北大醫(yī)學(xué)部激光掃描共焦顯微鏡與流式細(xì)胞總結(jié)

1、 激光掃描共焦顯微鏡與流式細(xì)胞總結(jié)共焦部分1、 根據(jù)激光掃描共聚焦顯微鏡（Confocal）的工作原理，說(shuō)明：1、 為什么Confocal能夠逐層采集熒光樣品的一系列高清晰光學(xué)切片？Confocal 利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測(cè)器前的探測(cè)針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測(cè)，來(lái)自光源的光通過(guò)照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測(cè)針孔內(nèi)，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測(cè)針孔阻擋。照明針孔與探測(cè)針孔對(duì)被照射點(diǎn)或被探測(cè)點(diǎn)來(lái)說(shuō)是共軛的，因此被探測(cè)點(diǎn)即為共焦點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面即為共焦平面。計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測(cè)點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描

2、系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺(tái)沿著Z軸上下移動(dòng)，將樣品新的一個(gè)層面移動(dòng)到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動(dòng)，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。2、 如何實(shí)現(xiàn)時(shí)間動(dòng)態(tài)程序監(jiān)測(cè)？將樣品固定在同一個(gè)觀察視野，利用動(dòng)態(tài)時(shí)間程序軟件，按照一定的時(shí)間間隔，自動(dòng)采集某時(shí)間段內(nèi)該視野的一系列圖像，并定量測(cè)定相關(guān)參數(shù)的隨著時(shí)間的變化。特點(diǎn)：快速跟蹤毫秒級(jí)變化。具體操作如下：1） 在顯微鏡下找到活細(xì)胞；2） 調(diào)節(jié)掃描狀態(tài)，獲得滿意圖像；3） 把Mode改成XYT；4） 設(shè)定加藥時(shí)間是否也需要寫(xiě)先測(cè)量一個(gè)基準(zhǔn)的？，加藥后觀察時(shí)間；5） 開(kāi)始程序，自動(dòng)完成程

3、序。2、 如何利用Confocal實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化？（1）將細(xì)胞種在共焦小皿中，（2）將用FLuo3等銀光染料標(biāo)記好樣本，在顯微鏡下找到合適的細(xì)胞。（3）確定采集圖像的條件，包括針孔的大小、光電倍增管的增益、濾片系統(tǒng)的選擇、掃描速度和掃描密度等，掃描速度和掃描密度要精心選擇，它直接影響采樣頻率，即會(huì)影響測(cè)量結(jié)果。（4）根據(jù)細(xì)胞種類和所加的藥物等實(shí)驗(yàn)要求，確定采集頻率，即采集每一幅圖像的間隔時(shí)間。當(dāng)需要采樣頻率較高時(shí)，采集每一幅圖像的時(shí)間間隔可設(shè)定為零，此時(shí)采樣頻率的快慢取決于掃描速度和掃描密度。如果仍然不能滿足Ca2快速變化的要求，應(yīng)加快掃描速度和減少掃描密度，或采用線掃描。然后根據(jù)掃

4、描的總時(shí)程，確定共需采集多少幅圖像。（5）開(kāi)始采集圖像，加藥前采集1分鐘作為靜息水平對(duì)照，加藥后繼續(xù)掃描。程序設(shè)定加藥的等待時(shí)間。（6）采集圖像之后或采集之前，勾畫(huà)感興趣的細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)某個(gè)區(qū)域（核周、胞漿、胞核或突起等），計(jì)算機(jī)會(huì)描繪出時(shí)間熒光強(qiáng)度曲線。3、 影響所采集圖像熒光強(qiáng)度的參數(shù)主要有哪些？1、 物鏡性能：放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑、分辨率、景深-焦點(diǎn)深度、鏡像高度、物鏡工作距離、視野范圍；2、 激發(fā)光波長(zhǎng)/強(qiáng)度；3、 發(fā)射波長(zhǎng)范圍/強(qiáng)度；4、 檢測(cè)器靈敏度；5、 Pinhole大??；6、 聚焦程度；7、 其他（可以不答）：甘油、蓋片數(shù)等。4、 在Hoechst 33258、DAPI、PI（p

5、ropidium iodide，碘化丙叮）、AO（acridine orange，吖啶橙）這四種核酸探針中（1） 要特意地標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)的DNA，應(yīng)該選擇哪種核酸探針？ Hoechst 33258（定位于細(xì)胞核）、AO（2） 若要特意地標(biāo)記固定（死）的細(xì)胞內(nèi)的DNA可選擇哪種核酸探針？ DAPI（半通透細(xì)胞半通透細(xì)胞是死是活？我覺(jué)得是死！，定位于細(xì)胞核）、PI顯微鏡部分1、 物鏡的數(shù)值孔徑及意義。（1） 物鏡的數(shù)值孔徑：是物鏡與樣品之間介質(zhì)的折射率(n)和1/2孔徑角（u）的正弦值的乘積。 NA=n×Sin u（2） 意義：數(shù)值孔徑是物鏡最重要的參數(shù)之一，它直接影響物鏡的分辨率和物鏡的

6、鏡像亮度。NA越大越好。2、 顯微鏡有幾種性能指標(biāo)？了解各種性能指標(biāo)的意義。(1) 數(shù)值孔徑：物鏡的最重要的參數(shù)之一，直接影響物鏡的分辨率和物鏡的鏡像亮度。(2) 分辨率：區(qū)分物平面兩個(gè)點(diǎn)間最小距離為分辨距離即分辨率。它代表分辨微細(xì)結(jié)構(gòu)的本領(lǐng)。(3) 放大率：放大率等于物鏡放大率乘以目鏡放大率。(4) 景深-焦點(diǎn)深度：景深表示清晰的像平面所能對(duì)應(yīng)物平面前后空間的深度（或指焦點(diǎn)與樣品上某點(diǎn)相一致時(shí)，能看清這一點(diǎn)及其上下兩側(cè)的結(jié)構(gòu)）。那么，清晰部分的厚度即為景深，也稱為焦點(diǎn)深度。(5) 鏡像亮度：顯微圖像亮度。(6) 物鏡工作距離：物鏡工作距離越長(zhǎng)，NA越小。(7) 視野范圍：鏡下看到的目鏡光闌所

7、圍的圓，其直徑為視野寬度。3、 按校正像差分類，物鏡有幾種等級(jí)標(biāo)識(shí)？每一種標(biāo)識(shí)的意義.（1） 消色差物鏡：校正了球差，彗差和二種色光的位置色差。物鏡外殼沒(méi)有特殊標(biāo)記。（2） 平場(chǎng)消色差物鏡：在消色誤差鏡的基礎(chǔ)上還矯正了像散和場(chǎng)曲，像面平坦。物鏡外殼標(biāo)有PL或N PLAN字樣。（3） 半平場(chǎng)消色誤差鏡：清晰范圍介于消色誤差鏡和平場(chǎng)消色誤差鏡之間，但明顯優(yōu)于消色誤差經(jīng)，接近平場(chǎng)消色誤差鏡。外殼刻有C PLAN.（4） 平場(chǎng)半復(fù)消色誤差鏡：色差的校正程度介于平場(chǎng)消色誤差鏡與平場(chǎng)復(fù)消色誤差鏡之間?？逃蠵LFLUOTAR,此類物鏡通常作為觀察熒光的物鏡來(lái)使用。（5） 平場(chǎng)復(fù)消色誤差：它在平場(chǎng)消色誤差鏡的

8、基礎(chǔ)上，還對(duì)第三種色光校正了位置色差，這種物鏡成像最佳，數(shù)值孔徑也較同倍率物鏡大。外殼刻有PL APO4、 熒光顯微鏡光路中的濾片有幾種？各自在熒光光路中的作用。（1） 激發(fā)濾片：位于光源和物鏡之間，作用是選擇適于特定熒光物質(zhì)的激發(fā)波長(zhǎng)。 （2）二色光分光鏡：它的放置方向與激發(fā)光的方向呈450，位于激發(fā)光濾片和發(fā)射光濾片之間，具有特征值M（Leica顯微鏡用RKP表示）。波長(zhǎng)短于M的光被反射，波長(zhǎng)大于M的光可通過(guò)，也就是說(shuō)它對(duì)激發(fā)光具有高反射率，而對(duì)激發(fā)出的熒光具有高透過(guò)率，它是分離激發(fā)光（短波長(zhǎng)）和發(fā)射熒光（長(zhǎng)波長(zhǎng)）的一個(gè)重要組件。 （3）阻擋濾片：位于目鏡之前。其作用是進(jìn)一步使發(fā)射熒光與激

9、發(fā)光分離，以獲得更純的發(fā)射熒光。 圖像部分 模擬圖像與數(shù)字圖像的區(qū)別，數(shù)字圖像的特點(diǎn)。（理解即可）（1）模擬圖像 a. 定義：圖像是用各種觀測(cè)系統(tǒng)以不同形式和手段觀測(cè)客觀世界而獲得的，可以直接或間接作用于人眼并進(jìn)而產(chǎn)生視知覺(jué)的實(shí)體。 b. 存在形式：常見(jiàn)的各種照片、 圖片、海報(bào)、廣告畫(huà)等均屬模擬圖像.醫(yī)學(xué)中的圖像包括組織胚胎學(xué)、病理學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、放射學(xué)、超聲、X線、CT、磁共振、PET、電子顯微術(shù)和熱像等圖像。如果把圖形（如心電圖、腦電圖等）都包括進(jìn)去，則幾乎醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床診斷就離不開(kāi)圖像（形）了。 （這個(gè)記住幾個(gè)就成）c. 函數(shù)表示：f (x,y,t) x,y 表示圖像

10、在某點(diǎn)的坐標(biāo) f (x,y) 表示圖像在(x,y)點(diǎn)的強(qiáng)度（亮度） （2）數(shù)字圖像 a. 定義：將模擬圖像變換成為計(jì)算機(jī)能夠處理的數(shù)字矩陣或數(shù)組被稱為數(shù)字圖像。 b. 存在形式：必須以數(shù)字格式存儲(chǔ) c. 函數(shù)表示： 數(shù)字圖像的特點(diǎn)：便于計(jì)算機(jī)處理分析；圖像損失低；抽象性強(qiáng)。（不確定）2. 圖像處理與分析的主要內(nèi)容： 改善圖像的質(zhì)量-“圖像圖像” 模糊圖像 經(jīng)圖像增強(qiáng)、消除噪聲 清晰圖像 使圖像的質(zhì)量得到改善 圖像處理：從圖像到圖像的變換。以完善圖像的視覺(jué)效果為目標(biāo) 描述圖像的目標(biāo)特征-“圖像描述” 目標(biāo)：把對(duì)圖像中感興趣的某些區(qū)域稱為目標(biāo)。 圖像 經(jīng)圖像分割獲取目標(biāo) 對(duì)圖像中 并進(jìn)行特征參數(shù)的

11、測(cè)量 某些特征的描述 圖像分析：從圖像到特征描述的變換。著重對(duì)圖像中感興趣的目標(biāo)進(jìn)行特征提取 三維結(jié)構(gòu)的重建 -“描述圖像” 對(duì)一個(gè)立體結(jié)構(gòu)按一定的方向，一定的間隔，連續(xù)切出二維斷面，通過(guò)對(duì)二維圖像的描述，再返推出三維圖像。 CT就是圖像重建處理的典型應(yīng)用實(shí)例3.圖像分析系統(tǒng)硬件組成主要包括四個(gè)部分： 輸入系統(tǒng) 主要包括：顯微鏡 宏觀器 CCD攝像頭 解剖鏡 (小鼠的椎骨、牙) CCD（Charge coupled Device ）電荷耦合器件 CCD 可以將照射在其上的光信號(hào)轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的電信號(hào)。 圖像采集系統(tǒng)-圖像采集卡 計(jì)算機(jī) 輸出系統(tǒng)：主要包括：顯示器、打印機(jī)、顯微照相、軟盤(pán)、硬盤(pán)、光盤(pán)

12、、U盤(pán)等4.圖像數(shù)字化原理主要包括什么？如何計(jì)算圖象的大??？（1）圖像數(shù)字化就是指把一幅灰度隨空間位置作連續(xù)變化的圖像變換成一幅離散的數(shù)字圖像的過(guò)程。包括兩個(gè)方面：空間采樣、灰度量化 空間采樣的定義: 把一幅連續(xù)圖像在空間上用M*N個(gè)樣本點(diǎn)表示的方法稱為空間采樣。 灰度量化定義：將灰度從黑到白分成若干等級(jí)，這種方法稱為灰度量化。（2）不知道啊 是不是就是M*N？5.掌握霍夫曼（Huffman）編碼（一定要掌握）1）基本思想：通過(guò)減少編碼冗余來(lái)達(dá)到壓縮的目的。 統(tǒng)計(jì)符號(hào)的出現(xiàn)概率，建立概率統(tǒng)計(jì)表.將在圖像中出現(xiàn)頻度大的像素值,給一個(gè)比較短的編碼，將出現(xiàn)頻度小的像數(shù)值,給一個(gè)比較長(zhǎng)的編碼2）步驟：

13、 按照概率從大到小排列 將兩個(gè)最小概率相加，形成一個(gè)新的概率集合 再將它們按照大小排列，依此方法做下去 最后縮減到兩個(gè)概率時(shí)就停止 從最后兩個(gè)概率開(kāi)始逐步向前進(jìn)行編碼，如對(duì)概率大的賦予碼元0，對(duì)概率小的賦予碼元1。注：如遇等概率時(shí)，可任意排列例題:：信號(hào)源 s=s1, s2, s3, s4, s5, s6，其概率分布為 p1=0.4 p2=0.3 p3=0.1 p4=0.1 p5=0.06 p6=0.04， 求最佳Huffman碼 沒(méi)看懂碼字：S1=1 S2 =00 、S3=011、S4 =0100 S5=01010、S6 =01011碼長(zhǎng)：S1 =1、S2 =2 、S3 =3 、S4=4 S

14、5=5、S6 =5平均碼長(zhǎng)=各自碼長(zhǎng)*概率的和=1*0.4+2*0.3+3*0.1+4*0.1+5*0.06+5*0.04=2.20（bit）6了解灰度直方圖、灰度變換、直方圖均衡化、圖像的平滑、圖像的銳化（了解就好了，老師說(shuō)不用背）（1）定義：用橫坐標(biāo)表示灰度級(jí)，縱坐標(biāo)表示圖像中該灰度級(jí)出現(xiàn)的個(gè)數(shù)（像素個(gè)數(shù)）。即對(duì)一幅數(shù)字圖像進(jìn)行各灰度級(jí)像素?cái)?shù)的統(tǒng)計(jì)，就可以得出圖像的灰度直方圖。 性質(zhì)：直方圖實(shí)際是一幅圖像中各個(gè)像素灰度值出現(xiàn)次數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，它僅僅反映了圖像中不同灰度值出現(xiàn)的次數(shù),但是不能反映某一灰度值像素所在圖像中的位置。(所有的空間信息全部丟失) 圖像與直方圖之間存在著多對(duì)一的映射關(guān)系。

15、任意一幅圖像，能夠唯一求出一幅與之對(duì)應(yīng)直方圖，但是不同的圖像，可能會(huì)有相同的直方圖。 一幅圖像各個(gè)子區(qū)的直方圖之和應(yīng)當(dāng)?shù)扔趯?duì)應(yīng)全圖的直方圖。 （2）灰度變換：灰度變換是將一個(gè)灰度區(qū)間映射到另一個(gè)灰度區(qū)間的變換?；叶茸儞Q可改變圖像動(dòng)態(tài)范圍，圖像對(duì)比度擴(kuò)展，顯示效果更加清晰，是圖像增強(qiáng)的重要手段。包括線性變換、非線性變換。圖像求反 g(x,y)=255-f(x,y)改變圖像動(dòng)態(tài)范圍 將感興趣的灰度范圍線性擴(kuò)展，相對(duì)抑制不感興趣的灰度區(qū)域 對(duì)數(shù)變換 擴(kuò)展低灰度區(qū)，壓縮高灰度區(qū) 指數(shù)變換 擴(kuò)展高灰度區(qū) ，壓縮低灰度區(qū)（3）直方圖均衡化：對(duì)在圖像中像素個(gè)數(shù)多的灰度級(jí)進(jìn)行展寬，而對(duì)像素個(gè)數(shù)少的灰度級(jí)進(jìn)行縮

16、減，從而達(dá)到圖像清晰的目的。直方圖均衡化就是把給定圖像的直方圖分布改變成“均勻”分布直方圖分布。（4）圖像的平滑：抑制或消除圖像噪聲而改善圖像質(zhì)量的過(guò)程稱為對(duì)圖像的平滑過(guò)程。圖像噪聲是圖像在采集或傳輸時(shí)所受到的隨機(jī)干擾信號(hào)。反映在圖像上，噪聲使原本均勻和連續(xù)變化的灰度突然變大或減小，形成一些虛假的物體邊緣或輪廓。中值濾波鄰域平均法 多幅圖像疊加法（5）圖像的銳化：加強(qiáng)圖像中景物的細(xì)節(jié)邊緣和輪廓（位于灰度突變的地方，可用微積分運(yùn)算銳化圖像）7、掌握中值濾波定義及實(shí)現(xiàn)過(guò)程。（重點(diǎn)，得會(huì)算一維的中值濾波）【答】：I中值濾波法是一種非線性平滑技術(shù)，指把圖像中一點(diǎn)的灰度值用該點(diǎn)的一個(gè)鄰域中各點(diǎn)值的中值代

17、替，既可以去除噪聲又可以有效地保護(hù)圖像的邊緣。II.經(jīng)典的中值濾波算法實(shí)現(xiàn)過(guò)程如下：第一步：選擇一個(gè)（2N+1）*（2N+1）的窗口（通常為3*3或5*5），并用該窗口沿圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行或列方向的移動(dòng)；第二步：每次移動(dòng)后，對(duì)窗口內(nèi)的像素灰度值進(jìn)行排序；第三步：通過(guò)排序得到的中值代替窗口內(nèi)中心位置的原始像素灰度值8.圖像分割定義。了解二值圖像的膨脹、腐蝕（二值圖像運(yùn)算）；與、或、異或（二值圖像的邏輯運(yùn)算）?！敬稹浚篒.圖像分割是指把圖像分成各具特性的區(qū)域并提取出感興趣目標(biāo)的技術(shù)和過(guò)程。（圖像分割結(jié)果直接影響進(jìn)行的圖像分析的質(zhì)量，常用方法為閾值法。）II.（二值圖像是指通過(guò)設(shè)定某個(gè)閾值，把具有灰度級(jí)的

18、圖像變成只有兩個(gè)灰度級(jí)的黑白圖像。）膨脹：使二值圖像擴(kuò)大 （方法：用結(jié)構(gòu)元素掃描圖像的每一個(gè)像素并與其覆蓋的二值圖像做“與”操作，如果都為0，結(jié)果圖像該像素為0，否則為1。） 腐蝕：使二值圖像減小 （方法：用結(jié)構(gòu)元素掃描圖像的每一個(gè)像素并與其覆蓋的二值圖像做“與”操作，如果都為1，結(jié)果圖像該像素為1，否則為0。）與(AND)運(yùn)算的定義 g(x,y) = f(x,y) Ù h(x,y)/只有2個(gè)像素都是1時(shí)，“與”運(yùn)算的結(jié)果才是1?；颍∣R）運(yùn)算的定義 g(x,y) = f(x,y) v h(x,y)/當(dāng)2個(gè)像素之一為1時(shí)或同時(shí)為1時(shí)，“或”運(yùn)算的結(jié)果都為1。異或（XOR）運(yùn)算的定義

19、g(x,y) = f(x,y) Å h(x,y)/當(dāng)2個(gè)像素之一（但不同時(shí)）為1時(shí)結(jié)果為1，其它情況下結(jié)果為0。9. 平均光密度參數(shù)的定義及物理意義是被測(cè)個(gè)體的界面內(nèi)各象素光密度的算術(shù)平均，可反映組織細(xì)胞被染色的深淺。OD=lg1/T=lgI0/I1=lgGrey/Greyi 10.圖像中所帶標(biāo)尺的意義。（這個(gè)不太確定該怎么答）即每個(gè)像素所代表的實(shí)際長(zhǎng)度，是人為地將像點(diǎn)長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)化以衡量比較其大小的一種有效工具。（我胡謅的）11.光密度測(cè)量分析中應(yīng)該注意的問(wèn)題是什么？在光密度定量分析過(guò)程中,影響其定量測(cè)定的原因有制片原因、圖像獲取、圖像分析三個(gè)方面，故應(yīng)該注意的問(wèn)題也應(yīng)運(yùn)而生：制片原因

20、： 良好的取材，及時(shí)的固定。 保證組織脫水時(shí)間，按時(shí)、按濃度脫水。 避免載玻片和蓋玻片對(duì)背景光強(qiáng)度的影響，切片厚度要求均勻一致。 控制好抗原修復(fù)的溫度和時(shí)間。 選用質(zhì)優(yōu)的特異抗體。 選用結(jié)果穩(wěn)定的顯色方法，控制顯色時(shí)間。 用于定量的樣本，不要復(fù)染。圖像獲?。猴@微圖像分析儀在測(cè)量被測(cè)結(jié)構(gòu)的光密度時(shí)，對(duì)光的條件要求十分嚴(yán)格，因此圖像獲取時(shí)應(yīng)注意：  保持光路的穩(wěn)定: 光源、顯微鏡內(nèi)部元器件、CCD等 儀器參數(shù)一致:放大倍數(shù)、孔徑光闌、視場(chǎng)光闌、曝光時(shí)間、圖像大小等 消除顯微鏡視場(chǎng)光強(qiáng)度分布的不均勻陰影校正 為確保測(cè)量條件的一致：測(cè)量空白本底的灰度值要保持一致 樣品部位的選擇：選擇切片厚度

21、均勻、無(wú)刀痕、皺褶、破碎、壞死等而且染色一致的區(qū)域拍照 圖像的存儲(chǔ)格式:存儲(chǔ)為T(mén)IFF格式圖像分析： 扣除背景 陽(yáng)性標(biāo)記區(qū)域的選擇面積的選擇12.從功能出發(fā)闡述圖像分析儀的作用。圖像分析儀主要功能體現(xiàn)在圖像處理、物體幾何特征參數(shù)的測(cè)量及光密度參數(shù)的測(cè)量三方面，故其應(yīng)用也由此展開(kāi)，具體如下：基于圖像處理功能的應(yīng)用：1) 圖像質(zhì)量的改善CT、NMR、電鏡： 主要指對(duì)醫(yī)學(xué)或生物成像的處理與編輯，提高圖像的反差、清晰度，對(duì)圖像進(jìn)行必 的修飾。Photoshop軟件2) 圖像的存檔與檢索 圖像數(shù)據(jù)庫(kù)的管理3) 遠(yuǎn)程圖像的傳輸 遠(yuǎn)程診斷基于物體幾何特征參數(shù)的測(cè)量功能的應(yīng)用：宏觀: 實(shí)物(牙、胚胎、心肌缺血

22、面積、腦缺血面積、血管內(nèi)膜增生、) 微觀: 組織切片、電鏡照片(神經(jīng)元突 起的長(zhǎng)度、細(xì)胞或細(xì)胞核面積、核質(zhì)比、新生骨血管密度、細(xì)胞計(jì)數(shù)等)光密度參數(shù)的測(cè)量組織化學(xué)定量: 核酸定量： Feulgen 法特異對(duì)DNA染色 甲基綠派若寧法特異對(duì)DNA和 RNA 染色，DNA為藍(lán)綠色，RNA為紅色。 總蛋白定量：考馬斯亮蘭, 萘酚黃s 組蛋白： 固綠 多糖和糖原：PAS（過(guò)碘酸雪夫）反應(yīng) 脂肪： 油紅O 酶類定量： 堿性磷酸酶、酸性磷酸酶 免疫酶組化定量: 某種特定蛋白的定量，酶顯色。原位雜交: 酶顯色分子生物學(xué)影像定量: PCR、Western、Northern、Southern (專用凝膠成像系統(tǒng)

23、)流式細(xì)胞術(shù)部分1、 什么是流式細(xì)胞技術(shù)？FCM特點(diǎn)是什么？ 流式細(xì)胞技術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是利用流式細(xì)胞儀對(duì)處在快速流動(dòng)狀態(tài)中的單細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析，同時(shí)對(duì)待定群體加以分選的現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)。 FCM 特點(diǎn)：流式細(xì)胞技術(shù)最大特點(diǎn)是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過(guò)熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選。其特點(diǎn)可歸結(jié)為： （1）研究對(duì)象：生物顆粒，各種細(xì)胞、細(xì)胞器，微生物及人工合成微球等。 （2）分析速度：快速，最高達(dá)上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/秒。 （3）同時(shí)測(cè)定多個(gè)參數(shù)，研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征

24、，并加以定量。 （4）精度高，準(zhǔn)確性好。 2、流式細(xì)胞儀（分選型）內(nèi)部結(jié)構(gòu)包括哪些系統(tǒng)？其重要部件和作用是什么？ 流式細(xì)胞儀主要結(jié)構(gòu)：液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、電子系統(tǒng)、分選系統(tǒng)。 （1） 液流系統(tǒng) 聚焦細(xì)胞以供檢測(cè) 流動(dòng)室 液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)（壓力泵）為待檢液體流動(dòng)提供動(dòng)力 （2） 光學(xué)系統(tǒng) 激發(fā)和收集光信號(hào) 激發(fā)光源 弧光燈、激光器 光學(xué)濾片 選擇性的通過(guò)特定波長(zhǎng)的光 光信號(hào)收集和分離系統(tǒng) （3） 電子系統(tǒng) 將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并使其數(shù)字化以供計(jì)算機(jī)分析。 光電轉(zhuǎn)換器 光電二極管：光敏度低，檢測(cè)強(qiáng)信號(hào)（FCS） 光電倍增管：放大電信號(hào)，光靈敏度高，測(cè)定弱信號(hào)(SSC、FL1、FL2-) 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

25、：計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集、分析 （4） 分選系統(tǒng) 將目的細(xì)胞群分選到收集管中 3、LP500、SP500、BP500/50 三種濾光片的含義是什么？ A：LP500長(zhǎng)通500，表示波長(zhǎng)大于500nm的光都能通過(guò) SP500短通500，表示波長(zhǎng)小于500nm的光都能通過(guò) BP500/500帶通 500/50，表示濾片只允許波長(zhǎng)在 500nm 前后總共 50nm 的光譜帶的光線通過(guò)，又可以寫(xiě)成 BP500± 25或者BP4755254、光電轉(zhuǎn)換器的作用是什么？包括哪兩種探測(cè)器？接受哪些信號(hào)？ A：光電傳感器的作用是將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。 包括1）光電二極管：其光靈敏度低，接受強(qiáng)信號(hào)（FSC）；2

26、）光電倍增管：放大光信號(hào)，光靈敏度高，用于接收弱信號(hào)（SSC、FL1、FL2、FL3、FL4）5.流式細(xì)胞儀能檢測(cè)的信號(hào)有那兩大類？分別舉例說(shuō)明 主要包括散射光信號(hào)和熒光信號(hào)。 （1）散射光信號(hào)反映細(xì)胞的物理或固有參數(shù)，包括前向散射光（FSC），又叫小角散射光16°，反映細(xì)胞的大??；側(cè)向散射光（SSC），又稱為 90°散射光，代表細(xì)胞的粒度和精細(xì)的結(jié)構(gòu)變化，對(duì)包膜，包質(zhì)和核膜的變化很敏感。 （2）熒光信號(hào)，分為自發(fā)熒光和特異熒光。自發(fā)熒光是細(xì)胞內(nèi)部有不需要經(jīng)過(guò)染色，經(jīng)過(guò)光照射可以產(chǎn)生熒光的分子，這類分子經(jīng)過(guò)照射產(chǎn)生的熒光。特異熒光指細(xì)胞經(jīng)過(guò)熒光染料的標(biāo)記，在激光的照射下產(chǎn)生

27、的熒光，這樣的熒光強(qiáng)度較弱，波長(zhǎng)也較照射的激光不同。如fluo-2，fluo-36.什么叫熒光信號(hào)的線性測(cè)量與對(duì)數(shù)測(cè)量？分別舉例說(shuō)明 答：輸入信號(hào)和輸出信號(hào)成線性放大關(guān)系的稱為線性放大測(cè)量。主要用于，DNA,RNA和總蛋白的測(cè)量。 輸入信號(hào)和輸出信號(hào)成對(duì)數(shù)放大關(guān)系的稱為對(duì)數(shù)放大測(cè)量。主要用于，細(xì)胞膜表面蛋白的測(cè)量。7.什么叫光譜交叉？如何做熒光之間的補(bǔ)償？ 答：發(fā)射光譜的重疊對(duì)結(jié)果分析帶來(lái)的干擾稱為光譜交叉。 先將所有的補(bǔ)償和電壓調(diào)節(jié)為零；用同型對(duì)照或者陰性對(duì)照調(diào)節(jié)電壓，使陰性群位于左下角；用單陽(yáng)性的管調(diào)節(jié)相鄰熒光之間的補(bǔ)償。8試舉FCM 常用熒光染料？分別被哪些激光器激發(fā)？9.如何使用BD的

28、流式細(xì)胞儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集？基本程序是什么？3個(gè)常用軟件及各自功能？（1） FACSComp 自動(dòng)調(diào)整儀器設(shè)置（2） CellQuest 完成儀器設(shè)置 數(shù)據(jù)獲取 統(tǒng)計(jì)分析等全能工具（3） ModFit DNA周期 倍體 凋亡的自動(dòng)或手動(dòng)分析。10、什么叫參數(shù)？單參數(shù)和雙參數(shù)時(shí)可出現(xiàn)什么樣的圖像？答：參數(shù)（不太確定，自己概括的）：可測(cè)定的細(xì)胞參數(shù)包括核算分析、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等，同時(shí)測(cè)定多個(gè)參數(shù)是流式細(xì)胞技術(shù)（FCM）的特點(diǎn)之一。 單參數(shù)：?jiǎn)螀?shù)可出現(xiàn)單參數(shù)直方圖，雙參數(shù)可出現(xiàn)：二維（Dot Plot）、等高線圖（Contour Plot）、二維密度圖（Density Plot）、假三維圖（Pseud

29、o 3D Plot）。11、什么叫DNA指數(shù)（DI）？什么叫增值指數(shù)（PI）?含義是什么？答：DNA指數(shù)：樣本G0/G1峰平均道數(shù)和正常2倍體G0/G1峰的比值。 指數(shù)：增殖細(xì)胞占總周期細(xì)胞的比例。12、DNA分析時(shí)主要影響因素是什么？1.分辨率（CV）： 儀器因素：液流、光路調(diào)試、光學(xué)元件 人為因素：樣本制備過(guò)程均導(dǎo)致CV變化。DNA直方圖中CV越小越 好，新鮮標(biāo)本CV好于石蠟標(biāo)本，一般新鮮CV3，石蠟 5%，當(dāng)G1峰CV8時(shí)，不再合適做S期評(píng)估. 2.線性度：DNA分析中G2/M期道數(shù)應(yīng)該是G0/G1期的2倍，若G2/M期 與G0/G1期的比值不在1.95-2.05范圍，放大器的線性度需

30、要檢查調(diào)節(jié) 3.碎片：較多碎片干擾S期計(jì)算 4.細(xì)胞雙粘體：通過(guò)雙粘體辨別模式DDM（Doublet Discrimination Module）來(lái)區(qū)分13、什么是雙粘體辨別模式（DDM）？主要作用是什么？答：通過(guò)FL-2-W和FL-2-A來(lái)區(qū)分樣本中正常周期細(xì)胞和粘連體細(xì)胞的模式稱為雙粘連體辨別模式。其目的是為了除去粘連體和假陽(yáng)性的情況。14、樣品熒光標(biāo)記時(shí)都受哪些因素影響？1.溫度的影響：溫度升高熒光量減弱 2.pH值的影響：發(fā)生改變?cè)斐蔁晒夤庾V的改變，熒光強(qiáng)度的降低 3.熒光染料濃度的影響：熒光染料形成的締合分子中電子共振作用 4.雜質(zhì)的影響：產(chǎn)生淬滅作用 5.固定劑的影響：染DNA時(shí)用

31、醛類固定劑（戊二醛、甲醛）時(shí)熒光強(qiáng)度降低50%，醇類影響較小 6.其他：溶劑的性質(zhì)、濃度對(duì)熒光淬滅也用一定影響15、DNA周期分析的主要操作步驟是什么？1.開(kāi)機(jī) 2.運(yùn)行FACSComp：監(jiān)測(cè)儀器工作狀態(tài)并記錄數(shù)據(jù) 3.建立獲取模板：散點(diǎn)圖（FL2-W.aFL2-A）、兩個(gè)直方圖（FL2-A 和FL2-W） 4.運(yùn)行DNA QC質(zhì)控：建立測(cè)試條件，檢測(cè)儀器線性度、分辨率和脈沖處理器 5.確定存儲(chǔ)數(shù)據(jù)的地址 6.記錄數(shù)據(jù)：倍體分析建議做3個(gè)平行管，一管：2倍體標(biāo)準(zhǔn)品，二管：未知樣品+2倍體標(biāo)準(zhǔn)品，三管：未知樣品。低速進(jìn)樣,以第一管為準(zhǔn)優(yōu)化條件，同條件下按順序獲取數(shù)據(jù)，2萬(wàn)細(xì)胞 7. 分析數(shù)據(jù)：用

32、ModFit軟件分析結(jié)果16、通過(guò)你所學(xué)到的知識(shí)試舉兩例FCM的應(yīng)用例子。要求繪出獲取與分析圖，并簡(jiǎn)述分析結(jié)果。兩次流式實(shí)習(xí)的內(nèi)容寫(xiě)上去，細(xì)胞周期的分期鑒定and淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞的表面CD分子的熒光標(biāo)記。（按照老師課件上的寫(xiě)）17、什么是CBA技術(shù)，檢測(cè)原理及特點(diǎn)。原理：將不同的捕獲抗體包被在不同熒光強(qiáng)度的微球上構(gòu)成捕獲微球，與待測(cè)樣品溶液混合形成抗原抗體結(jié)合物，再加入熒光標(biāo)記的檢測(cè)抗體形成：三明治“夾心復(fù)合物，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。特點(diǎn)：1）單一樣本同時(shí)檢測(cè)多種目的蛋白2）樣本量少3）靈敏度高，重復(fù)性好4）所有分析只需一標(biāo)準(zhǔn)曲線5）檢測(cè)線性范圍寬6）避免酶聯(lián)反應(yīng)所致人工假象7）隨心所欲的組合菜單8）強(qiáng)大的軟件分析系統(tǒng)9）高通量檢測(cè)系統(tǒng)FACSARRAY BIOANALYZER10）樣本來(lái)源：血清、血漿、細(xì)胞裂解液etc11）檢測(cè)類型：人、小鼠或大鼠細(xì)胞因子、炎癥因子.流式分選儀部分1、什么叫流式細(xì)胞分選技術(shù)？細(xì)