得看第四章天然酶的純化與制備

1、第四章 天然酶的純化與制備天然酶制備的基本步驟 天然酶的制備一般包括三個(gè)基本步驟： 酶的提取 酶的分離純化 酶的結(jié)晶或制劑第一節(jié) 天然酶的一般制備方法 酶的分離純化是酶學(xué)研究的基礎(chǔ)。 研究酶的性質(zhì)、作用、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、闡明代謝途徑，作為工具酶等都需要高度純化的酶制劑。 如基因工程中所使用的各種工具酶都有高純度的要求，內(nèi)切酶中不能含有外切酶，反之一樣，否則結(jié)果無法判斷。 一、酶的提取 酶的提取是指在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過程。也稱作酶的抽提。一、酶的提取 酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。大多?shù)酶能溶解于水，可用水或稀酸、稀

2、堿、稀鹽溶液提取；有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中，要注意控制好溫度、ph值等各種條件。酶提取的主要方法 根據(jù)酶提取時(shí)所采用的溶劑或溶液的不同，酶的提取方法主要有鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取和有機(jī)溶劑提取等。 二、酶的分離純化方法 酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，所以用于蛋白質(zhì)的分離純化方法一般適用于酶的分離純化。此外酶是具有催化功能的蛋白質(zhì)，因此根據(jù)酶與底物、底物結(jié)構(gòu)類似物、輔助因子、抑制劑等的特異親和力可發(fā)展酶獨(dú)特的親和層析技術(shù)。所有的分離純化方法，都是根據(jù)被分離物質(zhì)間的物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)的差異而設(shè)計(jì)出來的。鹽析法

3、 一般蛋白質(zhì)在低離子強(qiáng)度介質(zhì)中表現(xiàn)為鹽溶(salted in)、而在高離子強(qiáng)度介質(zhì)中表現(xiàn)為鹽析(salted out)，但不同的蛋白質(zhì)鹽析所需的離子強(qiáng)度不同。鹽析法就是建立在此原理的種簡便有效的分離方法。鹽析法 硫酸銨是最常用的鹽，因其在水中溶解度大，且受溫度影響小，對酶不僅無害處。而且還起穩(wěn)定作用分級(jí)效果較好且價(jià)廉易得?？刹捎茫篴加固體粉末鹽；b加飽和鹽溶液；c. 對濃鹽溶液進(jìn)行透析等方式。一般對于大體積樣品采用a，對于小體積樣品采用b或c。通常層析洗脫液蛋白質(zhì)濃度低，采用c方式沉淀蛋白質(zhì)很方便。有機(jī)溶劑沉淀法 隨著有機(jī)溶劑的加入，介質(zhì)的介電常數(shù)下降，使蛋白質(zhì)分子間靜電作用力增強(qiáng)；同時(shí)有機(jī)溶

4、劑還可降低蛋白質(zhì)分子表面的水合程度，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度下降直至最后沉淀下來。有機(jī)溶劑沉淀法 最常使用的有機(jī)溶劑是乙醇、丙酮等。由于有機(jī)溶劑能使酶變性，一般應(yīng)在低溫下操作。同時(shí)宜加入適量中性鹽，可增加蛋白質(zhì)溶解度降低變性作用，并提高分級(jí)效果。使用有機(jī)溶劑沉淀酶有兩種方式：其一，如上所述，用乙醇或丙酮分級(jí)沉淀目的酶。其二，若目的酶在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定性強(qiáng)，可采用變性雜蛋白方式，使酶得到初步純化。等電點(diǎn)沉淀法 當(dāng)介質(zhì)的ph值與某蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pi)相等該蛋白質(zhì)分子間的排斥力最小其溶解度亦最小，易于沉淀。因此可通過調(diào)節(jié)介質(zhì)ph值把目的酶與雜蛋白分開。此種沉淀法亦受介質(zhì)離子強(qiáng)度等因素的影響。由于蛋白質(zhì)在

5、pi附近一定范圍的ph值下都可發(fā)生沉淀，只是沉淀的程度很不一樣，再者相當(dāng)多的蛋白質(zhì)pi點(diǎn)很靠近，所以該法的分級(jí)效果和回收率均不理想一般只用在酶的粗分離階段。凝膠過濾層析 它又稱凝膠過濾、分子篩層析、凝膠滲透層析、排阻層析。它是依據(jù)分子篩效應(yīng)，按分子的大小和形狀來分離樣品。因此它也可用于蛋白質(zhì)分子量的測定。此法具有條件溫和，操作簡便，層析柱可反復(fù)使用無需再生處理等優(yōu)點(diǎn)。離子交換層析 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。不同蛋白質(zhì)出于其pi不同，在同一種ph值介質(zhì)中電離狀況會(huì)不同，分子所帶電荷的種類和數(shù)量就不同與離于交換劑的靜電吸附能力亦不同。通過上樣吸附和改變離子強(qiáng)度或ph值解吸洗脫、可使蛋白質(zhì)依據(jù)其靜電吸附能

6、力由弱到強(qiáng)的順序而分離開來。這就是離子交換層析法。它是一個(gè)重要而廣泛應(yīng)用的方法。親和層析 親和層析就是將配體共價(jià)連接到基質(zhì)上，用此種基質(zhì)填充成層析柱，利用配體與對應(yīng)的生物大分子(目的物)的專一親和力，將目的物與其它雜質(zhì)分離開。這一方法不僅可用于分離生物大分子，也可用于分離諸如病毒、細(xì)胞器、細(xì)胞之類的超分子結(jié)構(gòu)。其操作與離子交換層析類似。吸附層析 吸附層析是以吸附劑為固定相以緩沖溶液或有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的一種層析方法?？捎玫奈絼┯辛u基磷灰石、硅膠、高嶺土、纖維素、活性炭等。這些都是蛋白質(zhì)層析的經(jīng)典材料。應(yīng)選擇吸咐選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、表面積大、顆粒均勻、成本低廉的吸附劑。電泳法 電泳是帶電物質(zhì)在直

7、流電場作用下，向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象 由于蛋白質(zhì)分子表面電荷的差異，應(yīng)用電泳方法可將不同的蛋白質(zhì)分子分離開來。 電泳法不僅可用于酶的純化工作，還常用于酶純度鑒定及理化性質(zhì)(如pi、亞基分子量等)測定。特別是在分離微克量蛋白質(zhì)時(shí)。離心法 利用離心機(jī)產(chǎn)生的離心力來分離不同物質(zhì)的過程稱為離心。膜分離法 膜分離法不僅可分離分子量差異顯著的蛋白質(zhì)，還可用于樣品的脫鹽、濃縮。酶分離純化工作中常使用各種不同材料制成的固體半透膜進(jìn)行超濾或透析。 超濾 它是依據(jù)溶液中分子的大小和形狀進(jìn)行選擇性過濾的方法,在外加壓力下，驅(qū)動(dòng)酶液中的溶劑分子和較小的溶質(zhì)分子穿過膜，而截留分子量大的溶質(zhì)分子。它常用于酶液的

8、脫鹽和濃縮。 三、酶的結(jié)晶 酶的結(jié)晶是溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過程。酶的結(jié)晶是酶分離純化的一種手段，它不僅為酶學(xué)研究提供了適合的樣品，而且為較高純度的酶的獲得和應(yīng)用創(chuàng)造了條件。酶的結(jié)晶 酶在結(jié)晶時(shí)，酶液應(yīng)達(dá)到一定的濃度。濃度太低是無法析出結(jié)晶的。一般來說，酶的濃度越高，就越容易結(jié)晶。但濃度過大時(shí)，會(huì)形成很多小晶核，結(jié)晶小，不易長大。故此結(jié)晶時(shí)應(yīng)控制好酶液濃度。 1. 鹽析結(jié)晶法 在適宜的溫度和ph值等條件下，緩慢增加酶液中鹽的濃度，使酶的溶解度慢慢降低，進(jìn)行酶的結(jié)晶。 鹽析結(jié)晶所采習(xí)的中性鹽是硫酸銨，也可采用硫酸鈉等其他中性鹽。1. 鹽析結(jié)晶法 鹽析結(jié)晶時(shí)，一般是把飽和鹽溶液慢慢滴加到濃酶

9、液中，至呈現(xiàn)稍微渾濁為止。讓其在一定溫度下(一般在0一10的低溫條件下)放置一段時(shí)間，慢慢析出結(jié)晶，再緩慢而均勻地補(bǔ)加少量飽和鹽溶液，直至結(jié)晶完全。有時(shí)也可用固體硫酸銨粉末代替。1. 鹽析結(jié)晶法 鹽析結(jié)晶還可以采用抽提法。即將酶液先經(jīng)硫酸銨鹽析得到的酶沉淀，用較高飽和度的冰冷的硫酸銨溶液抽提，使一部分酶溶解，分離后上清液在室溫下放置，慢慢析出結(jié)晶，剩下的沉淀依次用冰冷的較低飽和度的硫酸銨溶液再行抽堤。由于低溫時(shí)酶在硫酸銨溶液中的溶解度較高，溫度升高時(shí)溶解度降低，所以當(dāng)酶的抽提液在室溫放置時(shí)，酶會(huì)慢慢析出結(jié)晶。抽提時(shí)所采用的硫酸銨溶液的飽和度應(yīng)根據(jù)酶鹽析沉淀的飽和度決定。 2. 有機(jī)溶劑結(jié)晶法

10、在經(jīng)過濃縮和初步純化的酶液中，調(diào)節(jié)ph值到酶穩(wěn)定的ph值，用冰浴冷卻至0 左右，邊攪拌邊慢慢加入有機(jī)溶劑，當(dāng)酶液稍微出現(xiàn)渾濁時(shí)，在冰箱放置12h，離心去除沉淀，取上清液置于冰箱中讓其慢慢析出結(jié)晶。2. 有機(jī)溶劑結(jié)晶法 有機(jī)溶劑結(jié)晶的優(yōu)點(diǎn)是含鹽少，結(jié)晶時(shí)間較短。但操作要在低溫下進(jìn)行，以免引起酶變性失活。 有機(jī)溶劑結(jié)晶常用的溶劑有乙醇、丙酮等。 3. 透析平衡結(jié)晶法 將初步純化的濃縮酶液裝在透析袋中，在一定濃度的鹽溶液或有機(jī)溶劑或一定ph的緩沖溶液中進(jìn)行透析。經(jīng)一段時(shí)間后，酶液漸漸達(dá)到過飽和狀態(tài)而析出結(jié)晶。 4. 等電點(diǎn)結(jié)晶法 通過緩慢地改變酶液的ph值，使之逐步到達(dá)酶的等電點(diǎn)而使酶析出結(jié)晶。第二

11、節(jié) 胰酶的生產(chǎn)制備工藝 一、概述： 胰酶(pancreatin)是從豬、牛、羊等動(dòng)物胰臟中提取得到的一種混合酶制劑。主要成分為胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶，還有羧肽酶和核酸酶等。在動(dòng)物胰臟中含有豐富的消化酶，這些酶都有為滿足機(jī)體需要的天然比例和活性。提取的藥用酶是否大致具有原胰臟中菌的天然比例和活性，與生產(chǎn)工藝有很大關(guān)系。一、概述： 胰酶能溶于水及低濃度的乙醇，在乙醚和高濃度的乙醇中均不溶，不耐熱，強(qiáng)酸和強(qiáng)堿均能使之破壞，但在中性和弱堿性的溶液中穩(wěn)定，其最適溫度40，最適ph為89。一、概述： 胰腺經(jīng)刨碎后,內(nèi)、外肽酶、蛋白酶等以無活性的酶原形式釋放于溶液,須經(jīng)激活后才具有水解消化蛋白質(zhì)、淀粉

12、和脂肪的能力。而在胰腺激活提取過程中,當(dāng)?shù)鞍酌复罅考せ詈?會(huì)隨之水解破壞同一體系內(nèi)的胰淀粉酶、胰脂肪酶等酶類物質(zhì),使活力下降,胰酶的收率降低。二、胰酶的制備工藝流程 刨碎 激活 提取 預(yù)冷 胰腺 胰漿 胰乳 提取液沉淀 壓榨制粒 脫脂干燥 酶沉淀物 粗酶顆粒 粉碎 胰酶原粉 三、胰酶的活性測定 胰酶的活性測定按1977版中國藥典采用酪蛋白測定方法；按1995版中國藥典采用三酶活性測定；按出口標(biāo)準(zhǔn)主要測定胰酶中所含激肽釋放酶活性。四、胰酶的藥理作用與臨床應(yīng)用 胰酶在臨床上主要作為助消化藥，主要用于消化不良、食欲不振及肝、胰腺疾病引起的消化障礙。我國大多數(shù)生化藥廠生產(chǎn)的藥用胰酶原粉主要用于制成多酶

13、片、胰酶片等,或作為原料藥出口到日本等國家,用于生產(chǎn)提取激肽釋放酶等高附加值藥品,而其中所含激肽釋放酶活性是其檢測的重要指標(biāo)。 第三節(jié) 胃蛋白酶的生產(chǎn)制備工藝一、概述： 胃蛋白酶是以無活性的酶原形式存在于胃粘膜中，經(jīng)胃酸激活后才能成為有活性的胃蛋白酶。 h+ 胃蛋白酶原 胃蛋白酶+胃蛋白酶抑制劑其它肽 (分子量42500） （分子量34500) (分子量3100) 胃蛋白酶易溶于水，生成帶乳光的溶液，難溶于乙醇、氯仿和乙醚等有機(jī)溶劑；最適溫度40，最適ph為1.52.0。二、胃蛋白酶的制備工藝流程 激活提取 濃縮 去雜蛋白 胃粘膜 提取液 上清液丙酮分級(jí)沉淀 胃膜素 脫脂真空干燥 粉碎 胃蛋白

14、酶胃蛋白酶原粉 三、胃蛋白酶的活性測定 胃蛋白酶的活性測定按1977版中國藥典采用卵蛋白測定方法；按1995版中國藥典采用血紅蛋白活性測定；四、胃蛋白酶的藥理作用與臨床應(yīng)用 胃蛋白酶在臨床上主要作為助消化藥。用于制成多酶片、胃酶片等,主治消化不良,食欲不振以及有關(guān)老年性疾病。第四節(jié) 細(xì)胞色素c的生產(chǎn)制備工藝 一、概述： 細(xì)胞色素是包括多種能夠傳遞電子的含鐵蛋白質(zhì)總稱。它廣泛存在于各種動(dòng)物、植物組織和微生物中。細(xì)胞色素是呼吸鏈中極重要的電子傳遞體，細(xì)胞色素c只是細(xì)胞色素的一種。它主要存在于線粒體中，需氧最多的組織如心肌及酵母細(xì)胞中，細(xì)胞色素c含量豐富。 一、概述： 細(xì)胞色素c為含鐵卟啉的蛋白質(zhì)，

15、分子量約為13000，蛋白質(zhì)部分由104個(gè)左右的氨基酸殘基組成。它溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可自酸性水中提取，制品可分為氧化型和還原型兩種，前者水溶液呈深紅色，后者呈桃紅色。細(xì)胞色素c對熱、酸和堿都比較穩(wěn)定，但三氯乙酸和乙酸可使之變性失活。二、細(xì)胞色素c的制備工藝流程 絞碎 提取 中和 吸附 洗滌 洗脫豬心 提取液 鹽析 三氯乙酸沉淀 溶解洗脫液 細(xì)胞色素c沉淀透析 柱層析 去熱原 制劑 細(xì)胞色素c粗品 成品 三、細(xì)胞色素c的活性測定 上述制備的細(xì)胞色素 c是還原型和氧化型的混合物，在測定時(shí)要加入聯(lián)二亞硫酸鈉，使氧化型變?yōu)檫€原型。還原型細(xì)胞色素c水溶液在520nm波長處有最大吸收值，根

16、據(jù)這一特性可用細(xì)胞色素c標(biāo)準(zhǔn)品，畫出濃度對吸收值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出所測樣品的含量。 四、細(xì)胞色素c的臨床應(yīng)用 細(xì)胞色素c是生物體內(nèi)細(xì)胞呼吸的重要酶,是呼吸鏈中極重要的電子傳遞體，在臨床上主要用于治療腦出血、腦血管障礙、心肌梗死、一氧化碳中毒、安眠藥中毒等癥。第五節(jié) 激肽釋放酶的生產(chǎn)制備工藝一、概述： 激肽釋放酶(kallikrein，下簡稱k酶)屬絲氨酸蛋白酶。廣泛存在于血漿、胰、腎、頜下腺、腸、胰液、尿及蛇毒中。藥用k酶又稱血管舒緩素，主要來自頜下腺或胰腺。 k酶是一種含有唾液酸的糖蛋白，在腺體中以酶原的形式存在。 k酶由二條多肽鏈組成，分子量為28600。三、激肽釋放酶的活性測

17、定 國內(nèi)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)豬頜下腺k酶制定的。部頒標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：注射用血管舒緩素效價(jià)每1mg不得少于10單位，口服用每1mg不得少于5個(gè)單位。 測定原理：k酶可催化水解底物baee生成na苯甲酰l精氨酸和乙醇在253nm波長處，光吸收的增值與k酶在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。酶促反應(yīng)時(shí)的底物濃度采用0.510-3moll，。四、激肽釋放酶的藥理作用與臨床應(yīng)用 k酶在機(jī)體內(nèi)系由組織蛋白水解酶催化k酶原轉(zhuǎn)變而成。形成的k酶可作用激肽原使之變成激肽。而激肽能使血管舒張與毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)，從而使心血管病緩解。激肽還能增加腎皮質(zhì)血流，增加腎小管毛細(xì)血管壓力，抑制腎小管對鈉的吸收，產(chǎn)生利尿作用，從而也能引起血壓下降。

18、四、激肽釋放酶的藥理作用與臨床應(yīng)用 1) 主要用于增加冠狀動(dòng)脈、腦、視網(wǎng)膜等處的血流量，可治療高血壓、冠狀動(dòng)脈及腦動(dòng)脈血管硬化，心絞痛、初老期循環(huán)障礙等癥。對由血液循環(huán)障礙引起的組織營養(yǎng)不良、血管痙攣、肢端感覺異常及麻木等癥也有明顯療效。 2) 本品能溶解血纖維蛋白，因此對由于血纖維蛋白在小血管中堵塞所致的血栓及炎癥有治療作用，也可外用于治療凍瘡，對血管閉塞性脈管炎也有一定療效。 3) 用于治療微循環(huán)障礙疾病，如夜間異常臂痛、小腿麻木疼痛等病。 4) 其他 有報(bào)道用k酶治療男性不育癥，用藥后精子數(shù)顯著增加。還可治療圓形脫毛癥。該酶還是優(yōu)良的皮膚保護(hù)劑，也可作為老年人的保健藥物和抗衰老藥物應(yīng)用。

19、第六節(jié) 超氧化物歧化酶的生產(chǎn)制備工藝 一、概述： 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase）簡稱sod，廣泛存在于生物體內(nèi)，按所含金屬離子的不同，分為三種：銅鋅超氧化物歧化酶（cuzn-sod）、錳鋅超氧化物歧化酶 (mnzn-sod)、鐵超氧化物歧化酶（fe-sod）。sod催化如下反應(yīng)：o2-+o2-+2h+h2o2+o2 在生物體內(nèi)，它是一種重要的自由基清除劑。二、超氧化物歧化酶的制備工藝流程 離心 洗滌 溶血 去血紅蛋白牛血 紅細(xì)胞 溶血液 k2hpo4分液 丙酮沉淀 溶解粗提液 上清液 沉淀透析 de-32柱層析 g-50柱層析 sod精品 三、超氧化物歧化酶的活性測

20、定 采用鄰苯三酚自氧化法。鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出o2-，生成帶色的中間產(chǎn)物。反應(yīng)開始后，反應(yīng)液先變成黃棕色，幾分鐘后轉(zhuǎn)綠，幾小時(shí)后又轉(zhuǎn)變成黃色，這是因?yàn)樯傻闹虚g產(chǎn)物不斷氧化的結(jié)果。這里測定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段，中間物的積累在滯留3045s后，與時(shí)間成線性關(guān)系，一般線性時(shí)間維持在4min的范圍內(nèi)。中間物在420nm波長處有強(qiáng)烈光吸收，當(dāng)有sod存在時(shí)，由于它能催化o2-和h結(jié)合生成o2和h2o2，從而阻止了中間物的積累，因此，通過計(jì)算就可求出sod的酶活性。四、超氧化物歧化酶的臨床應(yīng)用 sod不僅在生物體內(nèi)對抗氧化、解毒等起重要作用,而且也有抗輻射、抗腫瘤及抗

21、衰老等功能。超氧化物歧化酶能清除生物體內(nèi)的超氧陰離子自由基,在炎癥、自身免疫性疾病、腫瘤及輻射損傷、衰老等疾病防治方面起著十分重要的作用， 第七節(jié) 尿激酶的生產(chǎn)制備工藝 一、概述： 1861年發(fā)現(xiàn)尿中有溶解蛋白的活性物質(zhì)，隨后于1885年報(bào)道了此活性物質(zhì)有溶解纖維蛋白凝塊的功能，1952年將人尿中纖維蛋白溶酶原的激酶命名為尿激酶(urokinase，uk)。uk是由腎細(xì)胞產(chǎn)生的一種堿性蛋白酶，為纖維蛋白溶酶原激活劑。uk主要存在于人及哺乳動(dòng)物尿中，人尿平均含量約56iuml。天然uk的分子量為54000，絲氨酸和組氨酸是uk活性中心的必需氨基酸。二、尿激酶的制備工藝流程 藥用uk主要從新鮮人尿

22、中提取，目前主要有三種方法。其一是發(fā)泡法，即高速攪拌使尿液發(fā)泡，然后泡沫液化，加入硫酸銨，使uk沉淀得粗品；其二是沉淀法，于尿液中加入沉淀劑(常用鞣酸、苯甲酸、重金屬離子等)使uk沉淀，其三是最常用的吸附劑法，即選擇適當(dāng)?shù)奈絼┯羞x擇性地吸附uk，然后分離純化。吸附劑種類較多，如硅膠、硅藻土、734樹脂、活性炭等。三、尿激酶的活性測定 中國藥典規(guī)定：本品系從新鮮人尿中提取的一種能激活纖維蛋白溶酶原的酶。它是由高分子量54000和低分子量33000組成的混合物，huk含量不得小于90，每1mg蛋白中uk活力不得少于100000單位。 uk的效價(jià)測定方法有氣泡上升法、小球下落法、纖維素平板法、底物

23、合成法和hplc法等?，F(xiàn)行藥典標(biāo)準(zhǔn)采用氣泡上升法和氮測定法檢測比活力。四、尿激酶的藥理作用與臨床應(yīng)用 uk屬蛋白分解酶，在體內(nèi)可作為酶原激活劑，活化血纖溶酶原成為血纖溶酶。uk對血纖維蛋白，血纖維蛋白原，凝血因子v、等均有溶解作用，因而具有溶血栓、抗凝血的功能，故是一種高效的溶血栓劑。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)uk有明顯降低血壓的作用。四、尿激酶的藥理作用與臨床應(yīng)用 目前，臨床上已將uk用于治療各種血栓的形成、血栓梗塞性疾病，如腦血栓、中央視網(wǎng)膜血管閉塞癥、急性心肌梗死、肺栓塞、四肢及周圍動(dòng)脈血栓癥等，還用于動(dòng)靜脈交支血栓以及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。第八節(jié)第八節(jié) 微生物酶的開發(fā)微生物酶的開發(fā)應(yīng)用微生物來開發(fā)

24、酶的優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用微生物來開發(fā)酶的優(yōu)點(diǎn)：(1)微生物生長繁殖快，生活周期短。因此，用微生物來生產(chǎn)酶產(chǎn)微生物生長繁殖快，生活周期短。因此，用微生物來生產(chǎn)酶產(chǎn)品，生產(chǎn)能力（發(fā)酵）幾乎可以不受限制地?cái)U(kuò)大，能夠滿足迅品，生產(chǎn)能力（發(fā)酵）幾乎可以不受限制地?cái)U(kuò)大，能夠滿足迅速擴(kuò)張的市場需求。速擴(kuò)張的市場需求。(2)微生物種類繁多，它們散布于整個(gè)地球的各個(gè)角落，而且在不微生物種類繁多，它們散布于整個(gè)地球的各個(gè)角落，而且在不同的環(huán)境下生存的微生物都有其完全不同的代謝方式，能分解同的環(huán)境下生存的微生物都有其完全不同的代謝方式，能分解利用不同的底物。利用不同的底物。(3)這一特征就為微生物酶品種的多樣性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)

25、。這一特征就為微生物酶品種的多樣性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。(4)特別是當(dāng)基因工程介入時(shí)，動(dòng)植物細(xì)胞中存在的酶，幾乎都能夠利用特別是當(dāng)基因工程介入時(shí)，動(dòng)植物細(xì)胞中存在的酶，幾乎都能夠利用微生物細(xì)胞獲得。微生物細(xì)胞獲得。微生物酶的開發(fā)微生物酶的開發(fā) 因此，有計(jì)劃和仔細(xì)地篩選微生物菌種，因此，有計(jì)劃和仔細(xì)地篩選微生物菌種，通?？梢垣@得能夠生產(chǎn)幾乎任何一種酶的通?？梢垣@得能夠生產(chǎn)幾乎任何一種酶的適當(dāng)細(xì)胞。適當(dāng)細(xì)胞。微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(一一) 樣品的采集樣品的采集 采樣的目的、采樣地點(diǎn)、采樣方法及采樣的目的、采樣地點(diǎn)、采樣方法及采樣的數(shù)量。采樣的數(shù)量。微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)

26、的一般程序(二二) 菌種的分離菌種的分離 培養(yǎng)基的確定、培養(yǎng)條件的確定。培養(yǎng)基的確定、培養(yǎng)條件的確定。微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(三三) 菌種的初篩菌種的初篩 (1)用簡單的定性反應(yīng)進(jìn)行初篩；用簡單的定性反應(yīng)進(jìn)行初篩； (2)在最初分離階段就給予特殊的培養(yǎng)基或在最初分離階段就給予特殊的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，進(jìn)而讓目的菌株得以繁殖，培養(yǎng)條件，進(jìn)而讓目的菌株得以繁殖，盡可能地把只成為目的菌的菌株或只將盡可能地把只成為目的菌的菌株或只將其最適菌株的一株純化分離。其最適菌株的一株純化分離。微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(四四) 菌種的復(fù)篩菌種的復(fù)篩 初篩之后，還要進(jìn)行復(fù)篩。

27、復(fù)篩的目初篩之后，還要進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩的目的是在初篩的基礎(chǔ)上，篩選產(chǎn)酶量高、的是在初篩的基礎(chǔ)上，篩選產(chǎn)酶量高、性能更符合生產(chǎn)要求的菌種。性能更符合生產(chǎn)要求的菌種。 酶活的測定方法的建立尤其重要。酶活的測定方法的建立尤其重要。微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(五五) 對復(fù)篩獲得菌株的要求對復(fù)篩獲得菌株的要求 (1)不是致病菌；不是致病菌； (2)菌株不易變化和退化；菌株不易變化和退化； (3)不易感染噬菌體；不易感染噬菌體； (4)微生物產(chǎn)酶量高；微生物產(chǎn)酶量高； (5)酶的性質(zhì)符合應(yīng)用的需要，而且最好是胞酶的性質(zhì)符合應(yīng)用的需要，而且最好是胞外酶；外酶； (6)產(chǎn)生的酶便于分離和提取，

28、得率高；產(chǎn)生的酶便于分離和提取，得率高； (7)微生物培養(yǎng)營養(yǎng)要求低。微生物培養(yǎng)營養(yǎng)要求低。微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(六六) 最佳產(chǎn)酶條件的初步確定最佳產(chǎn)酶條件的初步確定 (1)培養(yǎng)方式的確定；培養(yǎng)方式的確定； (2)最佳培養(yǎng)條件組合；最佳培養(yǎng)條件組合； (3)微生物產(chǎn)酶的特性微生物產(chǎn)酶的特性(胞內(nèi)酶、胞外胞內(nèi)酶、胞外酶酶)； (4)微生物酶收集的時(shí)間順序；微生物酶收集的時(shí)間順序；微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(七七) 微生物產(chǎn)酶性能的進(jìn)一步提高微生物產(chǎn)酶性能的進(jìn)一步提高 (1)獲得高產(chǎn)菌種的突變體；獲得高產(chǎn)菌種的突變體； (2)利用代謝工程和代謝調(diào)節(jié)機(jī)理來提

29、高微生物的酶利用代謝工程和代謝調(diào)節(jié)機(jī)理來提高微生物的酶產(chǎn)量；產(chǎn)量； (3)運(yùn)用遺傳工程、基因工程的手段將原有菌株中的運(yùn)用遺傳工程、基因工程的手段將原有菌株中的目的基因轉(zhuǎn)移到另外一些對生產(chǎn)環(huán)境更適應(yīng)性的微生目的基因轉(zhuǎn)移到另外一些對生產(chǎn)環(huán)境更適應(yīng)性的微生物細(xì)胞之內(nèi)，使其高效表達(dá)；物細(xì)胞之內(nèi)，使其高效表達(dá)； 微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(八八) 微生物酶的提取方法微生物酶的提取方法 (1)酶的粗提；酶的粗提； (2)酶的精制。酶的精制。微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(九九) 微生物產(chǎn)酶菌種的保藏微生物產(chǎn)酶菌種的保藏 (1)斜面；斜面； (2)沙土管；沙土管； (3)冷凍

30、。冷凍。 第五章 酶的人工模擬第一節(jié) 模擬酶的理論基礎(chǔ)和策略 一、模擬酶的概念 模擬酶又稱人工酶或酶模型，它是生物有機(jī)化學(xué)的一個(gè)分支。 模擬酶是在分子水平上模擬酶活性部位的形狀、大小及其微環(huán)境等結(jié)構(gòu)特征，以及酶的作用機(jī)理和立體化學(xué)等特性的一門科學(xué)。 可見，模擬酶是從分子水平上模擬生物功能的一門邊緣科學(xué)。二、模擬酶的理論基礎(chǔ) 1模擬酶的酶學(xué)基礎(chǔ) 酶的催化機(jī)制：酶先與底物結(jié)合，進(jìn)而選擇性穩(wěn)定某一特定反應(yīng)的過渡態(tài)，降低反應(yīng)的活化能從而加快反應(yīng)速度。 設(shè)計(jì)模擬酶一方面要基于酶的作用機(jī)制，另一方面則基于對簡化的人工體系中識(shí)別、結(jié)合和催化的研究。要想得到一個(gè)真正有效的模擬酶，這兩方面就必須統(tǒng)一結(jié)合。 在設(shè)

31、計(jì)模擬酶時(shí)除具備催化基團(tuán)之外還要考慮到與底物定向結(jié)合的能力。二、模擬酶的理論基礎(chǔ) 2. 超分子化學(xué)（1）“主客體”化學(xué) cram把主體與客體通過配位鍵或其他次級(jí)鎂形成穩(wěn)定復(fù)合物的化學(xué)領(lǐng)域稱為“主客體”化學(xué)，主客體化學(xué)的基本意義來源于酶和底物的相互作用，體現(xiàn)為主體和客體在結(jié)合部位的空間及電子排列的互補(bǔ)，這種主客體互補(bǔ)與酶和它所識(shí)別的底物結(jié)合情況近似。 （2）超分子化學(xué) 超分子的形成源于底物和受體的結(jié)合，這種結(jié)合基于非共價(jià)鍵相互作用，如靜電作用、氫鍵和范德華力等。當(dāng)接受體與絡(luò)合離子或分子結(jié)合成穩(wěn)定的，具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的實(shí)體，即形成了“超分子”，它兼具分子識(shí)別、催化和選擇性輸出的功能。 主客體化學(xué)

32、和超分子化學(xué)已成為酶人工模擬的重要理論基礎(chǔ)，是人工模擬酶研究的重要理論武器。 在設(shè)計(jì)模擬酶之前應(yīng)當(dāng)對酶的結(jié)構(gòu)和酶學(xué)性質(zhì)有深入的了解； 酶活性中心底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)； 酶的專一性及其同底物結(jié)合的方式與能力； 反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)及各中間物的知識(shí)。 設(shè)計(jì)人工酶模型應(yīng)考慮如下因素： （1）非共價(jià)鍵相互作用； （2）反應(yīng)定向發(fā)生； （3）模型應(yīng)具有足夠的水溶性，并在接近生理?xiàng)l件下保持其催化活性。第二節(jié) 模擬酶的分類 根據(jù)kirby分類法，模擬酶可分為： 單純酶模型，即以化學(xué)方法通過天然酶活性的模擬來重建和改造酶活性； 機(jī)理酶模型，即通過對酶作用機(jī)制諸如識(shí)別、結(jié)合和過渡態(tài)穩(wěn)定化的認(rèn)識(shí)，來指導(dǎo)酶模型的設(shè)計(jì)和合成；

33、單純合成的酶樣化合物，即一些化學(xué)合成的具有酶樣催化活性的簡單分子。 按照模擬酶的屬性，模擬酶可分為： 主客體酶模型，包括環(huán)糊精、冠醚、穴醚、雜環(huán)大環(huán)化合物和卟啉類等； 膠束酶模型； 肽酶； 抗體酶； 分子印跡酶模型； 半合成酶等； 近年來又出現(xiàn)了雜化酶和進(jìn)化酶。一、主客體酶模型 （一）環(huán)糊精酶模型： 環(huán)糊精(cyclodextrin，簡稱cd)是由多個(gè)d葡萄糖以1，4糖苷鍵結(jié)合而成的一類環(huán)狀低聚糖，cd分子外側(cè)是親水的，其羥基可與多種客體形成氫鍵，其內(nèi)側(cè)是c3，c5上的氫原子和糖苷氧原子組成的空腔，故具有疏水性，因而能包結(jié)多種客體分子，很類似酶對底物的識(shí)別。環(huán)糊精作為酶模型合成的主客體酶模型

34、(二) 合成的主客體酶模型 用合成的冠醚、穴醚、環(huán)番、環(huán)芳烴等大環(huán)多齒配體用來構(gòu)筑酶模型。二、膠束模擬酶 膠束在水溶液中提供了疏水微環(huán)境(類似于酶的結(jié)合部位)，可以對底物束縛。如果將催化基團(tuán)如咪唑、硫醇、羥基和一些輔酶共價(jià)或非共價(jià)地連接或吸附在膠束上，就有可能提供“活性中心”部位，使膠束成為具有酶活力或部分酶活力的膠束模擬酶。模擬水解酶的膠束酶模型： 組氨酸的咪唑基常常是水解酶的活性中心必需的催化基團(tuán)。如將表面活性劑分子上連接上組氨酸殘基或咪唑基團(tuán)上，就有可能形成模擬水解酶的膠束。單分子膠束酶模型 將表面活性劑利用化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)在一起，制備出單分子膠束酶模型，這種酶模型比一般膠束酶優(yōu)越，它既具備

35、酶的疏水特性，同時(shí)又可以使催化基團(tuán)引人疏水空腔，催化效率提高了105倍。三、肽酶 模擬天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。四、半合成酶 半合成酶是以天然蛋白質(zhì)或酶為母體，用化學(xué)或生物學(xué)方法引進(jìn)適當(dāng)?shù)幕钚圆课换虼呋鶊F(tuán)，或改變其結(jié)構(gòu)從而形成一種新的“人工酶”。 如將枯草桿菌蛋白酶活性部位的絲織酸(ser)殘基，經(jīng)苯甲基磺酰氟特異性活化后，再用巰基化合物取代，將絲氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸。雖然產(chǎn)生的巰基化枯草桿菌蛋白酶對肽或酯沒有水解活力，但能水解高度活化的底物(如硝基苯酯等)。第三節(jié) 印 跡 酶 一、分子印跡技術(shù)概述 如果以一種分子充當(dāng)模板，其周圍用聚合物交聯(lián)，當(dāng)模板分子除去后，此聚合物就留

36、下了與此分子相匹配的空穴。如果構(gòu)建合適，這種聚合物就橡“鎖”一樣對鑰匙具有選擇性識(shí)別作用，這種技術(shù)被稱為分子印跡。分子印跡技術(shù) 所謂分子印跡是制備對某一化合物具有選擇性的聚合物的過程。這個(gè)化合物叫印跡分子，也叫做模板分子。 此技術(shù)包括如下內(nèi)容： 選定印跡分子和功能單體，使二者發(fā)生互補(bǔ)反應(yīng)； 在印跡分子單體復(fù)合物周圍發(fā)生聚合反應(yīng)；用抽提法從聚合物中除掉印跡分子。 結(jié)果，形成的聚合物內(nèi)保留有與印跡分子的形狀、大小完全一樣的孔穴。該聚合物能以高選擇性重新結(jié)合印跡分子。分子印跡聚合物的制備方法： 分子印跡聚合物的制備方法： 選定印跡分子和單體，讓他們之間充分作用； 在印跡分子周圍發(fā)生聚合反應(yīng)； 將印跡

37、分子從聚合物中抽提出去。 于是，此聚合物就產(chǎn)生了恰似印跡分子的空間，并對印跡分子產(chǎn)生識(shí)別能力。分子印跡分子 可用于分子印跡的分子很廣泛(如藥物、氨基酸、碳水化合物、核酸、激素、輔酶等)，它們均已成功地用于分子印跡的制備中。 分子印跡聚合中應(yīng)用最廣泛的聚合單體是羧酸類(如丙烯酸、甲基丙烯酸、乙烯基苯甲酸)、磺酸類以及雜環(huán)弱減類(如乙烯基吡啶、乙烯基咪唑)，其中最常用的體系為聚丙烯酸和聚丙烯酞胺體系。若要產(chǎn)生對金屬的配合作用則應(yīng)用氨基二乙酸衍生物。二、分子印跡酶 通過分子印跡技術(shù)可以產(chǎn)生類似于酶的活性中心的空腔，對底物產(chǎn)生有效的結(jié)合作用，更重要的是利用此技術(shù)可以在結(jié)合部位的空腔內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生催化基團(tuán)并

38、與底物定向排列。1. 印跡底物及其類似物 如mosbach等應(yīng)用分子印跡法制備具有催化二肽合成能力的分子印跡酶。所合成的二肽為z-l-天冬氨酸與l苯丙氨酸甲酯縮合產(chǎn)物，它們分別以底物混合物(zl天冬氨酸與l苯丙氨酸為1：1混合)以及產(chǎn)物二肽為印跡分子，以甲基丙烯酸甲酯為聚合單體，二亞乙基甲基丙烯酸甲酯為交聯(lián)劑，經(jīng)聚合產(chǎn)生了具有催化二肽合成能力的二肽合成酶。研究表明以產(chǎn)物為印跡分子的印跡聚合物表現(xiàn)出最高的酶催化效率，在反應(yīng)進(jìn)行48h后，其二肽產(chǎn)率達(dá)到63而以反應(yīng)物為印跡分子的印跡聚合物催化相同的反應(yīng)時(shí)二肽產(chǎn)率卻較低。2印跡過渡態(tài)類似物 用過渡態(tài)類似物作印跡分子制備的印跡聚合物也能結(jié)合反應(yīng)過渡態(tài)，

39、降低反應(yīng)活化能，從而加速反應(yīng)。 如用對硝基苯乙酸酯水解反應(yīng)的過渡態(tài)類似物對硝基苯甲基磷酸酯作印跡分子制備聚合物，制得的mip證明能優(yōu)先結(jié)合過渡態(tài)類似物，并能加速對硝基苯乙酸酯水解成對硝基酚和乙酸。第四節(jié) 抗 體 酶 一、抗體酶概述： 催化抗體是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物，本質(zhì)上是一類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性，因此，催化抗體也叫抗體酶。 酶和抗體的本質(zhì)差別在于：酶是能與反應(yīng)過渡態(tài)選擇結(jié)合的催化性物質(zhì)而抗體是和基態(tài)分子結(jié)合的催化性物質(zhì)。 抗體酶的發(fā)現(xiàn)不僅提供了研究生物催化過程的新途徑，而且能為生物學(xué)、化學(xué)和醫(yī)學(xué)提供具有高度特異性的人工生物催化劑，并可

40、以根據(jù)需要使人們獲得具有某些不能被酶催化或較難催化的化學(xué)反應(yīng)催化劑。二、抗體酶的制備方法 迄今，大多數(shù)抗體酶是通過理論設(shè)計(jì)合適的與反應(yīng)過渡態(tài)類似的小分于作為半抗原，然后讓動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對半抗原的抗體來獲得的。由于以反應(yīng)的過渡態(tài)類似物為半抗原誘導(dǎo)的抗體在幾何形狀和電學(xué)性質(zhì)上與反應(yīng)過渡態(tài)互補(bǔ)，因而穩(wěn)定了過渡態(tài)，從而加速反應(yīng)。1穩(wěn)定過渡態(tài)法： 以pauling的穩(wěn)定過渡態(tài)理論為指導(dǎo)，即利用反應(yīng)的過渡態(tài)類似物作為半抗原產(chǎn)生抗體酶。 shultz小組利用與底物扭曲構(gòu)象相似的扭曲卟啉作半抗原制備的抗體可催化卟啉金屬螯合反應(yīng)。亞鐵螯合酶是血紅素生物合成途徑中的末端酶，可催化亞鐵離子插入原卟啉的生物合成。

41、n甲基原卟啉由于內(nèi)部甲基取代而呈扭曲結(jié)構(gòu)，它是此酶的有效抑制劑，也與酶催化的卟啉金屬螯合反應(yīng)的過渡態(tài)類似。由于甲基卟啉的抗體可催化平面結(jié)構(gòu)原卟啉的金屬螯合，這就為該反應(yīng)過渡態(tài)扭曲結(jié)構(gòu)的作用提供了證據(jù)。2抗體與半抗原互補(bǔ)法 抗體常含有與配體功能互補(bǔ)的特殊功能基。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)帶正電的配體常能誘導(dǎo)出結(jié)合部位帶負(fù)電殘基的配體，反之亦然?？贵w與半抗原之間的電荷互補(bǔ)對抗體所具有的高親和力以及選擇性識(shí)別能力起著關(guān)鍵作用。 shokat等利用抗體與半抗原之間的電荷互補(bǔ)性，制備了針對帶正電半抗原的抗體，結(jié)果在抗體結(jié)合部位上產(chǎn)生帶負(fù)電的羧基，可作為一般堿基催化消除反應(yīng)。三、抗體酶的應(yīng)用 1 抗體酶在有機(jī)合成中的應(yīng)用:

42、 各類精細(xì)化工產(chǎn)品和合成材料的工業(yè)生產(chǎn)需要具有精確底物專一性和立體專一性的催化劑，而這正是催化抗體的突出特點(diǎn)。特別是那些天然酶不能催化的反應(yīng)，可通過設(shè)計(jì)定做抗體酶來彌補(bǔ)天然酶的不足。 2 . 用于闡明化學(xué)反應(yīng)機(jī)制 3. 抗體在醫(yī)療上的應(yīng)用: landry等用可卡因降解的過渡態(tài)類似物磷酸單酯產(chǎn)生的單克隆抗體3b9催化可卡因降解，此抗體酶的催化活性比血液中分解可卡因的丁酰膽堿酯酶要高，水解后的可卡因片斷失去了刺激功能，因此，用人工抗體酶的被動(dòng)免疫也許能提供阻斷可卡因上癮的治療從而達(dá)到戒毒的目的。四、抗體酶的研究進(jìn)展 1反應(yīng)性免疫 2抗體酶的化學(xué)篩選 3. 抗體酶催化的化學(xué)轉(zhuǎn)化第六章 酶制劑的應(yīng)用第

43、一節(jié) 概論 1.工業(yè)用酶制劑的市場和發(fā)展 2.我國酶制劑應(yīng)用方面的現(xiàn)狀和問題 3.工業(yè)酶制劑的來源與特點(diǎn) 4.選擇使用酶制劑時(shí)應(yīng)考慮的因素 5.酶制劑產(chǎn)品的開發(fā)熱點(diǎn)我國酶制劑應(yīng)用方面的現(xiàn)狀和問題 1.酶制劑企業(yè)規(guī)模太??； 2.酶制劑品種少，產(chǎn)品結(jié)構(gòu)極不合理； 3.對酶制劑的開發(fā)熱情不高，主要依賴于各大學(xué)及科研機(jī)構(gòu)，經(jīng)費(fèi)投入不足； 4.酶制劑生產(chǎn)成本太高； 5.生產(chǎn)裝備落后； 6.酶制劑應(yīng)用領(lǐng)域十分狹窄，主要集中于洗滌劑、淀粉加工、乙醇和酒類生產(chǎn)。工業(yè)酶制劑的來源與特點(diǎn) 工業(yè)酶制劑主要來源于動(dòng)物、植物和微生物，尤其是微生物，因微生物繁殖速度快；種類繁多，品種齊全；培養(yǎng)方法簡單，易于大批量生產(chǎn)。

44、工業(yè)酶制劑的特點(diǎn)：一般而言，含雜蛋白的酶制劑比純品穩(wěn)定，干燥品比液體制劑穩(wěn)定。酶是通過催化活性而不是一般質(zhì)量來識(shí)別和出售的。選擇使用酶制劑時(shí)應(yīng)考慮的因素 （1）底物特異性 （2）ph （3）溫度 （4）激活劑和抑制劑 （5）價(jià)格因素酶制劑產(chǎn)品的開發(fā)熱點(diǎn) （1）食品加工用酶， （2）飼料用酶，特別是植酸酶， （3）紡織用酶 （4）洗滌劑用酶 （5）臨床診斷用酶、治療用酶、化妝品用 酶第二節(jié) 酶在食品加工方面的應(yīng)用一、酶法生產(chǎn)葡萄糖 國內(nèi)外萄萄糖的生產(chǎn)大都采用酶法。酶法生產(chǎn)葡萄糖是以淀粉為原料，先經(jīng)淀粉酶液化成糊精，再用糖化酶催化生成葡萄糖。淀粉的液化 淀粉先加水配制成濃度為30一40的淀粉漿，p

45、h值一般調(diào)至6.065，添加一定量的淀粉酶后，在8590的溫度下保溫45min左右，使淀粉液化成糊精。液化反應(yīng)一般以碘反應(yīng)顏色正好消失時(shí)為終點(diǎn)。淀粉液的糖化 液化完成后，將液化淀粉液冷卻至5560，ph調(diào)至4.55.0，加入適量的糖化酶，保溫糖化48h左右，使糊精轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?。葡萄糖生產(chǎn)應(yīng)注意的問題 所采用的淀粉酶和糖化酶都要求達(dá)到一定的純度。尤其是糖化酶中應(yīng)不含或盡量少含葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶。因?yàn)槠咸烟擒辙D(zhuǎn)移酶會(huì)催化葡萄糖生成異麥芽糖等雜質(zhì)，會(huì)嚴(yán)重影響葡萄糖的收率。 去除葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的最簡單的方法之一是將糖化酶配成酶液后，加酸調(diào)節(jié)ph值至2.02.5，室溫下靜置一段時(shí)間，可以選擇性地破壞葡萄糖苷

46、轉(zhuǎn)移酶。二、果葡糖漿的生產(chǎn) 果葡糖漿是由葡萄糖異構(gòu)酶催化葡萄糖異構(gòu)化生成部分果糖而得到的葡萄糖與果糖的混合糖漿。方 法 將精制葡萄糖溶液調(diào)節(jié)ph為6.57.0，加入0.01mol/l的硫酸鎂，在6070的溫度條件下，由葡萄糖異構(gòu)酶催化生成果葡糖漿。異構(gòu)化率一般為4245。 鎂離子和鈷離子是葡萄糖異構(gòu)酶的激活劑，所以葡萄糖液中需加入0.01mol/l左右的硫酸鎂。三、啤酒發(fā)酵 在啤酒生產(chǎn)過程中，制漿和調(diào)理兩個(gè)階段需使用酶制劑。 在浸泡麥芽漿時(shí)，需使用蛋白酶、 淀粉酶和糖化酶。 在發(fā)酵完畢后，啤酒需要進(jìn)一步酶處理。木瓜蛋白酶、波蘿蛋白酶可以降解使啤酒渾濁的蛋白質(zhì)組分，延長啤酒的儲(chǔ)存期。四、在蛋白制

47、品加工方面的應(yīng)用 酶在蛋白制品加工中的主要用途是改善組織，嫩化肉類，轉(zhuǎn)化廢棄蛋白質(zhì)成為供人類使用或作為飼料的蛋白質(zhì)濃縮液，因而可以增加蛋白質(zhì)的價(jià)值和可利用性。 用木瓜蛋白水解酶制成嫩肉粉，使肉食嫩滑可口。 用蛋白酶生成明膠。 用溶菌酶處理肉類，則微生物不能繁殖，因此肉類制品可以保鮮和防腐等。 葡萄糖氧化酶在食品工業(yè)上主要用來去糖和脫氧，保持食品的色、香、味，延長保存時(shí)間。五、在水果、蔬菜加工方面的應(yīng)用 用果膠酶處理潰碎果實(shí)，可加速果汁過濾，促進(jìn)澄清。主要依靠降低粘度使懸濁物質(zhì)失去保護(hù)膠體而沉降。 葡萄糖氧化酶可除去果汁、飲料、罐頭食品和干燥果蔬制品中的氧氣，防止產(chǎn)品氧化變質(zhì)，防止微生物生長，以

48、延長食品保存期，也可用葡萄糖氧化酶保鮮。 溶菌酶可防止細(xì)菌污染，起食品保鮮作用等。六、乳品工業(yè) 凝乳酶制造干酪； 過氧化氫酶牛奶消毒； 溶菌酶添加在嬰兒奶粉；人奶與牛奶的區(qū)別之一在于溶菌酶含量的不同，奶粉中添加卵清溶菌酶可防止嬰兒腸道感染。 乳糖酶分解乳糖； 脂肪酶黃油增香。七、肉類和魚類加工 酶在這方面的兩個(gè)用途是改善組織、激化肉類，及轉(zhuǎn)化廢棄蛋白質(zhì)使其成為供人類食用或作為飼料的蛋白質(zhì)濃縮物。 蛋白酶還用于生產(chǎn)牛肉汁、雞汁等來提高產(chǎn)品收率。八、蛋品加工 用葡萄糖氧化酶去除蛋品中的微量葡萄糖，是酶在蛋品加工中的一項(xiàng)重要用途。 葡萄糖氧化酶的作用是催化葡萄糖脫氫，氧化成為葡萄糖酸同時(shí)產(chǎn)生過氧化氫

49、，后者被共存的過氧化氫酶催化分解為水和氧，一分子葡萄糖氧化酶在1min內(nèi)可催化34000個(gè)葡萄糖分子。第三節(jié) 酶在輕工業(yè)方面的應(yīng)用 酶在輕工業(yè)方面的應(yīng)用十分廣泛。 概括起來主要有3個(gè)方面的用途。 (1) 用酶進(jìn)行原料處理， (2) 用酶生產(chǎn)各種產(chǎn)品， (3) 用酶增強(qiáng)產(chǎn)品的使用效果。 一、酶在原料處理方面的應(yīng)用 (1) 發(fā)酵原料的處理：發(fā)酵工業(yè)大多數(shù)以淀粉為主要原料。有些微生物由于本身缺乏淀粉酶系，無法直接利用淀粉。故此必須先經(jīng)過原料處理，將淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的單糖或二糖，才能利用。例如，酒精、酒類、甘油、乳酸、氨基酸、核苷酸等發(fā)酵所使用的酵母或細(xì)菌等微生物，一般都不能直接利用淀粉進(jìn)行發(fā)酵。 淀

50、粉原料的處理，一般是采用淀粉酶進(jìn)行液化，然后再經(jīng)糖化酶進(jìn)行糖化，將淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟恰?2) 紡織原料的處理 在紡織工業(yè)中，為了增強(qiáng)纖維的強(qiáng)度和光滑性，便于紡織，需要先行上漿。將淀粉用淀粉酶處理一段時(shí)間，使粘度達(dá)到一定程度就可用作上漿的漿料。(3)造紙?jiān)系闹茲{ 造紙?jiān)系睦w維中含有大量木質(zhì)素，若不除去則會(huì)嚴(yán)重影響紙的質(zhì)量。用木質(zhì)素酶可以使木質(zhì)素水解而除去，不但可提高紙的質(zhì)量，而且使環(huán)境污染程度大為減輕。(4) 生絲的脫膠處理 天然蠶絲的主要成分是不溶于水的有光澤的絲蛋白。采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或微生物蛋白酶處理，可在比較溫和的條件下催化絲膠蛋白水解，進(jìn)行生絲脫膠。二、輕工產(chǎn)品方面的應(yīng)用 1.

51、 酶法生產(chǎn)甜味劑： 在青桔柑中合有10一20的橙皮苷，經(jīng)抽提后用黑曲霉桔皮苷酶水解除去分子中的鼠李糖，在堿性下水解和還原，可得到一種甜味強(qiáng)烈的橙皮素葡萄糖苷二氫查耳酮。它的甜度是蔗糖的70一100倍，是一種安全、低熱的甜味劑，可是它的溶解度很低，僅0.1，故無實(shí)用價(jià)值，若將此物與淀粉溶液混合，利用環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的偶聯(lián)反應(yīng)使其葡萄糖分子接上兩個(gè)葡萄糖分子于是使溶解度提高10倍而不影響甜度。二、輕工產(chǎn)品方面的應(yīng)用 2酶法生產(chǎn)l氨基酸 3酶法生產(chǎn)核苷酸 4. 酶法生產(chǎn)有機(jī)酸 5丙烯酰胺的生產(chǎn) 6鄰苯二酚的生物合成 7用于明膠、膠原纖維生產(chǎn)三、加酶增加產(chǎn)品的使用效果 1加酶洗滌劑: 洗滌用的酶制劑需要滿足下列條件：堿性條件(ph 910)下能夠有效洗滌；表面活性劑存在下，很少失活：在熒光染料、漂白劑、香料等洗滌劑輔助成分存在下不失活；在洗滌溫度下能有效地發(fā)揮作用。三、加酶增加產(chǎn)品的使用效果 2加酶清洗劑 3加酶牙膏、牙粉和漱口水 4加酶飼料 5加酶護(hù)膚品酶工程復(fù)習(xí)題一、名詞解釋1、酶的活性中心：2、km：3、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)：4、競爭性抑制：5、人工模擬酶：6、測糖試紙： 7