研究氨基酸生產(chǎn)PPT課件

1、 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 2 前前 言言 對微生物的代謝途徑及代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行對微生物的代謝途徑及代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行有目的的改造從而提高氨基酸的產(chǎn)量仍然有目的的改造從而提高氨基酸的產(chǎn)量仍然是現(xiàn)代生物工程學(xué)的一個主攻目標(biāo)。為了是現(xiàn)代生物工程學(xué)的一個主攻目標(biāo)。為了攻克這個目標(biāo)，就有必要對尚待進(jìn)一步完攻克這個目標(biāo)，就有必要對尚待進(jìn)一步完善的細(xì)胞生理學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)善的細(xì)胞生理學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)及生物過程工程等學(xué)科的基本狀況做一番及生物過程工程等學(xué)科的基本狀況做一番描述，主要有如下幾個話題描述，主要有如下幾個話題:2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 3 與生物工程相

2、關(guān)的氨基酸產(chǎn)生與生物工程相關(guān)的氨基酸產(chǎn)生菌的相關(guān)途徑的研究進(jìn)展情況，菌的相關(guān)途徑的研究進(jìn)展情況，其中必須包括這些途徑的其中必須包括這些途徑的代謝調(diào)代謝調(diào)節(jié)以及細(xì)胞的整個調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)節(jié)以及細(xì)胞的整個調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的研的研究進(jìn)展情況。究進(jìn)展情況。 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 4對所有的相關(guān)途徑進(jìn)行詳細(xì)的對所有的相關(guān)途徑進(jìn)行詳細(xì)的代謝流代謝流量分析量分析。這涉及到基質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的碳架。這涉及到基質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的碳架物流量，流經(jīng)向心途徑、中心代謝途徑物流量，流經(jīng)向心途徑、中心代謝途徑和離心途徑的碳架物流量，以及代謝中和離心途徑的碳架物流量，以及代謝中間產(chǎn)物流出細(xì)胞的間產(chǎn)物流出細(xì)胞的碳架物流量碳架物流

3、量 （ the central and peripheral carbon fluxes）。）。 還原力的流量還原力的流量 （ redox flux ）及及能量流量能量流量（energy flux）。）。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 5以協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)的方式以協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)的方式對碳架流、氧對碳架流、氧化還原反應(yīng)的電子流、能量流進(jìn)行導(dǎo)化還原反應(yīng)的電子流、能量流進(jìn)行導(dǎo)向向，以提高基質(zhì)的吸收能力，以提高基質(zhì)的吸收能力、限制前限制前體物向支路途徑的流量、減少中間產(chǎn)體物向支路途徑的流量、減少中間產(chǎn)物的積累及副產(chǎn)物的形成，還要繞過物的積累及副產(chǎn)物的形成，還要繞過氧化還原平衡及能量平衡中可能出現(xiàn)氧

4、化還原平衡及能量平衡中可能出現(xiàn)的難題。的難題。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 6 傳統(tǒng)的設(shè)計育種（傳統(tǒng)的設(shè)計育種（ 隨機(jī)誘變加定隨機(jī)誘變加定向篩選），以及向篩選），以及dna重組技術(shù)在設(shè)計重組技術(shù)在設(shè)計育種中的應(yīng)用已經(jīng)大大提高了育種中的應(yīng)用已經(jīng)大大提高了 微生物微生物對氨基酸的生產(chǎn)能力，對氨基酸的生產(chǎn)能力， 但人們對于氨但人們對于氨基酸產(chǎn)生菌的基酸產(chǎn)生菌的生理學(xué)生理學(xué)與與生物化學(xué)生物化學(xué)等等 主主要領(lǐng)域的基礎(chǔ)知識還相當(dāng)匱乏。要領(lǐng)域的基礎(chǔ)知識還相當(dāng)匱乏。 目前可從以下幾方面理解氨基酸目前可從以下幾方面理解氨基酸的代謝基礎(chǔ)：的代謝基礎(chǔ)： 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座）

5、7具有生物工程學(xué)重要性的微生物的具有生物工程學(xué)重要性的微生物的基本代謝途徑基本代謝途徑及其對應(yīng)的及其對應(yīng)的酶的性質(zhì)酶的性質(zhì)；酶及其酶及其調(diào)節(jié)方式調(diào)節(jié)方式，途徑及其調(diào)節(jié)方，途徑及其調(diào)節(jié)方式；式；中心代謝途徑及離心途徑代謝中心代謝途徑及離心途徑代謝流量流量的定量分析的定量分析；對對跨膜傳送跨膜傳送（基質(zhì)吸收和產(chǎn)物分泌（基質(zhì)吸收和產(chǎn)物分泌）的詳盡的了解。）的詳盡的了解。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 8 目的產(chǎn)物的合成途徑是理解氨基酸目的產(chǎn)物的合成途徑是理解氨基酸生產(chǎn)的前提和核心內(nèi)容生產(chǎn)的前提和核心內(nèi)容 。相關(guān)的代謝途。相關(guān)的代謝途徑不僅包括那些直接導(dǎo)致某特定氨基酸徑不僅包括那些直接導(dǎo)

6、致某特定氨基酸的合成的專用途徑，也包括提供前體碳的合成的專用途徑，也包括提供前體碳架物的途徑、從專用途徑分流最終導(dǎo)致架物的途徑、從專用途徑分流最終導(dǎo)致副產(chǎn)物生成的分支途徑、相應(yīng)氨基酸自副產(chǎn)物生成的分支途徑、相應(yīng)氨基酸自身被降解的途徑、以及那些身被降解的途徑、以及那些提供還原力提供還原力和代謝能量的途徑。和代謝能量的途徑。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 9 除了以上這些反映代謝途徑基本除了以上這些反映代謝途徑基本信息的資料外，代謝流量的相對固定信息的資料外，代謝流量的相對固定的分布以及代謝流量的動力學(xué)響應(yīng)同的分布以及代謝流量的動力學(xué)響應(yīng)同樣是至關(guān)重要的。這既涉及到中心代樣是至關(guān)重要

7、的。這既涉及到中心代謝途徑（提供碳架物質(zhì)、還原力及代謝途徑（提供碳架物質(zhì)、還原力及代謝能）的代謝流的定量分析，又涉及謝能）的代謝流的定量分析，又涉及到特定氨基酸專用的合成途徑的代謝到特定氨基酸專用的合成途徑的代謝流的定量分析。流的定量分析。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 10 此外，基質(zhì)吸收和目的產(chǎn)物輸出等此外，基質(zhì)吸收和目的產(chǎn)物輸出等有方向性的跨膜反應(yīng)對于氨基酸的生產(chǎn)有方向性的跨膜反應(yīng)對于氨基酸的生產(chǎn)也是極其重要的。除大腸桿菌外，一般也是極其重要的。除大腸桿菌外，一般工業(yè)微生物基質(zhì)吸收方面的知識是相當(dāng)工業(yè)微生物基質(zhì)吸收方面的知識是相當(dāng)欠缺的。氨基酸跨膜輸出的研究領(lǐng)域近欠缺的。氨

8、基酸跨膜輸出的研究領(lǐng)域近年才受到關(guān)注。方向性的跨膜反應(yīng)的機(jī)年才受到關(guān)注。方向性的跨膜反應(yīng)的機(jī)理、微生物能學(xué)及氨基酸分泌的調(diào)節(jié)等理、微生物能學(xué)及氨基酸分泌的調(diào)節(jié)等方面的知識對于理解氨基酸生產(chǎn)過程也方面的知識對于理解氨基酸生產(chǎn)過程也是相當(dāng)重要的。是相當(dāng)重要的。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 11 我們將一起回顧發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸我們將一起回顧發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的代謝基礎(chǔ)的建立過程，一起討論代謝流的代謝基礎(chǔ)的建立過程，一起討論代謝流量分析對于了解細(xì)胞生理的意義和氨基酸量分析對于了解細(xì)胞生理的意義和氨基酸生物合成的代謝工程，還將一起討論跨膜生物合成的代謝工程，還將一起討論跨膜輸送方面為數(shù)不多

9、的研究工作，以及這方輸送方面為數(shù)不多的研究工作，以及這方面研究對于微生物過量合成氨基酸的意義面研究對于微生物過量合成氨基酸的意義。在此基礎(chǔ)上，討論以氨基酸為目的產(chǎn)物。在此基礎(chǔ)上，討論以氨基酸為目的產(chǎn)物的微生物代謝設(shè)計的新進(jìn)展和新方法。的微生物代謝設(shè)計的新進(jìn)展和新方法。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 121. 氨基酸生產(chǎn)的代謝基礎(chǔ)氨基酸生產(chǎn)的代謝基礎(chǔ)2. 氨基酸生物合成的代謝流量氨基酸生物合成的代謝流量 分析分析3. 基質(zhì)的跨膜吸收與氨基酸的基質(zhì)的跨膜吸收與氨基酸的 跨膜輸出跨膜輸出4. 氨基酸生產(chǎn)的代謝設(shè)計氨基酸生產(chǎn)的代謝設(shè)計 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 131

10、.氨基酸生產(chǎn)的代謝基礎(chǔ)氨基酸生產(chǎn)的代謝基礎(chǔ)1.1 氨基酸的生物合成氨基酸的生物合成1.2 代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的生理學(xué)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的生理學(xué)2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 14 1. 1 氨基酸生產(chǎn)的代謝基礎(chǔ)氨基酸生產(chǎn)的代謝基礎(chǔ) 氨基酸的生物合成涉及以下氨基酸的生物合成涉及以下5個方面?zhèn)€方面： （1）基質(zhì)吸收；）基質(zhì)吸收；（2）進(jìn)入中心代謝途徑前的準(zhǔn)備途徑；）進(jìn)入中心代謝途徑前的準(zhǔn)備途徑；（3）經(jīng)中心代謝途徑產(chǎn)生碳架化合物（氨）經(jīng)中心代謝途徑產(chǎn)生碳架化合物（氨基酸的前體化合物）、還原力（如基酸的前體化合物）、還原力（如nadph、nadh ）和代謝能（和代謝能（ atp 和磷酸烯醇式和磷酸

11、烯醇式丙酮酸等）；丙酮酸等）； 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 15（4）通過同化（）通過同化（ 合成）合成） 途徑將碳途徑將碳架化合物轉(zhuǎn)化成目的氨基酸，此過架化合物轉(zhuǎn)化成目的氨基酸，此過程涉及到還原力與代謝能的供需平程涉及到還原力與代謝能的供需平衡，同時也涉及主要載流途徑與分衡，同時也涉及主要載流途徑與分支途徑之間的關(guān)系；支途徑之間的關(guān)系； （5）目的氨基酸的跨膜輸出等；）目的氨基酸的跨膜輸出等；（6）目的產(chǎn)物進(jìn)一步代謝的途徑。）目的產(chǎn)物進(jìn)一步代謝的途徑。 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 16 谷氨酸棒桿菌中賴氨酸的合成谷氨酸棒桿菌中賴氨酸的合成是研究得最為廣泛的

12、。是研究得最為廣泛的。圖圖 2 列出了列出了谷氨酸棒桿菌中天冬族氨基酸生物谷氨酸棒桿菌中天冬族氨基酸生物合成相關(guān)的途徑及重要步驟的代謝合成相關(guān)的途徑及重要步驟的代謝調(diào)節(jié)情況。調(diào)節(jié)情況。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 17基質(zhì)基質(zhì)異化途徑同化途徑氨基酸副產(chǎn)物降解途徑氨基酸全局調(diào)節(jié)系統(tǒng)跨膜吸收碳架、還原力、代謝能跨膜輸出重吸收反饋調(diào)節(jié)圖圖1. 微生物細(xì)胞合成氨基酸的相關(guān)途徑微生物細(xì)胞合成氨基酸的相關(guān)途徑及代謝調(diào)節(jié)示意圖及代謝調(diào)節(jié)示意圖 其中，各相關(guān)酶及其中，各相關(guān)酶及途徑水平上的代謝調(diào)節(jié)途徑水平上的代謝調(diào)節(jié)，以及整個細(xì)胞水平上，以及整個細(xì)胞水平上的全局調(diào)節(jié)對于代謝流的全局調(diào)節(jié)對于代謝

13、流的導(dǎo)向和改造是至關(guān)重的導(dǎo)向和改造是至關(guān)重要的。對微生物整個代要的。對微生物整個代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行有目的的改謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行有目的的改造和設(shè)計涉及到大范圍造和設(shè)計涉及到大范圍的遺傳改造。的遺傳改造。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 18 該同化（合成）途徑通過草酰乙酸該同化（合成）途徑通過草酰乙酸 （oaa）與中心代謝途徑相接，天冬氨與中心代謝途徑相接，天冬氨酸是該族氨基酸的共同前體物。酸是該族氨基酸的共同前體物。 來自回來自回補(bǔ)途徑及補(bǔ)途徑及tca 環(huán)的草酰乙酸，環(huán)的草酰乙酸， 進(jìn)入合進(jìn)入合成途徑并在天冬氨酸成途徑并在天冬氨酸 - 半醛（半醛（ asa）處分為兩條支路，一條通往賴氨酸，另處分

14、為兩條支路，一條通往賴氨酸，另一條通往蘇氨酸、蛋氨酸（一條通往蘇氨酸、蛋氨酸（ 甲硫氨酸甲硫氨酸 ）及異亮氨酸。該途徑上主要調(diào)控點(diǎn)是及異亮氨酸。該途徑上主要調(diào)控點(diǎn)是天冬氨酸激酶（天冬氨酸激酶（ ak ），），其他重要的酶其他重要的酶包括高絲氨酸脫氫酶（包括高絲氨酸脫氫酶（ hdh ） 和蘇氨和蘇氨酸脫氫酶（酸脫氫酶（tdh）。）。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 19 再往后的流量控制點(diǎn)是是通往賴再往后的流量控制點(diǎn)是是通往賴氨酸氨酸 ddp合酶（見圖中合酶（見圖中dhdps） 以以及賴氨酸的需能輸出。要獲得令人滿及賴氨酸的需能輸出。要獲得令人滿意的結(jié)果，必須全面考慮這些方面，意的結(jié)

15、果，必須全面考慮這些方面，僅僅對于個別反應(yīng)（即便是最重要的僅僅對于個別反應(yīng)（即便是最重要的調(diào)控點(diǎn)）進(jìn)行改造并不是理想的方法調(diào)控點(diǎn)）進(jìn)行改造并不是理想的方法，broer 等曾將脫敏的等曾將脫敏的 ak 的基因?qū)У幕驅(qū)胍吧羞M(jìn)行表達(dá)，但并未獲得很入野生菌中進(jìn)行表達(dá)，但并未獲得很令人滿意的賴氨酸產(chǎn)量。令人滿意的賴氨酸產(chǎn)量。 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 20 該途徑上另一值得關(guān)注的該途徑上另一值得關(guān)注的特征是從六氫吡啶二羧酸出發(fā)特征是從六氫吡啶二羧酸出發(fā)合成二氨基庚二酸的旁路途徑合成二氨基庚二酸的旁路途徑的出現(xiàn)，借助于的出現(xiàn)，借助于 nmr 手段已手段已經(jīng)得知，旁路的出現(xiàn)依賴于

16、某經(jīng)得知，旁路的出現(xiàn)依賴于某些代謝條件，特別是可利用的些代謝條件，特別是可利用的nh4+的存在。的存在。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 21 另一個重要的方面是參與特另一個重要的方面是參與特定氨基酸合成途徑及與之相關(guān)的其定氨基酸合成途徑及與之相關(guān)的其他代謝途徑的他代謝途徑的酶的調(diào)節(jié)特性酶的調(diào)節(jié)特性，包括，包括酶活力的調(diào)節(jié)和酶的表達(dá)的調(diào)節(jié)。酶活力的調(diào)節(jié)和酶的表達(dá)的調(diào)節(jié)。特別是必須詳細(xì)研究中間產(chǎn)物或終特別是必須詳細(xì)研究中間產(chǎn)物或終端產(chǎn)物對途徑起點(diǎn)或分支處的關(guān)鍵端產(chǎn)物對途徑起點(diǎn)或分支處的關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)。酶的調(diào)節(jié)。 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 22圖圖2 2. . 天冬族

17、氨基酸的生物合成及代謝調(diào)節(jié).(其中 表示反饋抑制； 表示反饋?zhàn)瓒?ir縮寫符號：縮寫符號：asa為天門冬氨酸為天門冬氨酸-半半醛，醛，hse為高絲氨酸，為高絲氨酸，sucakpa為琥珀酰二氨為琥珀酰二氨基庚二酸；基庚二酸；ak為天冬氨為天冬氨酸激酶，酸激酶，dhdps為二氫為二氫吡啶二羧酸合酶，吡啶二羧酸合酶，hdh為為高絲氨酸脫氫酶，高絲氨酸脫氫酶，hk為為高絲氨酸激酶，高絲氨酸激酶，tdh為蘇為蘇氨酸脫氫酶，氨酸脫氫酶，ahas為乙為乙酰羥酸合酶；酰羥酸合酶； peps為為pep合成酶，合成酶，pk為丙酮為丙酮酸激酶，酸激酶，pc為丙酮酸羧為丙酮酸羧化酶，化酶，oaadc為草酰乙為草酰乙酸

18、脫羧酶，酸脫羧酶，pepc為為pep羧化酶，羧化酶，pepck為為pep羧激酶。羧激酶。pyraccoaoaatcactahdhhomdhdpsdapaaspasp-paklyscasahseimetddpsucakpadaplyshkthrbilethrtdhilvaahasilvbnithrlysithrmetrmetrile，leu,valrileiileiemppeppepcpepckpcoaadcpkpepsglcg6ppts奇異三角區(qū)2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 23 要想根據(jù)細(xì)胞粗提取液的測定要想根據(jù)細(xì)胞粗提取液的測定結(jié)果對這些酶的調(diào)控性質(zhì)做出適當(dāng)結(jié)果對這些酶的調(diào)

19、控性質(zhì)做出適當(dāng)?shù)慕忉屖强坎蛔〉摹５慕忉屖强坎蛔〉?。這一方面是因這一方面是因為它們在這些條件下可能不穩(wěn)定；為它們在這些條件下可能不穩(wěn)定；另一方面，對于需要什么樣的輔因另一方面，對于需要什么樣的輔因子才能保持它們的活性或（和）它子才能保持它們的活性或（和）它們在緩沖液中的穩(wěn)定性，也知之甚們在緩沖液中的穩(wěn)定性，也知之甚少；而且特別是因為在抽提的過程少；而且特別是因為在抽提的過程中，那些參與胞內(nèi)酶活性調(diào)節(jié)的必中，那些參與胞內(nèi)酶活性調(diào)節(jié)的必需因子會丟失。需因子會丟失。 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 24 谷氨酸棒桿菌中存在谷氨酸棒桿菌中存在 - 酮戊二酮戊二酸脫氫酶便是一例。酸脫氫酶便是

20、一例。人們最初認(rèn)為人們最初認(rèn)為這個酶在谷氨酸棒桿菌中并不存在這個酶在谷氨酸棒桿菌中并不存在。正因為如此，才出現(xiàn)了這樣的假。正因為如此，才出現(xiàn)了這樣的假設(shè)，即：設(shè)，即：tca 環(huán)在該處的中斷引起環(huán)在該處的中斷引起 - 酮戊二酸的酮戊二酸的 “ 溢出溢出 ”， 最終導(dǎo)最終導(dǎo)致谷氨酸的分泌致谷氨酸的分泌。后來才弄清這個后來才弄清這個酶在谷氨酸棒桿菌中實際上是存在酶在谷氨酸棒桿菌中實際上是存在的，但是它似乎很不穩(wěn)定的，但是它似乎很不穩(wěn)定。 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 25 另外，另外，在關(guān)于代謝流的研究中在關(guān)于代謝流的研究中有跡象表明，在谷氨酸棒桿菌中有跡象表明，在谷氨酸棒桿菌中-酮

21、戊二酸脫氫酶的活性已被調(diào)低了酮戊二酸脫氫酶的活性已被調(diào)低了（dawn-regulated），）， 但這在細(xì)但這在細(xì)胞抽提物中至今不能得到證實。進(jìn)胞抽提物中至今不能得到證實。進(jìn)行詳細(xì)的代謝流量（包括相關(guān)中間行詳細(xì)的代謝流量（包括相關(guān)中間產(chǎn)物的流量）分析，或許是解決這產(chǎn)物的流量）分析，或許是解決這一問題的唯一辦法。一問題的唯一辦法。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 26 正確描述代謝網(wǎng)絡(luò)的主要節(jié)點(diǎn)的正確描述代謝網(wǎng)絡(luò)的主要節(jié)點(diǎn)的調(diào)控模式是十分必要的，但常常是十調(diào)控模式是十分必要的，但常常是十分困難的。谷氨酸棒桿菌中丙酮酸和分困難的。谷氨酸棒桿菌中丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸節(jié)點(diǎn)的復(fù)合模式就磷

22、酸烯醇式丙酮酸節(jié)點(diǎn)的復(fù)合模式就是最好的例子。谷氨酸棒桿菌中是最好的例子。谷氨酸棒桿菌中pep、pyr和和oaa所構(gòu)成的所構(gòu)成的 “ 奇異三角奇異三角區(qū)區(qū) ”（magic triangle）是研究的熱是研究的熱點(diǎn)點(diǎn) 。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 27glcpeppyraccoaoaag6pglc注：注：pk, pc,pepc, pepck,oaadc,peps, pts奇異三角區(qū)奇異三角區(qū)2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 28 pep通過通過pyr和和accoa向向tca環(huán)提供環(huán)提供c2單位，同時，單位，同時，pep、pyr 以及以及 accoa 還通過回補(bǔ)反應(yīng)還通

23、過回補(bǔ)反應(yīng)（ 通通過乙醛酸環(huán)）為過乙醛酸環(huán)）為tca環(huán)提供重要中環(huán)提供重要中間產(chǎn)物，這些回補(bǔ)反應(yīng)對于以間產(chǎn)物，這些回補(bǔ)反應(yīng)對于以tca環(huán)代謝中間產(chǎn)物環(huán)代謝中間產(chǎn)物 為前體的氨基酸的為前體的氨基酸的生產(chǎn)來說是非常必要的。生產(chǎn)來說是非常必要的。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 29 該區(qū)包含可能有多達(dá)七個酶的參與該區(qū)包含可能有多達(dá)七個酶的參與，其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（，其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（pepc）、）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（ pepck ）、）、丙酮酸激酶丙酮酸激酶 （ pk ）、）、 草酰乙酸草酰乙酸脫羧酶脫羧酶 （oaadc ）和磷酸烯醇式丙

24、酮和磷酸烯醇式丙酮酸磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（酸磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（pts）都已得到鑒都已得到鑒定，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶（定，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶（ peps ）已被假定存在。丙酮酸羧化酶（已被假定存在。丙酮酸羧化酶（ pc ）的存在已得到代謝流量分析的實驗數(shù)的存在已得到代謝流量分析的實驗數(shù)據(jù)的支持。據(jù)的支持。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 30 合成代謝途徑通常受反饋抑制合成代謝途徑通常受反饋抑制和反饋?zhàn)瓒舻膰?yán)格調(diào)控，比如和反饋?zhàn)瓒舻膰?yán)格調(diào)控，比如 圖圖2 中中的的ak、hdh、tdh、ahas等。等。 不不過，相對于大腸桿菌而言，谷氨酸棒過，相對于大腸桿菌而言，谷氨酸棒桿菌中的調(diào)節(jié)尤其

25、是天冬族氨基酸合桿菌中的調(diào)節(jié)尤其是天冬族氨基酸合成途徑的調(diào)節(jié)還是比較簡單的。成途徑的調(diào)節(jié)還是比較簡單的。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 31 研究表明，僅僅研究與合成途徑直研究表明，僅僅研究與合成途徑直接相關(guān)的酶的調(diào)節(jié)以及還原力和能量的接相關(guān)的酶的調(diào)節(jié)以及還原力和能量的供給，以及對供給，以及對“瓶頸瓶頸”處關(guān)鍵酶的處關(guān)鍵酶的解調(diào)解調(diào)節(jié)節(jié)或或過量表達(dá)過量表達(dá)仍是不夠的。中心代謝途仍是不夠的。中心代謝途徑和合成代謝途徑，特別是合成代謝途徑和合成代謝途徑，特別是合成代謝途徑，同全局調(diào)控機(jī)制密切相關(guān)，如緊縮徑，同全局調(diào)控機(jī)制密切相關(guān)，如緊縮控制、營養(yǎng)阻遏、供氧控制、氮源調(diào)節(jié)控制、營養(yǎng)阻遏

26、、供氧控制、氮源調(diào)節(jié)、滲透壓調(diào)節(jié)及生長階段調(diào)節(jié)等。這些、滲透壓調(diào)節(jié)及生長階段調(diào)節(jié)等。這些問題對于氨基酸的合成非常重要，但對問題對于氨基酸的合成非常重要，但對它們了解得并不多。它們了解得并不多。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 32 氨基酸的生產(chǎn)中經(jīng)常用到特定氨基酸的生產(chǎn)中經(jīng)常用到特定的氨基酸營養(yǎng)缺陷型菌株。一方面的氨基酸營養(yǎng)缺陷型菌株。一方面，在分成兩支的氨基酸合成途徑中，在分成兩支的氨基酸合成途徑中，一個分支途徑的終端產(chǎn)物氨基酸，一個分支途徑的終端產(chǎn)物氨基酸的營養(yǎng)缺陷，通常對另一分支的終的營養(yǎng)缺陷，通常對另一分支的終端產(chǎn)物氨基酸的合成起促進(jìn)作用。端產(chǎn)物氨基酸的合成起促進(jìn)作用。20

27、21-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 33(其中 表示反饋抑制； 表示反饋?zhàn)瓒?圖圖3.3.天冬族氨基酸過量合成的機(jī)理irpyraccoaoaatcactahdhhomdhdpsdapaaspasp-paklyscasahseimetddpsucakpadaplyshkthrbilethrtdhilvaahasilvbnithrlysithrmetrmetrile,leu,valrileiileiemppepppcpckpcodcpkppsglcg6ppts比如圖比如圖 3 中，谷中，谷氨酸棒桿菌中高氨酸棒桿菌中高絲氨酸缺陷或蘇絲氨酸缺陷或蘇氨酸缺陷的賴氨氨酸缺陷的賴氨酸生產(chǎn)菌株，大酸生產(chǎn)

28、菌株，大腸桿菌中甲硫氨腸桿菌中甲硫氨酸缺陷、二氨基酸缺陷、二氨基庚二酸缺陷或異庚二酸缺陷或異亮氨酸缺陷的蘇亮氨酸缺陷的蘇氨酸生產(chǎn)菌株。氨酸生產(chǎn)菌株。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 34 另一方面，某些化合物另一方面，某些化合物對菌對菌體生長的限制體生長的限制，不論是氨基酸或，不論是氨基酸或其他化合物（其他化合物（ 比如磷酸鹽比如磷酸鹽 ）, 都都可能成為有利于特定生物過程的可能成為有利于特定生物過程的最優(yōu)控制的技術(shù)條件。最優(yōu)控制的技術(shù)條件。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 35 盡管連續(xù)培養(yǎng)得到的結(jié)果盡管連續(xù)培養(yǎng)得到的結(jié)果表明，賴氨酸的生成是與細(xì)胞的表明，賴氨酸的生成

29、是與細(xì)胞的生長是相關(guān)聯(lián)的。但生長是相關(guān)聯(lián)的。但在在有效分泌有效分泌的生理條件下，氨基酸生產(chǎn)菌一的生理條件下，氨基酸生產(chǎn)菌一般都處于生長受限制的狀態(tài)。般都處于生長受限制的狀態(tài)。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 36 然而，對于與生長限制相關(guān)的中心然而，對于與生長限制相關(guān)的中心代謝（代謝（ central metabolism ） 和外圍和外圍代謝（代謝（peripheral metabolism） 的改的改變?nèi)绾斡绊懓被岬挠行桑€不很變?nèi)绾斡绊懓被岬挠行?，還不很清楚；這或許與影響到許多不同的基因清楚；這或許與影響到許多不同的基因和操縱子的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)和操縱子的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò) （ r

30、egulatory networks ) 的作用有關(guān)。的作用有關(guān)。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 37谷氨酸的生產(chǎn)可以建筑在完全谷氨酸的生產(chǎn)可以建筑在完全不同的細(xì)胞代謝態(tài)勢下。許多方法不同的細(xì)胞代謝態(tài)勢下。許多方法可誘導(dǎo)其分泌，包括生物素饑餓法可誘導(dǎo)其分泌，包括生物素饑餓法（用于谷氨酸生產(chǎn)的谷氨酸棒桿菌（用于谷氨酸生產(chǎn)的谷氨酸棒桿菌是生物素缺陷型）、添加胺類表面是生物素缺陷型）、添加胺類表面活性劑、在菌體生長期添加青霉素活性劑、在菌體生長期添加青霉素、甘油或脂肪酸缺陷菌株在限制條、甘油或脂肪酸缺陷菌株在限制條件下生長等。件下生長等。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 3

31、8 很顯然，所使用的這些很顯然，所使用的這些方法都對細(xì)胞質(zhì)膜或細(xì)胞壁方法都對細(xì)胞質(zhì)膜或細(xì)胞壁有一定影響，但使細(xì)胞膜通有一定影響，但使細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化的機(jī)理是不完透性發(fā)生變化的機(jī)理是不完全一樣的。全一樣的。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 39谷氨酸的分泌曾被認(rèn)為是因為相谷氨酸的分泌曾被認(rèn)為是因為相對簡單和直接的代謝改變（即影響細(xì)對簡單和直接的代謝改變（即影響細(xì)胞膜性質(zhì)）的而引起的，然而最近發(fā)胞膜性質(zhì)）的而引起的，然而最近發(fā)現(xiàn)在沒有緊縮效應(yīng)的大腸桿菌（現(xiàn)在沒有緊縮效應(yīng)的大腸桿菌（rel a 基因缺損）中，通過氨基酸饑餓法可基因缺損）中，通過氨基酸饑餓法可以觸發(fā)細(xì)胞的借助于載體的谷

32、氨酸分以觸發(fā)細(xì)胞的借助于載體的谷氨酸分泌活性，這表明全局調(diào)節(jié)機(jī)制對分泌泌活性，這表明全局調(diào)節(jié)機(jī)制對分泌的影響是存在的。的影響是存在的。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 40 1.2 氨基酸生產(chǎn)的微生物生理學(xué)氨基酸生產(chǎn)的微生物生理學(xué)對于經(jīng)氧化還原過程實現(xiàn)氨基酸對于經(jīng)氧化還原過程實現(xiàn)氨基酸生產(chǎn)的重要性，早有所認(rèn)識。但對其生產(chǎn)的重要性，早有所認(rèn)識。但對其中大多數(shù)現(xiàn)象（至少在分子水平上）中大多數(shù)現(xiàn)象（至少在分子水平上）仍未很好理解。對一般的代謝調(diào)節(jié)現(xiàn)仍未很好理解。對一般的代謝調(diào)節(jié)現(xiàn)象做如下五點(diǎn)概述，可能將有利于我象做如下五點(diǎn)概述，可能將有利于我們從生理學(xué)的角度去理解代謝中間產(chǎn)們從生理學(xué)的角

33、度去理解代謝中間產(chǎn)物的生產(chǎn)。物的生產(chǎn)。 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 41（1） 氨基酸的生產(chǎn)與菌體生長之間氨基酸的生產(chǎn)與菌體生長之間的關(guān)系尚未解決（耦合與否？）。的關(guān)系尚未解決（耦合與否？）。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 42（2） 限制生長條件下的微生物生理限制生長條件下的微生物生理。 在緩慢生長或非生長條件下，有目在緩慢生長或非生長條件下，有目的地控制基質(zhì)的吸收與代謝的速率，的地控制基質(zhì)的吸收與代謝的速率，能提高發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)效率。因此，要能提高發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)效率。因此，要用分子技術(shù)或生化技術(shù)對此進(jìn)行深入用分子技術(shù)或生化技術(shù)對此進(jìn)行深入細(xì)致的研究，以闡明在限制

34、生長條件細(xì)致的研究，以闡明在限制生長條件下，微生物的生理背景同工業(yè)生物過下，微生物的生理背景同工業(yè)生物過程的應(yīng)用必定密切相關(guān)的道理。程的應(yīng)用必定密切相關(guān)的道理。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 43（3）溢出代謝的概念：）溢出代謝的概念： 當(dāng)這個生當(dāng)這個生理學(xué)的新見識同過量生產(chǎn)的特定代理學(xué)的新見識同過量生產(chǎn)的特定代謝條件，在分子水平上發(fā)生相互關(guān)謝條件，在分子水平上發(fā)生相互關(guān)聯(lián)的時候，溢出代謝（聯(lián)的時候，溢出代謝（overflow metabolism）的概念是值得關(guān)注的的概念是值得關(guān)注的。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 44 例如，在過量生產(chǎn)某種產(chǎn)物的代謝例如，在過量

35、生產(chǎn)某種產(chǎn)物的代謝條件下，已觀察到某些特有的代謝中間條件下，已觀察到某些特有的代謝中間產(chǎn)物，如產(chǎn)物，如 丙酮酸、丙酮酸、 - 酮戊二酸酮戊二酸等，會等，會大量分泌。這些特定的代謝中間產(chǎn)物先大量分泌。這些特定的代謝中間產(chǎn)物先在細(xì)胞內(nèi)累積（這取決于碳源的性質(zhì)和在細(xì)胞內(nèi)累積（這取決于碳源的性質(zhì)和生長限制），然后分泌到細(xì)胞外（如果生長限制），然后分泌到細(xì)胞外（如果細(xì)胞具備允許這些代謝中間產(chǎn)物跨膜機(jī)細(xì)胞具備允許這些代謝中間產(chǎn)物跨膜機(jī)構(gòu)或有輸送系統(tǒng)存在），從而構(gòu)或有輸送系統(tǒng)存在），從而抵消在碳抵消在碳架物質(zhì)、還原當(dāng)量和代謝能等在代謝中架物質(zhì)、還原當(dāng)量和代謝能等在代謝中的不平衡。的不平衡。2021-10-2

36、7張星元：發(fā)酵原理（講座） 45（4）代謝不平衡：）代謝不平衡： 細(xì)胞的代謝不平衡指細(xì)胞的代謝不平衡指碳架物質(zhì)不平衡，特別是指代謝能和還原當(dāng)碳架物質(zhì)不平衡，特別是指代謝能和還原當(dāng)量的不平衡。代謝不平衡的條件常常涉及到量的不平衡。代謝不平衡的條件常常涉及到溢流閥溢流閥（ overflow valves ）的功能。事實的功能。事實上，代謝網(wǎng)絡(luò)之所以能夠在失去平衡的條件上，代謝網(wǎng)絡(luò)之所以能夠在失去平衡的條件下（如大量氨基酸的過量合成下（如大量氨基酸的過量合成 ）得以維持）得以維持，是因為它具備使通常情況下（指碳架物質(zhì)，是因為它具備使通常情況下（指碳架物質(zhì)和代謝能限制的條件下和代謝能限制的條件下 ）耦

37、合在一起的代耦合在一起的代謝流謝流脫鉤脫鉤的靈活性的靈活性。 好幾個術(shù)語，如好幾個術(shù)語，如 “ 解解耦聯(lián)耦聯(lián) ”、“ 代謝能溢出代謝能溢出 ” 等就是用來說等就是用來說明這種靈活性的。明這種靈活性的。 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 46 實際上，曾有人這樣描述過細(xì)實際上，曾有人這樣描述過細(xì)菌的這種行為：菌的這種行為：“ 可以推斷，細(xì)菌可以推斷，細(xì)菌對于代謝能過剩的解決辦法是把它對于代謝能過剩的解決辦法是把它浪費(fèi)（用）掉浪費(fèi)（用）掉 ”。然而，對特定條。然而，對特定條件下（如與不生長發(fā)生耦合或耦合件下（如與不生長發(fā)生耦合或耦合欠佳的氨基酸的生產(chǎn)條件下）代謝欠佳的氨基酸的生產(chǎn)條件下

38、）代謝能耗散的機(jī)制，尚待進(jìn)行深入的研能耗散的機(jī)制，尚待進(jìn)行深入的研究。究。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 47 在細(xì)菌中存在很多能夠浪費(fèi)代在細(xì)菌中存在很多能夠浪費(fèi)代謝能的反應(yīng)和反應(yīng)組合。如謝能的反應(yīng)和反應(yīng)組合。如 k+ 離離子或子或 nh4+ 的無效循環(huán)，（在某些的無效循環(huán)，（在某些情況下也會發(fā)生）質(zhì)子的無效循環(huán)情況下也會發(fā)生）質(zhì)子的無效循環(huán)。這樣的代謝能溢出反應(yīng)表明，。這樣的代謝能溢出反應(yīng)表明，合合成代謝與分解代謝之間存在不平衡成代謝與分解代謝之間存在不平衡, 而這正是氨基酸生產(chǎn)菌種所希望得而這正是氨基酸生產(chǎn)菌種所希望得到滿足的條件。到滿足的條件。 2021-10-27張星元：

39、發(fā)酵原理（講座） 48 其實，關(guān)于谷氨酸棒桿菌的賴其實，關(guān)于谷氨酸棒桿菌的賴氨酸生產(chǎn)的能量溢出問題已有過爭論氨酸生產(chǎn)的能量溢出問題已有過爭論，賴氨酸生產(chǎn)的最大轉(zhuǎn)化率可能受到，賴氨酸生產(chǎn)的最大轉(zhuǎn)化率可能受到過量的代謝能的約束。賴氨酸的合成過量的代謝能的約束。賴氨酸的合成的高度增加使代謝發(fā)生改變，引起代的高度增加使代謝發(fā)生改變，引起代謝能的過剩。因此，可以認(rèn)為謝能的過剩。因此，可以認(rèn)為高的能高的能量耗散能力適合于代謝中間產(chǎn)物（如量耗散能力適合于代謝中間產(chǎn)物（如氨基酸）的過量合成氨基酸）的過量合成。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 49（5）有關(guān)滲透適應(yīng)性問題：）有關(guān)滲透適應(yīng)性問題： 在

40、分批培養(yǎng)的條件下，醪液中溶在分批培養(yǎng)的條件下，醪液中溶質(zhì)（碳源和能源）的濃度會發(fā)生很大質(zhì)（碳源和能源）的濃度會發(fā)生很大的變化，那么了解和控制有關(guān)滲透適的變化，那么了解和控制有關(guān)滲透適應(yīng)性的代謝過程顯然就相當(dāng)重要了。應(yīng)性的代謝過程顯然就相當(dāng)重要了。細(xì)胞外部滲透壓（實際上是水活度）細(xì)胞外部滲透壓（實際上是水活度）的改變不但對細(xì)胞的代謝，而且對基的改變不但對細(xì)胞的代謝，而且對基質(zhì)的吸收、產(chǎn)物的釋放都會產(chǎn)生有效質(zhì)的吸收、產(chǎn)物的釋放都會產(chǎn)生有效的影響。的影響。 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 50 關(guān)于真細(xì)菌這方面的基本機(jī)制關(guān)于真細(xì)菌這方面的基本機(jī)制的研究，可能促使我們?nèi)ミx育已喪失的研究，

41、可能促使我們?nèi)ミx育已喪失以下兩種能力的菌株：以下兩種能力的菌株： 一是喪失對不利于生產(chǎn)的滲透一是喪失對不利于生產(chǎn)的滲透保護(hù)物質(zhì)（如海藻糖）的合成能力；保護(hù)物質(zhì)（如海藻糖）的合成能力；二是喪失對代謝和輸送反應(yīng)做出滲透二是喪失對代謝和輸送反應(yīng)做出滲透壓響應(yīng)的能力。壓響應(yīng)的能力。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 51 2. 氨基酸生物合成的代謝流量分析氨基酸生物合成的代謝流量分析 除了代謝途徑及其調(diào)節(jié)機(jī)制和除了代謝途徑及其調(diào)節(jié)機(jī)制和已知途徑的化學(xué)計量分析以外，穩(wěn)已知途徑的化學(xué)計量分析以外，穩(wěn)態(tài)代謝流量和流量動力學(xué)分析對于態(tài)代謝流量和流量動力學(xué)分析對于理解氨基酸生產(chǎn)的代謝網(wǎng)絡(luò)也越來理解氨基

42、酸生產(chǎn)的代謝網(wǎng)絡(luò)也越來越重要。越重要。 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 52 這既涉及到提供碳架物質(zhì)這既涉及到提供碳架物質(zhì)、 氧化還原當(dāng)量和代謝能的中心代謝氧化還原當(dāng)量和代謝能的中心代謝途徑，也涉及到那些通往特定氨基途徑，也涉及到那些通往特定氨基酸的合成代謝途徑。代謝流量分析酸的合成代謝途徑。代謝流量分析和代謝流的動力學(xué)分析的一個主要和代謝流的動力學(xué)分析的一個主要目的在于鑒定代謝網(wǎng)絡(luò)中所一般認(rèn)目的在于鑒定代謝網(wǎng)絡(luò)中所一般認(rèn)為的限速步驟。為的限速步驟。 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 53 co2nadp+nadph+nadp+nadph+6-p-gf-6-pfdpd

43、hapga-3-p1,3-2p-ga3-p-ga2-p-gapeppyraccoactascaoaaica -kgsccoafmamlagoaglcg6p6-p-garu-5-px-5-pr-5-pe-4-psed-7-pprppumpctpdtmpampgmpdna,rnaatppr-atppr-ampbbmbbmigppraiciaphpholhisiglu -kgh2opihalnad+nahd+nad+nahd+glngluglu -kgnadph+nh3atpadpadpatpnadph+nadp+piatpadpnad+aspgluargprochotrpprpp ppisergl

44、uprebtyrphegluglusercyss2-so42-alaglugoaglyampgmpprppfig. metabolic pathyways for the biosynthesis of amino acidsfadh2nadh+gtpco2nadh+nadh+co2hisedahpglcpeppyrasaatpadpasp-pnadph+nadp+ddpnadph+nadp+hsethrilemetlysidaph4dscaglu -kgnadph+nh3scaco2lyseorncitgluasp -al -oivavalglunadph+nadp+accoaleugluh

45、2oppspykfppcpckpcodc2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 54 主要可通過兩種不同的方法定量地主要可通過兩種不同的方法定量地、完整地描述細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)：、完整地描述細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)：（1）描述各步反應(yīng)（酶）的動力學(xué)屬）描述各步反應(yīng)（酶）的動力學(xué)屬性及其他有用數(shù)據(jù)的方法；性及其他有用數(shù)據(jù)的方法；（2）直接測定基質(zhì)、產(chǎn)物及一些代表）直接測定基質(zhì)、產(chǎn)物及一些代表性中間產(chǎn)物的方法，如物料平衡性中間產(chǎn)物的方法，如物料平衡 （ 代代謝物平衡）技術(shù)。謝物平衡）技術(shù)。 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 55 如果要對代謝網(wǎng)絡(luò)做出完整描述如果要對代謝網(wǎng)絡(luò)做出完整描述并且對各

46、步反應(yīng)及其代謝物流量的重要并且對各步反應(yīng)及其代謝物流量的重要程度做出評價，就要弄清每一個酶的的程度做出評價，就要弄清每一個酶的的調(diào)節(jié)（包括對酶的活性的調(diào)節(jié)和對表達(dá)調(diào)節(jié)（包括對酶的活性的調(diào)節(jié)和對表達(dá)水平的調(diào)節(jié)）情況，這當(dāng)然是不容易如水平的調(diào)節(jié)）情況，這當(dāng)然是不容易如愿的，但已被實踐證明，以下簡化的策愿的，但已被實踐證明，以下簡化的策略也可以用來對代謝流進(jìn)行定量的描述略也可以用來對代謝流進(jìn)行定量的描述。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 56 第一種方法，在某些場合下用代謝第一種方法，在某些場合下用代謝控制理論來對有關(guān)生物技術(shù)學(xué)的研究進(jìn)控制理論來對有關(guān)生物技術(shù)學(xué)的研究進(jìn)行反應(yīng)動力學(xué)的分析

47、。其基本原理就是行反應(yīng)動力學(xué)的分析。其基本原理就是分析酶活力或酶濃度的微量變化對代謝分析酶活力或酶濃度的微量變化對代謝流量及代謝物濃度的影響，進(jìn)而確定特流量及代謝物濃度的影響，進(jìn)而確定特定的流量控制系數(shù)定的流量控制系數(shù) （ flux control coefficients ），），該系數(shù)反映特定反應(yīng)該系數(shù)反映特定反應(yīng)對復(fù)雜途徑的影響程度。另一種更常用對復(fù)雜途徑的影響程度。另一種更常用的理論是生化系統(tǒng)理論（略）。的理論是生化系統(tǒng)理論（略）。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 57 第二種方法，代謝物平衡技術(shù)。第二種方法，代謝物平衡技術(shù)。其模式的推導(dǎo)建立在對基質(zhì)、產(chǎn)物及其模式的推導(dǎo)建立

48、在對基質(zhì)、產(chǎn)物及某些重要中間產(chǎn)物的直接測定上。這某些重要中間產(chǎn)物的直接測定上。這種方法已在谷氨酸棒桿菌生物合成賴種方法已在谷氨酸棒桿菌生物合成賴氨酸的研究中得到了應(yīng)用。如果所研氨酸的研究中得到了應(yīng)用。如果所研究的代謝網(wǎng)絡(luò)的途徑結(jié)構(gòu)已知，又假究的代謝網(wǎng)絡(luò)的途徑結(jié)構(gòu)已知，又假定進(jìn)行穩(wěn)態(tài)代謝，那么就可通過準(zhǔn)確定進(jìn)行穩(wěn)態(tài)代謝，那么就可通過準(zhǔn)確測得的所有進(jìn)出細(xì)胞代謝流的流量，測得的所有進(jìn)出細(xì)胞代謝流的流量，推導(dǎo)出特定途徑的代謝流量分布。推導(dǎo)出特定途徑的代謝流量分布。 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 58 但用這類方法計算，很難把代謝但用這類方法計算，很難把代謝環(huán)路（環(huán)路（ 如如tca環(huán)環(huán)

49、）、重要節(jié)點(diǎn)（）、重要節(jié)點(diǎn)（ 如如 pyr、 pep 節(jié)點(diǎn)節(jié)點(diǎn) ） 、以及平衡反應(yīng)、以及平衡反應(yīng)（酶促反應(yīng)的正向和逆向流量）的特（酶促反應(yīng)的正向和逆向流量）的特殊重要性包羅在內(nèi)。這是這類方法的殊重要性包羅在內(nèi)。這是這類方法的局限性。為了彌補(bǔ)這種局限性，近年局限性。為了彌補(bǔ)這種局限性，近年已有幾種技術(shù)用到這種類型的分析中已有幾種技術(shù)用到這種類型的分析中去了。去了。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 59 如采用示蹤流量實驗（如采用示蹤流量實驗（tracer flux experiments ）技術(shù)技術(shù)、快速取樣技術(shù)及核磁共振（、快速取樣技術(shù)及核磁共振（nmr）技術(shù)可獲得關(guān)于代謝流分技術(shù)

50、可獲得關(guān)于代謝流分布的另外一些信息，布的另外一些信息， 如代謝網(wǎng)絡(luò)如代謝網(wǎng)絡(luò)的有關(guān)組成部分中的流量分布、的有關(guān)組成部分中的流量分布、 胞內(nèi)不同代謝產(chǎn)物的累積量，胞內(nèi)不同代謝產(chǎn)物的累積量， 以以及它們各自隨時間而變化的情況及它們各自隨時間而變化的情況。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 60 有人分析了谷氨酸棒桿菌在對數(shù)生長有人分析了谷氨酸棒桿菌在對數(shù)生長期、賴氨酸生產(chǎn)期（生物素量足夠）及谷期、賴氨酸生產(chǎn)期（生物素量足夠）及谷氨酸生產(chǎn)期（生物素限量）等條件下胞內(nèi)氨酸生產(chǎn)期（生物素限量）等條件下胞內(nèi)代謝流的不同分布情況（代謝流的不同分布情況（ 下圖），它們下圖），它們以以13c 標(biāo)記的葡

51、萄糖為碳源進(jìn)行分批發(fā)酵標(biāo)記的葡萄糖為碳源進(jìn)行分批發(fā)酵，然后運(yùn)用，然后運(yùn)用 nmr 測定標(biāo)記了的代謝物，測定標(biāo)記了的代謝物，同時運(yùn)用質(zhì)量平衡法進(jìn)行計算，得到了圖同時運(yùn)用質(zhì)量平衡法進(jìn)行計算，得到了圖中的流量分布圖，或稱中的流量分布圖，或稱代謝斷面代謝斷面 （ sections of the metabolism ）圖圖。 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 61glug6pf6pga3ppyrr5pco2oaaco2goabiomass hmp tca co2回補(bǔ) emp1005940733852171351810(60)14 15436133a. 對數(shù)生長期glug6pf6pga3pp

52、yrr5pco2oaaco2goabiomass hmp tca co2回補(bǔ) emp100524783989821341816(80)6 15335215lysco21216244b. 賴氨酸生成期glug6pf6pga3ppyrr5pco2oaaco2goabiomass hmp tca co2回補(bǔ) emp100831731497000322133(25)0 164434411c. 谷氨酸生成期glu552021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 62 由圖可見，在不同條件下，由圖可見，在不同條件下，流量發(fā)生了顯著的變化。酵解途徑流量發(fā)生了顯著的變化。酵解途徑的的 hmp 旁路的流量分布在

53、賴氨酸旁路的流量分布在賴氨酸生成時增加，而在谷氨酸生成時則生成時增加，而在谷氨酸生成時則下降。在氨基酸分泌的情況下，回下降。在氨基酸分泌的情況下，回補(bǔ)反應(yīng)變得更重要一些。補(bǔ)反應(yīng)變得更重要一些。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 63 另一個長期以來不能確定另一個長期以來不能確定的問題也在研究中得到了解決，的問題也在研究中得到了解決，也就是氨基酸生成條件下也就是氨基酸生成條件下 goa 環(huán)活力的問題，在氨基酸生成條環(huán)活力的問題，在氨基酸生成條件下，件下， goa 環(huán)的活力實測是非環(huán)的活力實測是非常低的。常低的。 下圖為在下圖為在不同轉(zhuǎn)化率時的不同轉(zhuǎn)化率時的理論流量分布圖理論流量分布圖。

54、2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 64 g6pf6ppeppyraccoaru5pglcco2oaalys1001511837982100515303317331158520a. 平衡生長g6pf6ppeppyraccoaru5pglcco2oaalys10069499100633512812835b. ylys/glc=35%g6pf6ppeppyraccoaru5pglcco2oaalys100150-5075100-25750075c. ylys/glc=75%co2co2co251252021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 65課外學(xué)習(xí)參考資料：課外學(xué)習(xí)參考資料：me

55、tabolic pathway synthesis (p288)metabolic flux analysis (p309)in metabolic engineering, 1998metabolic flux balance analysis (p13) in metabolic engineering, 19992021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 66 3. 基質(zhì)的跨膜吸收與氨基酸的跨膜輸出基質(zhì)的跨膜吸收與氨基酸的跨膜輸出 基質(zhì)的吸收和產(chǎn)物的輸出對于氨基基質(zhì)的吸收和產(chǎn)物的輸出對于氨基酸的生成是非常重要的。對于某些細(xì)菌酸的生成是非常重要的。對于某些細(xì)菌，特別是大腸桿菌對基質(zhì)吸收的

56、不同機(jī)，特別是大腸桿菌對基質(zhì)吸收的不同機(jī)制已作了詳盡的研究，但對于其它生物制已作了詳盡的研究，但對于其它生物工程有關(guān)的微生物，如谷氨酸棒桿菌的工程有關(guān)的微生物，如谷氨酸棒桿菌的蔗糖及羧酸的吸收機(jī)制則知之甚少。而蔗糖及羧酸的吸收機(jī)制則知之甚少。而關(guān)于產(chǎn)物氨基酸怎樣跨過膜而被分泌出關(guān)于產(chǎn)物氨基酸怎樣跨過膜而被分泌出細(xì)胞的問題，似乎或多或少被忽略掉了細(xì)胞的問題，似乎或多或少被忽略掉了。 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 67 近年的研究表明，在氨基酸生產(chǎn)近年的研究表明，在氨基酸生產(chǎn)的條件下，的條件下， “ 氨基酸被動擴(kuò)散跨過氨基酸被動擴(kuò)散跨過細(xì)胞質(zhì)膜細(xì)胞質(zhì)膜 ” 這一設(shè)想是武斷的。谷這一

57、設(shè)想是武斷的。谷氨酸棒桿菌中至少有谷氨酸、賴氨酸氨酸棒桿菌中至少有谷氨酸、賴氨酸、異亮氨酸及蘇氨酸，以及大腸桿菌、異亮氨酸及蘇氨酸，以及大腸桿菌中谷氨酸和蘇氨酸，都是借助于載體中谷氨酸和蘇氨酸，都是借助于載體的輸送過程，而且不純粹是被動的。的輸送過程，而且不純粹是被動的。而運(yùn)動發(fā)酵單胞菌（而運(yùn)動發(fā)酵單胞菌（zymomonas mobilis）的重組菌株中，丙氨酸則的重組菌株中，丙氨酸則是依靠簡單擴(kuò)散機(jī)制來分泌。是依靠簡單擴(kuò)散機(jī)制來分泌。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 68 詳細(xì)了解特定氨基酸跨過細(xì)胞詳細(xì)了解特定氨基酸跨過細(xì)胞質(zhì)膜滲透屏障的機(jī)理，對于提高發(fā)酵質(zhì)膜滲透屏障的機(jī)理，對于

58、提高發(fā)酵過程的效率和轉(zhuǎn)化率也非常重要。盡過程的效率和轉(zhuǎn)化率也非常重要。盡管采用細(xì)菌來生產(chǎn)氨基酸往往可以獲管采用細(xì)菌來生產(chǎn)氨基酸往往可以獲得極高的胞外氨基酸濃度，人們卻并得極高的胞外氨基酸濃度，人們卻并未意識到這至少部分是由于細(xì)胞向載未意識到這至少部分是由于細(xì)胞向載體系統(tǒng)所催化的分泌反應(yīng)提供了代謝體系統(tǒng)所催化的分泌反應(yīng)提供了代謝能的結(jié)果。這一點(diǎn)已被有關(guān)賴氨酸和能的結(jié)果。這一點(diǎn)已被有關(guān)賴氨酸和異亮氨酸分泌的研究所證實異亮氨酸分泌的研究所證實 。 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 69 下圖顯示了谷氨酸棒桿菌在下圖顯示了谷氨酸棒桿菌在異亮氨酸生產(chǎn)過程中發(fā)生的不同異亮氨酸生產(chǎn)過程中發(fā)生的不

59、同流量。所觀察到的異亮氨酸的凈流量。所觀察到的異亮氨酸的凈產(chǎn)量實際上是借助于載體而形成產(chǎn)量實際上是借助于載體而形成的向外分泌的流量、向內(nèi)吸納的的向外分泌的流量、向內(nèi)吸納的流量及擴(kuò)散流量的代數(shù)和。流量及擴(kuò)散流量的代數(shù)和。 2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 702021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 71 在分批發(fā)酵的開始階段，異在分批發(fā)酵的開始階段，異亮氨酸從胞內(nèi)向胞外擴(kuò)散，但隨亮氨酸從胞內(nèi)向胞外擴(kuò)散，但隨著胞外異亮氨酸濃度的增加，其著胞外異亮氨酸濃度的增加，其擴(kuò)散方向也發(fā)生改變，并越來越擴(kuò)散方向也發(fā)生改變，并越來越多地抵消異亮氨酸載體系統(tǒng)的分多地抵消異亮氨酸載體系統(tǒng)的分泌作用

60、。泌作用。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 72 這一方面解釋了所能獲得的最這一方面解釋了所能獲得的最大胞外濃度取決于異亮氨酸對質(zhì)膜大胞外濃度取決于異亮氨酸對質(zhì)膜的透性常數(shù)，以及分泌和吸收載體的透性常數(shù)，以及分泌和吸收載體的活力；另一方面，由此可看出在的活力；另一方面，由此可看出在生產(chǎn)條件下可能發(fā)生生產(chǎn)條件下可能發(fā)生由代謝能驅(qū)動由代謝能驅(qū)動的分泌與被動回流構(gòu)成的無效循環(huán)的分泌與被動回流構(gòu)成的無效循環(huán)是浪費(fèi)代謝能的是浪費(fèi)代謝能的。2021-10-27張星元：發(fā)酵原理（講座） 73 一般說來，抵消氨基酸的產(chǎn)量的一般說來，抵消氨基酸的產(chǎn)量的氨基酸的吸收系統(tǒng)對于整個過程并不氨基酸的吸收系統(tǒng)