第九章 liu-9-轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與生物反應(yīng)器

1、第九章 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物生物反應(yīng)器 一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的定義及簡(jiǎn)單發(fā)展史二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的培育技術(shù)三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用四、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用面臨的問題五、動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器綱要轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenic animal）是指借助基因工程技術(shù)將外源基因?qū)胧荏w動(dòng)物染色體內(nèi)，外源基因與動(dòng)物基因整合后隨細(xì)胞的分裂而擴(kuò)增，在體內(nèi)表達(dá)并能穩(wěn)定地遺傳給后代的動(dòng)物。一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的定義及簡(jiǎn)單發(fā)展史 1974年，年，Jaenish和和Mintz將純化的將純化的SV40 DNA注入老鼠的囊注入老鼠的囊胚腔胚腔(blastocoele cavity)中，在該胚胎發(fā)育成鼠之后，可以在中，在該胚胎發(fā)育成鼠之后，

2、可以在老鼠體組織中偵測(cè)到注入的老鼠體組織中偵測(cè)到注入的DNA。由此可以推斷：注入的。由此可以推斷：注入的DNA可以插入胚胎細(xì)胞的染色體組可以插入胚胎細(xì)胞的染色體組(genome)內(nèi)。內(nèi)。 1980，Gorden et al.發(fā)表了第一篇有關(guān)成功地經(jīng)由微量注射發(fā)表了第一篇有關(guān)成功地經(jīng)由微量注射(microinjection)將基因轉(zhuǎn)殖到老鼠體細(xì)胞中的研究報(bào)告。隨即，將基因轉(zhuǎn)殖到老鼠體細(xì)胞中的研究報(bào)告。隨即，也有不少研究單位利用相同的方法植入許多轉(zhuǎn)殖基因。也有不少研究單位利用相同的方法植入許多轉(zhuǎn)殖基因。 1982年，年，Palmiter獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)入大鼠的生長(zhǎng)激素基因，獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)入大

3、鼠的生長(zhǎng)激素基因，使小鼠體重為正常個(gè)體的二倍，因而被稱為使小鼠體重為正常個(gè)體的二倍，因而被稱為“超級(jí)小鼠超級(jí)小鼠”。 以后相繼在以后相繼在10年間報(bào)道過轉(zhuǎn)基因兔、綿羊、豬、魚、昆蟲、牛、年間報(bào)道過轉(zhuǎn)基因兔、綿羊、豬、魚、昆蟲、牛、雞、山羊、大鼠等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成功。雞、山羊、大鼠等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成功。 由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體系打破了自然繁殖中的種間隔離，使基因能在種系關(guān)系很遠(yuǎn)的機(jī)體間流動(dòng)，它將對(duì)整個(gè)生命科學(xué)產(chǎn)生全局性影響。因此轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)在1991年第一次國(guó)際基因定位會(huì)議上被公認(rèn)是遺傳學(xué)中繼連鎖分析、體細(xì)胞遺傳和基因克隆之后的第四代技術(shù)，被列為生物學(xué)發(fā)展史上126年中第14個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)。評(píng)價(jià)：二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)

4、物的培育技術(shù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育的基本過程 是借助分子生物學(xué)和胚胎工程的技術(shù)，將外源目的基因在體外擴(kuò)增或加工，再導(dǎo)入動(dòng)物的早期胚胎細(xì)胞中，使其整合到染色體上，當(dāng)胚胎被移植到代孕動(dòng)物的輸卵管或子宮中后，發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 生物體細(xì)胞中的DNA能精確合成并防止被DNA酶降解是由于存在由限制酶與修飾酶組成的生物屏障。 一般情況下，限制酶能將外源DNA切割并降解掉，而細(xì)胞本身合成的DNA由于修飾酶的甲基化作用而避免了被限制酶降解從而保持遺傳穩(wěn)定性。 但是，偶然也會(huì)發(fā)生外源DNA幸免降解的情況，使生物體產(chǎn)生小的變異。轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是利用生物這一特性，把外源基因注入細(xì)胞核而獲得符合要求的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

5、。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育的理論基礎(chǔ)培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的關(guān)鍵技術(shù)外源目的基因的制備外源目的基因的有效導(dǎo)入胚胎培養(yǎng)與移植外源目的基因表達(dá)的檢測(cè) （1）基因顯微注射法 （2）逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法 （3）胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法 （4）精子載體導(dǎo)入法 （5）YAC介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 （6）細(xì)胞核移植技術(shù)外源目的基因的導(dǎo)入方法顯微注射法顯微注射法原理原理 通過顯微注射儀將外源基因直接注射到受精卵的雄原核內(nèi)，使外源基因整合到DNA中，發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?；蝻@微注射法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的操作步驟操作步驟： 1）目的基因的準(zhǔn)備 2）供體母鼠和受體母鼠的準(zhǔn)備 3）受精卵的超排和獲取 4）基因顯微注射 5）受精卵

6、的移植 6）目的基因的表達(dá)整合鑒定和檢測(cè) 7）建系來源來源通過限制性內(nèi)切酶預(yù)先分離的某一基因逆轉(zhuǎn)錄法得到的cDNA人工合成的DNA片段PCR擴(kuò)增的特定基因片段擴(kuò)增方式擴(kuò)增方式載體方式PCR1）目的基因的制備）目的基因的制備2）供體母鼠和受體母鼠的準(zhǔn)備）供體母鼠和受體母鼠的準(zhǔn)備供體母鼠（與正常雄鼠交配）受體母鼠（與結(jié)扎雄鼠交配）3）超排卵與取卵）超排卵與取卵 （1）孕馬血清促性腺激素（PMSG） （2）人絨毛膜促性腺激素（HCG） （3）剖腹取卵 4）基因顯微注射）基因顯微注射 顯微操作儀下，將純化的目的基因注射到受精卵的雄性原核內(nèi)。5）受精卵移植）受精卵移植 單細(xì)胞/桑葚胚移植至受孕后0.5d

7、假孕母鼠輸卵管 囊胚期移植至受孕后2.5d假孕母鼠子宮6）目的基因的表達(dá)整合鑒定和檢測(cè)）目的基因的表達(dá)整合鑒定和檢測(cè)小鼠、大鼠取尾部組織利用PCR、 Southern blot、FLSH，Northern blot、 以及Western blot等方法檢測(cè)。 家兔取尾部組織或耳部組織或抽取血液制備待測(cè)材料，大動(dòng)物除了取其組織外，主要抽取血液制備待測(cè)材料。7）建系）建系 大多數(shù)的插入突變是隱型的，只有通過近親繁殖、培育出純合子轉(zhuǎn)基因小鼠，才會(huì)出現(xiàn)基因突變的表型。純合子轉(zhuǎn)基因小鼠的外源基因拷貝數(shù)是雜合子的兩倍。定量PCR分析法點(diǎn)雜交放射自顯影密度法 southern印跡法基因顯微注射法小結(jié)：基因顯

8、微注射法小結(jié)：優(yōu)點(diǎn)：此方法操作簡(jiǎn)單，外源DNA在宿主動(dòng)物染色體上的整合率 高，對(duì)外源基因片段的大小要求不嚴(yán)，外源注射基因長(zhǎng)度 可達(dá)50kb。缺點(diǎn)： 外源基因是否能穩(wěn)定地整合到受體基因組中，要等到子一代出生后經(jīng)過選擇才能確定。 整合位點(diǎn)隨機(jī) 插入到宿主生命活動(dòng)必需基因中，導(dǎo)致胚胎或動(dòng)物死亡。 如果外源基因插入到原癌基因附近，可能誘導(dǎo)它的活 性，導(dǎo)致癌癥發(fā)生；插入到性染色體附近，可能影響轉(zhuǎn) 基因動(dòng)物的育性。 整合一般是多拷貝守衛(wèi)串聯(lián)相接，不利于研究基因的結(jié)構(gòu)、 功能及表達(dá)調(diào)控。（2）逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法）逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法基本原理：基本原理： 該方法是將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組上，人為感染著床前或

9、著床后的胚胎，或直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層細(xì)胞共培養(yǎng)而達(dá)到轉(zhuǎn)染的目的。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染早期胚胎的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染早期胚胎的操作步驟操作步驟： 1）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建 2）包裝細(xì)胞 3）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染早期胚胎1）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建（1）提取病毒未整合的環(huán)狀DNA（2）將環(huán)狀DNA克隆到適當(dāng)載體中（3）酶切去除病毒結(jié)構(gòu)基因編碼區(qū)（gag、pol、 env），保留識(shí)別外殼蛋白進(jìn)行包裝的信 號(hào) 。（4）將目的基因克隆到載體中（5）轉(zhuǎn)染細(xì)胞測(cè)定外源基因的表達(dá)2）包裝細(xì)胞）包裝細(xì)胞 又稱輔助細(xì)胞，這種細(xì)胞株包含有輔助病毒（helper virus）。輔助病毒能合成蛋白外殼

10、，但缺失了識(shí)別蛋白外殼進(jìn)行包裝的信號(hào)，因此它不能包裝成病毒顆粒。當(dāng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞株后，逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA進(jìn)入輔助病毒的外殼蛋白，成為病毒顆粒。 3）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染早期胚胎）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染早期胚胎（1）取胚，例小鼠8細(xì)胞胚（2）去除透明帶，洗凈胚胎（3）輔助細(xì)胞與無透明帶胚胎共培養(yǎng)（4）胚胎移植（5）仔鼠的篩選，雜交PS 將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體技術(shù)與顯微注射技術(shù)結(jié)合，受精前用顯微注射方法將克隆有外源目的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體注射入處于減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞，培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。優(yōu)點(diǎn)： 能高效感染宿主細(xì)胞，可以進(jìn)行多細(xì)胞胚的轉(zhuǎn)化。 載體DNA沒有合成病毒蛋白的能力，不會(huì)產(chǎn)生病 毒顆粒，較為安全。

11、 感染效率高，可達(dá)100% 病毒基因組以轉(zhuǎn)座的方式整合，其基因組不會(huì)發(fā) 生重排，因此所攜帶的外源基因也不會(huì)改變。 缺點(diǎn)： 獲得純合體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的機(jī)會(huì)少，病毒載體構(gòu)建復(fù)雜，轉(zhuǎn)入的外源基因的大小受到限制，還有可能在轉(zhuǎn)基因的同時(shí)帶入病毒載體序列，帶來潛在的安全性問題。這是我們所不需要的。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法小結(jié)：逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法小結(jié)：（3）胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法）胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法 分離培養(yǎng)ES細(xì)胞 克隆培養(yǎng)ES細(xì)胞 將外源基因?qū)隕S細(xì)胞 準(zhǔn)備囊胚期胚胎材料作為移植受體 通過顯微操作將ES細(xì)胞注入受體囊 胚腔，構(gòu)建嵌合體。 胚胎移植，培育轉(zhuǎn)基因鼠 雜交繁育，獲得純合體（4）精子載體導(dǎo)入法）精子載體導(dǎo)入法 直

12、接以精子作為外源DNA載體的轉(zhuǎn)基因方法。操作步驟：操作步驟： 將外源目的基因?qū)刖?利用DNA與精子共育法、電穿孔導(dǎo)入法、脂質(zhì) 體轉(zhuǎn)染法等方法實(shí)現(xiàn)。 被導(dǎo)入外源目的基因的精子與卵子受精 采用人工受精、壺腹部手術(shù)受精、體外受精等方 法，培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 精細(xì)胞作為載體轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因的研究主要集中在 如何有效地把外源基因結(jié)合于精子，而精子在轉(zhuǎn) 導(dǎo)外源基因后仍需有生存能力。 以精子作為載體生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是一種非常有用 的方法（尤其是大動(dòng)物）。 精子載體法和顯微注射法聯(lián)合使用，輔以精子人 工破膜工作。精子載體導(dǎo)入法小結(jié)精子載體導(dǎo)入法小結(jié)：5）YAC介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移YAC介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)途徑： 借助ES

13、細(xì)胞介導(dǎo)法 借助基因顯微注射法YAC介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的優(yōu)點(diǎn)： 保證巨大基因的完整性保證所有順式元件的完整并與結(jié)構(gòu)基因 位置關(guān)系不變消除或減弱基因整合后的位置效應(yīng)使較長(zhǎng)外源片段的整合率提高 YAC載體是近年來發(fā)展起來的新型載體，具有克隆百萬堿基對(duì)的大片段外源DNA的能力。（6）細(xì)胞核移植技術(shù)通過細(xì)胞核移植技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)路線： 外源目的基因通過脂質(zhì)體介導(dǎo)等方法轉(zhuǎn)染 動(dòng)物體細(xì)胞 篩選整合有外源目的基因的體細(xì)胞作為 核供體 將核供體移植到去核卵母細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)物 克隆。 優(yōu)點(diǎn)：使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的群體能迅速被克隆擴(kuò)大，還能保證目的基因在克隆后代中的穩(wěn)定表達(dá)。且后代100%為轉(zhuǎn)基因個(gè)體，由于遺傳背景及遺傳穩(wěn)

14、定性一致，不需選配，僅一代就可建立轉(zhuǎn)基因群體，省時(shí)省力。 缺點(diǎn)：技術(shù)難度大、成功率低、胎兒成活率不高。三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用 改良動(dòng)物品種 通過轉(zhuǎn)移和表達(dá)適當(dāng)?shù)幕颍鼓康幕蛟谒拗?基因組中得以表達(dá)，就可以培育出動(dòng)物新品種。 如，提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度、改良肉質(zhì)和乳質(zhì)、增強(qiáng)動(dòng)物 抵抗力。2. 生物制藥 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物最大的應(yīng)用就是用作乳腺生物反應(yīng) 器。利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來生產(chǎn)貴重的醫(yī)用藥物是目前 世界范圍內(nèi)轉(zhuǎn)基因研究的熱點(diǎn)之一。3.建立診斷和治療人類疾病的動(dòng)物模型 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是對(duì)多種生命現(xiàn)象本質(zhì)深入了解的工具，如研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，細(xì)胞發(fā)育的潛能性，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的相互關(guān)系，胚胎發(fā)育調(diào)控，腫瘤，神經(jīng)

15、與發(fā)育等。 還可以用來建立多種疾病的動(dòng)物模型，進(jìn)而研究這些疾病的發(fā)病機(jī)理及治療方法。4. 生產(chǎn)可用于人體器官移植的動(dòng)物器官 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，通過免疫排斥相關(guān)基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的建立。能夠解決人類器官移植供體來源不足問題，促進(jìn)異源器官移植研究和工作的進(jìn)展。例如，培育出人體免疫系統(tǒng)基因的轉(zhuǎn)基因豬心臟。5. 基因治療(gene therapy) 是指將外源功能性目的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，通過調(diào)控目的基因表達(dá)，抑制、替代或補(bǔ)償缺陷基因，從而恢復(fù)受累細(xì)胞、組織或器官的生理功能，達(dá)到疾病治療的目的?；蛞D(zhuǎn)移到體內(nèi)，大部分是通過以細(xì)胞為靶細(xì)胞和中介的，所以基因治療也可稱做細(xì)胞治療。例如將自殺基因 (suicide

16、 gene) 導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞。人類疾病基因治療策略： 生殖細(xì)胞基因治療 目的基因轉(zhuǎn)入受精卵，治療一些遺傳疾病。 目前僅限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 體細(xì)胞基因治療 基因直接注射法： 經(jīng)靜脈或肌肉直接將帶有外源DNA 的病毒、脂質(zhì)體或裸露DNA注入患者有 關(guān)組織，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并表達(dá)。 體外基因轉(zhuǎn)移再回輸體內(nèi)的方法： 患者體細(xì)胞取出在體外培養(yǎng)并導(dǎo)入 外源目的基因后重新回輸患者體內(nèi)。6 基因打靶 利用特定的導(dǎo)向載體和選擇系統(tǒng)，利用顯微注射、電穿孔等方法構(gòu)建出目的基因序列特異性的ES細(xì)胞（目的基因被敲除或被替換），進(jìn)而完成基因剔除小鼠和基因替換小鼠的構(gòu)建。 轉(zhuǎn)基因以及基因打靶構(gòu)建的小鼠可作為基因結(jié)構(gòu)與功能、基因

17、表達(dá)與調(diào)控的常用模型。四、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用面臨的問題 1. 目的基因整合與表達(dá)的效率低 2. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的負(fù)面效應(yīng) 3. 研究費(fèi)用高，需要相當(dāng)?shù)呢?cái)力支持 4. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物相關(guān)的基礎(chǔ)理論研究薄弱等五、動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器 動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器（mammary gland bioreactor）是利用哺乳動(dòng)物乳腺特異性表達(dá)的啟動(dòng)子元件構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，指導(dǎo)外源基因在乳腺中表達(dá)，并從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳液中獲取重組蛋白。（一）動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的制備 1.表達(dá)載體的構(gòu)建 四類乳腺定位表達(dá)調(diào)控元件： 第一類是：B2乳球蛋白基因調(diào)控序列 第二類：酪蛋白基因調(diào)控序列 第三類：乳清酸蛋白（WAP）基因調(diào)控序列 第四類:

18、乳清蛋白基因調(diào)控序列 2. 目的基因的選擇 正常情況下濃度低、翻譯后修飾復(fù)雜、其它表達(dá)體系難 以表達(dá)或表達(dá)量低、應(yīng)用前景廣闊。 3. 體外重組 4. 基因轉(zhuǎn)導(dǎo) 將構(gòu)建好的重組基因用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法轉(zhuǎn)移到受精卵 5. 胚胎移植 6. 鑒定 DNA水平的鑒定和表達(dá)產(chǎn)物上的鑒定（二）動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn) 1. 產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定 基因產(chǎn)物可被充分修飾且生物活性穩(wěn)定 表達(dá)產(chǎn)物不進(jìn)入血液循環(huán)，不會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基 因個(gè)體帶來不良影響 2.產(chǎn)品成本低 3.研制開發(fā)周期短 4.無污染 5.經(jīng)濟(jì)效益顯著 （三）動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用1.改良乳汁品質(zhì)2. 生產(chǎn)藥用蛋白 例如，人尿激酶、-干擾素、人生長(zhǎng)激素、-抗胰酶蛋白、凝血

19、因子IX、纖溶酶原激活物、抗凝血酶III等。（四）動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器存在的問題 外源基因在動(dòng)物體內(nèi)的位點(diǎn)整合問題 乳蛋白基因表達(dá)種系間組織特異性問題 目的蛋白的翻譯后修飾問題 轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化問題 轉(zhuǎn)基因的技術(shù)與方法問題 倫理道德問題圖中左側(cè)為超級(jí)小鼠（將大鼠的生長(zhǎng)素基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥校覉D中左側(cè)為超級(jí)小鼠（將大鼠的生長(zhǎng)素基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥校?，右?cè)為一般小鼠側(cè)為一般小鼠 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)重大專項(xiàng)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人向記者介紹，2011年5月，他們的科研團(tuán)隊(duì)在一頭黑白花奶牛懷孕45天的一個(gè)胎兒中提取了成纖維細(xì)胞，然后在實(shí)驗(yàn)室通過一個(gè)轉(zhuǎn)染程序，把乳糖分解酶基因轉(zhuǎn)到該細(xì)胞中，接著建成含有轉(zhuǎn)乳糖分解酶基因克隆牛胚胎；2011年7月，