用復(fù)合配基陰離子交換柱去除單克隆抗體

1、52BioFTocessI nternationalFebr uar y 200952BioFTocessI nternationalFebr uar y 2009用復(fù)合配基陰離子交換柱去除單克隆抗體(Mab的污染物蛋白A純化之后的下一步步驟Kjell Eriksson, Anders Ljungl?f, Gustav Rodrigo, and Eggert BrekkanReprinted with perm ission from BioProcess International 7(2)(Fdbruary 2009)52BioFTocessI nternationalFebr uar y

2、 200952BioFTocessI nternationalFebr uar y 2009目前正在開發(fā)中的生物制藥產(chǎn)品中，單克隆抗體（MAb） 在 | 大約占了三成（1）。過去幾十年 對(duì)單克隆抗體需求的持續(xù)增長導(dǎo)致了高 表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的密集開發(fā) （2）。時(shí)至 今日，4-5 g/L的產(chǎn)率已不足為奇，表達(dá) 水平高達(dá)15 g/L甚至更高也時(shí)有報(bào)道。 因此，對(duì)更高效下游處理工藝的需求也 隨之不斷增長。這種需求，再加上縮短 上市時(shí)間的潛力，讓人們對(duì)單克隆抗體 生產(chǎn)（上游及下游）的通用平臺(tái)技術(shù)更 加感興趣?，F(xiàn)在許多單克隆抗體生產(chǎn)廠 家都開始采用這種方法。目前為止，幾乎所有獲批準(zhǔn)的單克 隆抗體工藝都包含

3、一個(gè)蛋白 A的捕獲步 驟。在常規(guī)步驟中，蛋白 A介質(zhì)直接從 澄清的細(xì)胞培養(yǎng)物上清中捕獲單克隆抗 體，它的高選擇性使之可高收率地獲得產(chǎn)品聚焦：單克隆抗體工藝聚焦：下游處理閱讀對(duì)象：工藝開發(fā)、制造關(guān)鍵詞：HCP、多模式性層析、平臺(tái)技術(shù)、多聚物水平：中級(jí)很高純度的產(chǎn)物。因此，蛋白A為大多數(shù)單克隆抗體以通用平臺(tái)技術(shù)進(jìn)行下游 處理的成功奠定了基礎(chǔ)。最近推出的Capto adhere復(fù)合配基 陰離子交換介質(zhì)對(duì)蛋白A分離后殘留的污染物具有高選擇性，只需增加一個(gè)步 驟，就能實(shí)現(xiàn)高效的單克隆抗體下游工 藝開發(fā)（3）。蛋白A介質(zhì)捕獲后的高純度， 再加上Capto adhere介質(zhì)的復(fù)合配基功 能，構(gòu)成了高產(chǎn)的兩步

4、工藝（4,5>單克隆抗體平臺(tái)工具箱 平臺(tái)技術(shù)包含一系列以性質(zhì)相似的同類 分子的純化經(jīng)驗(yàn)為基礎(chǔ)的單元操作、方 法及條件（6-10）。已有20多種獲批準(zhǔn)的 產(chǎn)品以及160多種還在臨床試驗(yàn)中的單 克隆抗體，正是這樣一類分子（1）。所有單克隆抗體生產(chǎn)平臺(tái)技術(shù)的基礎(chǔ)，正是 蛋白A的獨(dú)特選擇性。平臺(tái)技術(shù)能實(shí)現(xiàn)快速而經(jīng)濟(jì)的工藝 開發(fā)和放大。通過縮短開發(fā)時(shí)間，它將 有助于眾多候選藥物通過開發(fā)實(shí)驗(yàn)室。 采用高度類似的通用平臺(tái)技術(shù)也將令從 研發(fā)到生產(chǎn)之間的工藝轉(zhuǎn)換更加可靠、 更加順利。由于單克隆抗體類似但不相同，它們的 平臺(tái)也就不能在細(xì)節(jié)上完全固定，必須 要靈活。因此，蛋白 A步驟后的層析步GE HEAI

5、卩C ARE iWWW.GE LIF E5CENCK.COM)驟可能在次序上有所改變，或工藝間存 在微小的差異。為此，可以采用工具箱 的概念（圖1）來建立有效的單克隆抗體 純化工藝。為了獲得最佳結(jié)果，優(yōu)化單克隆抗 體工藝的每個(gè)步驟是非常重要的，包括 蛋白A捕獲步驟。盡管 MabSelect和 MabSelect Xtra系列在單克隆抗體純化 平臺(tái)上效果也很好，我們推薦的平臺(tái)包 括用MabSelect SuRe蛋白A介質(zhì)進(jìn)行捕 獲。MabSelect SuRe產(chǎn)品包含耐堿性的、 源自蛋白A的配基，可以耐受0.1-0.5 M NaOH作為在位清洗（CIP）的試劑，52BioFTocessI nte

6、rnationalFebr uar y 200952BioFTocessI nternationalFebr uar y 2009圖2： Capto adhere 配基 N-苯甲基-N甲基 乙醇胺可參與幾種類型的相互作用，最主要 的是離子相互作用、氫鍵和疏水作用。圖1:單克隆抗體層析樹脂工具箱*WO 2004/485 , Lonza專利應(yīng)用，與一個(gè)包括蛋白A處理后進(jìn)行陰離子交換層析的工藝相關(guān)。細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞去除MabSelect SuRe54B oRocessI nternationalFebr uar y 2009Capto Adhere病毒滅活與過濾Capto AdhereSP Sephar

7、ose FF/Capto S）心最終過濾超濾0.2 g過濾除菌Capto QCapto Adhere污染物/步蛋白A洗脫物L(fēng)RF:Capto adhere污染物清除HCP500-10,000ppm2-3蛋白A5-10ppm2-3DNA10-1,000ppb3-4病毒N/AMVM5.5-6.5MuLV3.5-5.0聚集的單克隆抗體1-20%1-2表1：在蛋白A捕獲后用Capto adhere樹脂預(yù)期能去除的污染物概覽（MVW=小鼠微小病毒；“=鼠源白血病病毒；LRF數(shù)下降值）病毒電導(dǎo)率（mS/cm ）LRFMVM10>5.8MVM30>5.9MuLv104.5± 0.4Mu

8、Lv303.6± 0.4表2： Capto adhere多模式陰離子交換劑去除病毒的效率；在 pH 6.75 時(shí)，小鼠微小病毒（MVM）及鼠源白血病病毒（MuLV）與IgG單克隆 抗體一起進(jìn)樣并用穿流模式通過 （flow-through ） Capto adhere多模式 陰離子交換劑（LRF=S 95%置信區(qū)間的對(duì)數(shù)下降值）。因此比其他蛋白A介質(zhì)具有更長的使用 壽命（11,12）。就蛋白水解而言，這種配基 比常規(guī)（天然或重組）的蛋白 A配基更 穩(wěn)定，從而進(jìn)一步減少了配基脫落。此 外，對(duì)于多種單克隆抗體和 Fc融合蛋白， 配基不與Fab結(jié)合意味著允許更廣泛的 洗脫條件如pH（13）。

9、以上種種都促進(jìn)了通用平臺(tái)技術(shù)的推廣。以MabSelect SuRe為代表的蛋白 A介質(zhì)所具有的獨(dú)特選擇性使得兩步層析 工藝成為可能。這些工藝已有報(bào)道（14,15）。復(fù)合配基陰離子交換劑通用電氣醫(yī)療集團(tuán)的Capto adhere陰離子交換劑提供專為單克隆抗體工藝中蛋 白A捕獲后純化而設(shè)計(jì)的多種模式功能。 蛋白A捕獲后的產(chǎn)物穿流（flow-through 通過Capto adhere介質(zhì)，殘留在產(chǎn)品中 的污染物結(jié)合在Capto adhere介質(zhì)而被 去除。圖2展示了 Capto adhere 配基：N-苯甲基-N甲基乙醇胺。此配基顯示多 種不同的相互作用模式，最主要是離子 相互作用。但其他形式的相

10、互作用如氫 鍵和疏水作用也有參與。復(fù)合配基的陰離子交換劑與傳統(tǒng)的強(qiáng)陰離子交換劑（如 Q-types ）相比，有 著不同的選擇性。圖 3比較了 Capto adhere和Capto Q介質(zhì)對(duì)5種不同單克隆抗體在結(jié)合-洗脫模式下的PH洗脫范 圍。兩者的洗脫順序相同，但是Captoadhere上產(chǎn)品洗脫的pH低很多。這表 明額外的相互作用及復(fù)合配基功能導(dǎo)致 了不同的選擇性。Capto adhere介質(zhì)最初是為單克隆抗體 純化而設(shè)計(jì)，最近也有報(bào)道稱它成功應(yīng) 用于Fc融合蛋白的純化（16）。此外也不 能排除復(fù)合配基陰離子交換劑在其他方 面的應(yīng)用，如純化其他類型重組蛋白的 純化。條件優(yōu)化在單克隆抗體的純化

11、過程中，Capto adhere介質(zhì)應(yīng)用于蛋白A處理后，以去 除殘留的污染物。在一定的條件下，采 用穿流（flow-through ）的方式，令抗體 直接通過柱子，而污染物被吸收，即可很好地去除殘留污染。在穿流 （flow-through ）方式中，進(jìn)樣條件應(yīng)該在收率優(yōu)先和清除污染物優(yōu)先的條件之 間進(jìn)行折衷。因此進(jìn)樣條件需要優(yōu)化， 以便在收率和純度間找到一個(gè)平衡。使用統(tǒng)計(jì)學(xué)的 design of experiments （DoE）Captc Adhere8765410 20 30即可很好地完成進(jìn)樣條件的優(yōu)化。在優(yōu)化Capto adhere 的進(jìn)樣條件 時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)上樣量、pH值和電導(dǎo)率是 最關(guān)

12、鍵的因素。優(yōu)化這些參數(shù)可同時(shí)影 響收率和污染物的去除。在DoE中，所有因素以結(jié)構(gòu)化的方式同時(shí)改變。常用 的方法是確定一個(gè)對(duì)照試驗(yàn)（中心點(diǎn)）， 并圍繞這個(gè)點(diǎn)進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)。Txi kb ,rh圖5:收率和宿主細(xì)胞蛋白（HCP）、二聚體/聚集物（D/A）、以及脫落的蛋白 A去除的反應(yīng)面范例收率BOF.07.5SO二聚體/聚集物Capto Q圖3： Capto adhere和Capto Q樹脂對(duì)5種不同抗體的洗脫比較?？贵w洗脫的順序相同，而CaptoQ更早洗脫（在更高 pH）。兩者是在不同 pH梯度范圍內(nèi)洗脫的（Capto adhere樹脂是pH 6.2-4.9 , Capto Q 樹脂則是 pH 9

13、.9-6.2）DoE范例：起始物質(zhì)是澄清的、包含單 克隆lgG1的細(xì)胞培養(yǎng)物上清。在用蛋白 A層析捕獲后，在低pH條件下進(jìn)行病毒 滅活。接著以穿流（flow-through ）的方 式經(jīng)過Capto adhere介質(zhì)做進(jìn)一步精細(xì) 純化。以三種變量（上樣量、pH值和電 導(dǎo)率）和三個(gè)中心點(diǎn)建立全因子設(shè)計(jì)， 以便了解對(duì)收率和關(guān)鍵污染物去除的影 響。關(guān)鍵污染物包括：宿主細(xì)胞蛋白佰主細(xì)胞蛋白蛋白A圖4:優(yōu)化進(jìn)樣條件的全因子設(shè)計(jì)（進(jìn)樣量在75-300 mg/ml 之間，pH 6 - 8,電導(dǎo)率在 2-15 mS/cm之間）（HCP）、二聚體/聚集物（D/A）、以及脫 落的蛋白A （圖4）。分別針對(duì)收率、H

14、CP、D/A以及脫落 的蛋白A的清除創(chuàng)建了不同的模型（圖 5）。反應(yīng)面顯示了上樣量、pH和電導(dǎo)率 如何影響不同的反應(yīng)，以及如何達(dá)到每 一個(gè)的理想值。根據(jù)以下接受標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行 最佳點(diǎn)分析：在上樣量>100 g/L介質(zhì)時(shí)， 穿流（flow-through ）的收率應(yīng)該>90%， HCP<50 ppm , D/A <1%，脫落的蛋白 A<5 ppm。最佳點(diǎn)（圖6）是指在某一點(diǎn)（紅 色）能同時(shí)達(dá)到收率和污染物去除的目 標(biāo)。由于HCP和蛋白A去除的目標(biāo)在整個(gè) 實(shí)驗(yàn)空間中均可完成，因此此例中的優(yōu) 化集中在收率和D/A去除。T3上樣量300 mg/mL- ：jri； |.:-C I

15、三'：I! :'：I-'：I. I；圖6：包含實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的最佳 點(diǎn)分析54B oRocessI nternationalFebr uar y 2009操作Capto adhere分離是以讓抗體直接流過 柱子同時(shí)污染物被吸收的方式進(jìn)行。其 中一種需要降低或去除的污染物就是以 聚集物形式存在的單克隆抗體本身。利 用Capto adhere介質(zhì)不僅能降低聚集物 的量，還能減少其他關(guān)注的污染物，如 HCP、DNA、蛋白A和病毒。表1概括了 蛋白A捕獲后用復(fù)合配基陰離子交換劑 預(yù)計(jì)能去除的污染物。病毒去除效率倍受關(guān)注。因此進(jìn)行 了一項(xiàng)有關(guān)去除小鼠微小病毒(MVM) 和

16、鼠源白血病病毒(MuLV)的研究。表 2展示了研究結(jié)果。兩種病毒模型均可在 較高和較低的離子強(qiáng)度下被有效去除。 而傳統(tǒng)的陰離子交換劑如Q介質(zhì)，則不能在較高離子強(qiáng)度下很好地清除病毒。Two-Step ProcessYield (%)Protein A ppm)HCP (ppm)Start material spiked with HCP100130,000MabSelect SuRe95Q.7<155Capto adhere95<0.1ND7,5Table 3: In support of Figure 7 (HCP 一 host cell protein； D/A 一 dimers

17、/aggregates； ND = not determined)將蛋白A介質(zhì)的高選擇性與 Capto adhere陰離子交換劑的獨(dú)特去污染特性 相結(jié)合，使許多純化步驟從三步層析縮 減到兩步成為可能。要想在實(shí)踐中實(shí)現(xiàn) 這個(gè)目標(biāo)，最關(guān)鍵之處在于：不僅要優(yōu) 化復(fù)合配基的陰離子交換劑，還要優(yōu)化 最初的捕獲步驟。最新開發(fā)的MabSelect SuRe介質(zhì)正是此目的的最佳選擇。這種 堿性穩(wěn)定的配基能用 NaOH進(jìn)行在位清洗。它的關(guān)鍵優(yōu)勢是已經(jīng)證實(shí)使用壽命 長，高動(dòng)態(tài)結(jié)合能力和低配基脫落(11, 1217, 18)。為了進(jìn)一步優(yōu)化捕獲步驟，在某 些情況下需要再增加中間的清洗步驟， 以便在洗脫前去除松散結(jié)合

18、的污染物 (19)。圖7顯示了對(duì)一種單克隆抗體進(jìn)行 兩步純化的實(shí)例。起始物質(zhì)是澄清的中 國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞上清，添加宿 主細(xì)胞蛋白(HCP)。利用MabSelect SuRe 蛋白A介質(zhì)進(jìn)行抗體捕獲。在進(jìn)樣之后， 用pH 7.0的20 mM磷酸鈉、5% 異丙醇 和0.5 M NaCl進(jìn)行中間的清洗步驟。對(duì) 沖洗組分的分析表明它主要含有抗體聚 集物和HCP (19)。隨后用pH 3.4的檸檬 酸鈉進(jìn)行單克隆抗體的洗脫。HCP濃度從130,000 ppm降低到55 ppm，殘留的 聚集物含量為 0.7%。MabSelect SuRe洗 脫物接著穿流(flow-through)經(jīng)過Capto

19、adhere陰離子交換介質(zhì)以進(jìn)行進(jìn)一步純 化。從結(jié)果中可以看出，污染物的去除 效果非常好。HCP水平減低至10 ppm， 而聚集物和脫落的蛋白A水平都降至檢測極限以下。兩步層析工藝與三步處理過程相 比，有著顯而易見的優(yōu)勢：步驟減少能 提高收率并縮短處理時(shí)間，即意味著更 高的生產(chǎn)率(單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的產(chǎn)物克 數(shù))。兩步平臺(tái)工藝還提高了工藝的經(jīng)濟(jì) 性。此外，需要使用的層析介質(zhì)減少， 儀器和緩沖液用量也減少，而生產(chǎn)企業(yè) 所需的占地面積也可減少。當(dāng)從生產(chǎn)率 和工藝經(jīng)濟(jì)的角度進(jìn)行工藝優(yōu)化時(shí)，遵 循精益概念是非常有益的。減少浪費(fèi)、 原料尤其是時(shí)間，將實(shí)現(xiàn)更有效的生產(chǎn) (20)。正如本文描述的，Capto a

20、dhere通 常以穿流(flow-through )的方式進(jìn)行， 但在某些情況下，以結(jié)合-洗脫的方式可 能更為有利(16)。此外，某些單克隆抗體 制備包含 的抗體片段水平(fragment levels)對(duì)于最終產(chǎn)物來說過高。單克隆 抗體片斷與此介質(zhì)的結(jié)合力較弱，因此 能與單體單克隆抗體分離開。二聚體和 其他聚集物的結(jié)合力要強(qiáng)得多，因而會(huì) 在單體單克隆抗體之后被洗脫下來。以結(jié)合-洗脫的方式使用這種復(fù)合 配基陰離子交換劑在某些情況下具有一 些優(yōu)勢。不過它也有著明顯缺陷：載樣 量。穿流(flow-through )方式的載量通 常為100-300 g/L介質(zhì)；而結(jié)合-洗脫方 式僅為25-40 g/

21、L。然而，能夠以結(jié)合- 洗脫的方式使用Capto adhere介質(zhì)，使 之可以在某些特殊的情況下，如需要利 用Capto adhere介質(zhì)的獨(dú)特選擇性或純 化蛋白不是單克隆抗體時(shí)，為純化提供 另一種選擇。民buay 2009BoRocesslnternational55民buay 2009BoRocesslnternational55圖7:從CHO細(xì)胞培養(yǎng)物中純化單克隆抗體(MabSelect SuRe捕獲步驟之后以穿流(flow-through )方式通過 Capto adhere)民buay 2009BoRocesslnternational55through mode is often

22、100- 300 g/L 11 Hahn R. Comparison of Protein Aresin; in bind- elute mode it will be in Affinity Sorbents III: Life Time Study. J.56 BioProcess Intern ati onalFebruary2009Chromatogr. A 1102, 2006: 224- 231.12 Hober S, et al. Protein AChromatography for Antibody Purification. J. Chromatogr. B 848, 20

23、07: 40- 47.13Ghose G, et al. Antibody VariableRegion Interactions with Protein A:Implications for the Development of GenericPurification Processes. Biotechnol. Bioeng.92(6) 2005: 665- 673.14 Vunnum S, et al. Anion ExchangePurification of Monoclonal Antibodies:Principles of Weak Partitioning Chromato

24、graphy. 232nd ACS national Meeting 10 - 14 September 2006 (San Francisco, CA);American Chemical Society, .15 Kelley B. Very Large Scale MonoclonalAntibody Purification: The Case forConventional Unit Operations. Biotechnol.Prog. 23(5) 2007: 995- 1008.16 Rea DW, et al. Solutions forPurifica

25、tion of Fc-fusion Proteins. BioPharmInt. supplement, March 2008: 20- 25.17 Johansson HJ. Advances in thePurification of Monoclonal Antibody Based Therapeutics. Antibody Development and Production 1 - 3 March 2006 (Carlsbad, CA); IBC Life Sciences, .18 Jagschies G, et al. Technical andEconomical Eval

26、uation of DownstreamProcessing Options for Monoclonal Antibody (MAb) Production. BioPharm Int. supplement, June 2006: 10- 19.19 Gr?nberg A, et al. A Strategy forDevelopment of a MAb Purification Platform (poster). BioProcess International EuropeanConference 20 - 23 February 2006 (Prague,Czech Republ

27、ic); IBC Life Sciences, www. informa-. Also BioProcess Int.5(1) 2007: 48 - 54.20 Jagschies G, et al. Modern Tools and LEAN Concepts for Manufacturing Flexibility. BioPharm Int. (in press). cCorresponding author Kjell Eriksson is a senior scientist in Life Sciences R&D at GE Healthcare Bio-Scienc

28、es AB, Bj?rkgatan 30, SE-751 84 Uppsala, Sweden; 46-186120539, kjell.eriksson; www. Anders Ljungl?f,Gustav Rodrigo, and Eggert Brekkan are all scientists at Ge Healthcare. Capto,MabSelect, MabSelect SuRe, MabSelect Xtra and Sepharose are trademarks of GEHealthcare companies. Figures 1- 7 ?2008GE Hea

29、lthcare, reproduced with permission.the range 25- 40 g/L. However, thepossibility of using Capto adhere resin in bind - elute mode should make it an interesting alternative for cases in which its unique selectivity is required also for proteins other than MAbs.r eferences1 Roque ACA, et al. Antibodi

30、es andGenetically Engineered Related Molecules: Production and Purification. Biotechnol. Prog. 20(3) 2004: 639- 654.2 Birch JR, Racher AJ. Antibody Production. Adv. Drug Deliv. Rev58, 2006: 671 - 685.3 Johansson B-L, et al. Preparation and Characterization of Prototypes for MultiModal Separation Aim

31、ed for Capture of Positively Charged Biomolecules at High-Salt Conditions. J. Chromatogr. A 1016(1) 2003: 35 - 49.4 Johansson HJ, et al. Multi-Modal Chromatography for Purification ofMonoclonal Antibodies (poster). Recovery of Biological Products XII2 - 7 April 2006, (Phoenix, AZ). American Chemical Society Biotechnology Division; www. recovery