速不得不提高，從而使流式細(xì)胞儀檢測室樣本的流速不得不提高，從而使cv增大。如果細(xì)胞或細(xì)胞核濃度太高，則可能導(dǎo)致染料增大。如果細(xì)胞或細(xì)胞核濃度太高，則可能導(dǎo)致染料的相對不足，影響的相對不足，影響cv和檢測結(jié)果。和檢測結(jié)果。 流式細(xì)胞分析的高分辨率或精密度可檢出不同細(xì)胞群流式細(xì)胞分析的高分辨率或精密度可檢出不同細(xì)胞群體體dna含量的細(xì)微差別，通常的檢測分辨率或精密

42、度含量的細(xì)微差別，通常的檢測分辨率或精密度由由dna含量直方圖中含量直方圖中g(shù)0/g1峰的變異系數(shù)（峰的變異系數(shù)（cv）來反）來反映。映。cv越小，質(zhì)量越好。新鮮標(biāo)本越小，質(zhì)量越好。新鮮標(biāo)本cv常常3%，石蠟，石蠟包埋標(biāo)本的包埋標(biāo)本的cv5%。4.2.2 樣本制備樣本制備5樣本制備的質(zhì)量樣本制備的質(zhì)量 制備完成后的標(biāo)本可用光學(xué)顯微鏡檢查制備完成后的標(biāo)本可用光學(xué)顯微鏡檢查其質(zhì)量，注意觀察：其質(zhì)量，注意觀察： 樣本中細(xì)胞或細(xì)胞核濃度樣本中細(xì)胞或細(xì)胞核濃度 細(xì)胞聚集或過多的碎片細(xì)胞聚集或過多的碎片 大多數(shù)核有腫瘤樣的外觀大多數(shù)核有腫瘤樣的外觀 分離的核上沒有參與細(xì)胞質(zhì)附著分離的核上沒有參與細(xì)胞質(zhì)附著4.2.3 樣本分析樣本分析4.3 細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(apoptosis)是指有核細(xì)胞在是指有核細(xì)胞在一定條件下，通過內(nèi)源性一定條件下，通過內(nèi)源性dna內(nèi)切酶的內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細(xì)胞死亡過程。激活而發(fā)生的細(xì)胞死亡過程。 4.3.1 細(xì)胞凋亡的生化特征細(xì)胞凋亡的生化特征ncaspase 蛋白酶和絲氨酸蛋白酶激活：蛋白酶和絲氨酸蛋白酶激活：n核酸內(nèi)切酶激活：核酸內(nèi)切酶激活：dna電泳出現(xiàn)電泳出現(xiàn)“梯狀梯狀”改變。改變。n線粒體通透性增高：線粒體膜電位下降。線粒體通透性增高：線粒體膜電位下降。n胞質(zhì)胞質(zhì)ca2+和和ph變化：細(xì)胞內(nèi)變化：細(xì)