課題申報(bào)書日本血吸蟲（中國大陸株）尾蚴的性別鑒定應(yīng)用技術(shù)研究

1、登記序號(hào) 項(xiàng)目編號(hào) 科研設(shè)計(jì)書項(xiàng)目名稱： 日本血吸蟲尾蚴性別鑒定應(yīng)用技術(shù)的研究承擔(dān)單位： 單位地址： 郵政編碼： 開 戶 行： 帳 號(hào)： 1103021109000077488項(xiàng)目負(fù)責(zé)人： 電 話： 職務(wù)職稱： 填報(bào)日期 2004年7月28日江蘇省地方病協(xié)會(huì)二四年制一、 立項(xiàng)依據(jù)：血吸蟲是一具有兩性染色體的吸蟲，有8對(duì)染色體，其中雌性性染色體為異配子體（zw），雄性為同配子體（zz）。盡管雌性和雄性成蟲階段具有明顯的性別二態(tài)性，可用肉眼區(qū)別，但在幼蟲階段即毛蚴、胞蚴和尾蚴階段，無明顯的性別二態(tài)性，肉眼難以區(qū)別。傳統(tǒng)動(dòng)物感染方法，是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)取感染了血吸蟲的鼠或其它嚙齒類動(dòng)物的肝、腸或糞便收集蟲

2、卵，孵化毛蚴，用單只毛蚴感染單只釘螺，養(yǎng)殖篩選陽性釘螺，獲得單性尾蚴，用以感染嚙齒動(dòng)物，待其發(fā)育至成蟲階段，解剖動(dòng)物收集成蟲，用肉眼或在解剖顯微鏡下根據(jù)形態(tài)學(xué)的差異，確定感染尾蚴性別。然而，單性雌性尾蚴不能發(fā)育到完全成熟的成蟲，給鑒別帶來一定困難。同時(shí)常規(guī)方法需要花費(fèi)時(shí)間長，日本血吸蟲從尾蚴感染動(dòng)物到發(fā)育成熟至少需3周。采用分子生物學(xué)的方法，可快速鑒定尾蚴的性別。代表性差異分析（rda）方法是基于遞減雜交法，用于發(fā)現(xiàn)兩dna基因組群間差異，是一種改良的扣除雜交法，并可用于分離基因組間差異性片段。由于血吸蟲為兩性染色體的吸蟲，其雄性為同性配子體（zz），而雌性為異性配子體（zw）。rda方法從宏

3、觀上看，系用雄蟲染色體zz去扣除雌蟲染色體中的z，從而獲得w染色體。drew a.c.等（1995）采用此方法分離出兩段曼氏血吸蟲雌性特異性序列，并將其制備成探針，用southern blot 方法證實(shí)只與曼氏血吸蟲雌性基因組dna特異性雜交。w1重復(fù)序列作為雌性特異性序列，存在于曼氏血吸蟲波多黎各株生活史的各個(gè)階段。并根據(jù)曼氏血吸蟲雌性該特異性序列w1設(shè)計(jì)出一對(duì)引物w1a和w1b。直接加入該引物對(duì)單個(gè)尾蚴作pcr擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果雌性尾蚴呈現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物pcr-w1條帶，雄性尾蚴不呈現(xiàn)擴(kuò)增條帶。此方法能快速、可靠地用來鑒定曼氏血吸蟲尾蚴的性別?；诼涎x尾蚴性別鑒定的現(xiàn)有方法，為探索

4、適合日本血吸蟲尾蚴性別鑒定方法提供了理論和方法依據(jù)。利用代表性差異分析（rda）方法，分離出日本血吸蟲雌性特異性序列，將此特異性序列制備成dna探針，用southern blot 方法鑒定日本血吸蟲尾蚴性別。也可對(duì)此特異性序列進(jìn)行測序，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，對(duì)單個(gè)尾蚴的dna作pcr擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，則雌性尾蚴呈現(xiàn)擴(kuò)增條帶，雄性則不呈現(xiàn)擴(kuò)增條帶，從而用pcr方法可快速鑒定日本血吸蟲單個(gè)尾蚴的性別。研究日本血吸蟲尾蚴的性別鑒定技術(shù)，建立日本血吸蟲尾蚴快速鑒定應(yīng)用技術(shù)有助于血吸蟲幼蟲階段生物學(xué)和生理學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究；對(duì)血吸蟲病疫苗評(píng)價(jià)方法的標(biāo)準(zhǔn)化、遺傳學(xué)的研究；及其流行病學(xué)、感染診斷和病理學(xué)研究結(jié)果的正確

5、評(píng)價(jià)；不同性別尾蚴的易感性和感染比率以及減蟲率（減雌率）和減卵率的正確評(píng)估等均具有重要的意義。同時(shí)為進(jìn)一步開發(fā)適合我國國情的日本血吸蟲尾蚴性別鑒定試劑盒打下基礎(chǔ)。二、 主要研究內(nèi)容、關(guān)鍵技術(shù)、目標(biāo)：1、 研究內(nèi)容1.1 用代表性差異分析方法獲得日本血吸蟲雌性基因組dna特異性序列。1.2 對(duì)特異性序列測序，設(shè)計(jì)引物，pcr擴(kuò)增。1.3 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)建立一種簡單、快速的日本血吸蟲尾蚴性別鑒定方法。2、 關(guān)鍵技術(shù)2.1 日本血吸蟲雄蟲、雌蟲基因組dna的提取2.2 代表性差異分析方法（rda）和pcr。2.3 低熔點(diǎn)凝膠回收雌性特異性片段2.4 大腸桿菌e.coli tg1感受態(tài)細(xì)胞的制備技術(shù)、dna

6、的重組和克隆篩選、重組dna的轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒dna的提取。2.5 dna探針的制備和southern blot 驗(yàn)證方法2.6 雌性特異性序列測序和引物設(shè)計(jì)。3、 目標(biāo)建立一種簡單、快速、靈敏的日本血吸蟲尾蚴性別鑒定方法。三、 研究方法及技術(shù)路線1. 用傳統(tǒng)方法確定尾蚴的性別，獲取單性尾蚴樣本1.1 以逸蚴法篩選出陰性釘螺用于感染，所有用于實(shí)驗(yàn)的螺均篩選3次。1.2 以單只毛蚴感染單只釘螺；螺感染后在光照培養(yǎng)箱中養(yǎng)殖90天或在春夏季室溫條件下養(yǎng)殖100天。逸蚴法篩選出陽性釘螺，取單性尾蚴感染小鼠，35天后剖殺，取成蟲確定尾蚴的性別。并分別收集單性尾蚴分別編號(hào)保存于-70液氮備用。2. 用代表性差異

7、分析方法分離日本血吸蟲雌性特異性序列2.1 感染家兔4只，每只約用1500-1800條尾蚴。45天后剖殺家兔，收集成蟲，在解剖鏡下將成蟲雌雄分開，分別保存于-70液氮中備用。2.2 取雌蟲、雄蟲各200條用基因組dna提取試劑盒分別提取雌蟲和雄蟲的基因組dna。2.3 用限制性內(nèi)切酶hind對(duì)雌蟲、雄蟲dna進(jìn)行酶切。將酶切產(chǎn)物與兩條適配子（r hind24,5-agcactctccagcctctcaccgca-3和r hind12,5-agcttgcggtga-3）組成的接頭用t4連接酶進(jìn)行連接。2.4 以連接物為摸板，做pcr擴(kuò)增；并瓊脂糖凝膠電泳看連接情況。2.5 擴(kuò)增子的純化 對(duì)雌蟲、

8、雄蟲dna的pcr產(chǎn)物用pcr純化試劑盒純化，限制性內(nèi)切酶hind酶切。將酶切后的pcr產(chǎn)物過交聯(lián)葡聚糖g-50柱去除適配子接頭r hind24和r hind12。如此制備的雌蟲dna為檢測子，雄蟲dna為驅(qū)動(dòng)子。2.6 扣除雜交法及pcr2.6.1 取以上的檢測子1ug連接新的適配子接頭（j hind24 5-accgacgtcgactatccatgaaca-3和j hind12 5-agcttgttcatg-3）；然后取0.5ug帶有新接頭的檢測子與40ug的驅(qū)動(dòng)子溶于4ul的3×ee緩沖液中，加入1ul的5m的nacl，扣除雜交，67、20小時(shí)；并做pcr和瓊脂糖凝膠電泳。2.

9、6.2 將rda的第一輪pcr產(chǎn)物酶切后，過交聯(lián)葡聚糖g-50柱去除適配子接頭j hind24和j hind12，連接下一個(gè)新的適配子接頭（n hind24 5-aggcagctgtggtatcgagggaga-3和n hind12 5-agcttctccctc-3），取檢測子0.1ug與40ug驅(qū)動(dòng)子進(jìn)行第二輪rda，pcr和瓊脂糖凝膠電泳。2.6.3 同上，酶切后過交聯(lián)葡聚糖g-50柱去除適配子接頭n hind24和n hind12，再連接適配子接頭j hind24和j hind12，取400pg檢測子與40ug驅(qū)動(dòng)子進(jìn)行第三輪扣除雜交，pcr和瓊脂糖凝膠電泳。2.7 將獲得的特異性dna

10、片段進(jìn)行低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收，pcr純化試劑盒純化。2.8.1 制備大腸桿菌e.coli tg1感受態(tài)細(xì)胞：本實(shí)驗(yàn)以e.coli tg1菌株為受體細(xì)胞，用氯化鈣處理是受體菌處于感受狀態(tài)。2.8.2 dna的重組和克隆篩選：將獲得特異性dna片段連接到載體質(zhì)粒puc19制得重組質(zhì)粒；經(jīng)-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選（藍(lán)白斑篩選）方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行篩選。2.8.3 重組dna的轉(zhuǎn)化：用電擊轉(zhuǎn)化的方法，設(shè)定電擊儀參數(shù)（電脈沖25uf、電壓2.5kv、電阻200）；吸取一定量的感受態(tài)細(xì)胞和重組質(zhì)粒puc19，加入預(yù)冷的電擊杯，放入樣品池，按以上設(shè)定參數(shù)啟動(dòng)對(duì)細(xì)胞的電脈沖，儀器會(huì)顯示4-5ms具有12.5kv/cm的電

11、場強(qiáng)度，脈沖結(jié)束后，將細(xì)胞取出加入到1mlsoc培養(yǎng)液中復(fù)蘇1h，接種于特制平板上，37培養(yǎng)。2.8.4 挑選培養(yǎng)出的單個(gè)白色菌落，接種于液體培養(yǎng)；用質(zhì)粒dna提取試劑盒提取質(zhì)粒dna。2.9 southern-blot 方法驗(yàn)證：利用dig dna labeling anddetection kit制備dna探針和southern-blot驗(yàn)證。3. 將經(jīng)southern-blot方法驗(yàn)證出的雌蟲特異性序列進(jìn)行測序，并設(shè)計(jì)引物。4. 根據(jù)設(shè)計(jì)好的引物，對(duì)提取的成蟲基因組dna和已知性別的尾蚴dna作pcr，瓊脂糖凝膠電泳來進(jìn)行證實(shí)。5. 根據(jù)設(shè)計(jì)好的引物，采用直接法（不提取dna）對(duì)單個(gè)尾蚴

12、作pcr，瓊脂糖凝膠電泳，來確定此尾蚴的性別。6日本血吸蟲尾蚴性別鑒定pcr法操作條件優(yōu)化研究。四、 現(xiàn)有工作條件和基礎(chǔ)：1 工作基礎(chǔ)本實(shí)驗(yàn)室是江蘇省寄生蟲分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寄生蟲學(xué)為江蘇省135重點(diǎn)學(xué)科，擁有清潔級(jí)小鼠動(dòng)物房，從事寄生蟲免疫學(xué)和分子生物學(xué)研究二十余年，在儀器設(shè)備上完全具備進(jìn)行寄生蟲免疫學(xué)和分子生物學(xué)研究以及動(dòng)物試驗(yàn)的的條件。有一定的專業(yè)技術(shù)和專業(yè)人員隊(duì)伍，人員配置合理。2 儀器設(shè)備主要包括溫控設(shè)備：4、-20、-70冰箱、thz-95型恒溫振蕩器、scs-24型搖床、光照培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、微波爐等；凈水設(shè)備：milliq水純化設(shè)備；消毒設(shè)備：高壓蒸氣滅菌鍋；計(jì)量設(shè)備：各

13、種精密度天平、量筒、移液管及各種規(guī)格的可調(diào)試微量移液器、ph計(jì)、紫外分光光度計(jì)等；離心設(shè)備：各種不同規(guī)格的普通、高速冷凍離心機(jī)；蛋白核酸分析設(shè)備：dy-a瓊脂糖凝膠電泳儀、多功能蛋白電泳儀（bio-rad）、核苷酸序列分析儀（bio-rad）、核酸蛋白測定儀(beckman)、快速蛋白液相層析系（pharmacia）等；其它分子生物學(xué)儀器：pcr儀、超聲儀、電穿孔轉(zhuǎn)基因儀、干膠儀、酶標(biāo)儀、凝膠掃描儀、影像密度掃描儀等。五、 計(jì)劃進(jìn)度：總期限一年：1-3月 采購釘螺，并篩選陰性釘螺。2-4月 購陽性釘螺并感染家兔，剖殺家兔收集成蟲和蟲卵。4-5月 單只毛蚴感染單只釘螺.4-5月 訂購試劑5-11

14、月 分離雌蟲特異性序列，并測序和設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行尾蚴性別鑒定。11-12月 收集、分析資料和書寫總結(jié)報(bào)告六、 項(xiàng)目研究預(yù)期成果及效益 采用分子生物學(xué)技術(shù)，建立一種快速、準(zhǔn)確、有效的日本血吸蟲尾蚴性別鑒定方法，并為進(jìn)一步開發(fā)響應(yīng)的鑒定試劑盒打下基礎(chǔ)；和發(fā)表相應(yīng)的論文。七、 經(jīng)費(fèi)預(yù)算試劑 萬元試驗(yàn)動(dòng)物 萬元試驗(yàn)耗材費(fèi) 萬元交通、差旅費(fèi)用 萬元管理費(fèi) 萬元總計(jì) 萬元八、 主要研究人員單位 姓名 性別 年齡 專業(yè) 職務(wù)（稱）項(xiàng)目中的作用九、單位意見、蓋章 年 月 日 十、主管部門意見、蓋章 年 月 日登記序號(hào)： 項(xiàng)目編號(hào)：中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合科研項(xiàng)目課題設(shè)計(jì)書課題名稱：痛痹顆粒對(duì)骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞凋亡和增殖的機(jī)

15、理研究申報(bào)單位： 江蘇省中醫(yī)院課題負(fù)責(zé)人： 朱萱萱計(jì)劃年限：郵政編碼： 210029 聯(lián)系電話： 8661714130306申報(bào)日期：江蘇省中醫(yī)藥局制填寫提綱一、立項(xiàng)依據(jù)：與選題直接相關(guān)的國內(nèi)外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢；選題的理論和實(shí)踐依據(jù)；研究目的、意義；本研究達(dá)到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用推廣前景。二、科研假說或技術(shù)構(gòu)思，主要研究內(nèi)容、關(guān)鍵技術(shù)、目標(biāo)（達(dá)到的主要技術(shù)指標(biāo)或技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)），技術(shù)特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項(xiàng)目應(yīng)說明開發(fā)規(guī)模。三、研究試驗(yàn)方法及技術(shù)路線（工藝路線）。四、現(xiàn)有工作條件和基礎(chǔ)：開展本項(xiàng)研究的技術(shù)優(yōu)勢，現(xiàn)有的主要儀器設(shè)備及應(yīng)用合格實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本條件等；已有工作基礎(chǔ)，預(yù)

16、試驗(yàn)情況。五、計(jì)劃進(jìn)度：根據(jù)總的研究期限、年度計(jì)劃進(jìn)度，分別列出具體的目標(biāo)和進(jìn)度的考核指標(biāo)。六、參加（協(xié)作）單位意見及具體分工（附協(xié)議書）。七、經(jīng)費(fèi)概算（包括其他部門的撥款、貸款、自籌記憶取得的自主）和核算依據(jù)，以及分年度使用計(jì)劃。填寫說明一、內(nèi)容填寫自備附頁，用紙大小和封頁一致，字跡清楚，裝訂整齊后按申報(bào)要求上報(bào)。二、填寫提綱所列內(nèi)容，要全面詳細(xì)、如實(shí)填寫。三、封面上“登記序號(hào)”“項(xiàng)目編號(hào)”請勿填寫。1、 立項(xiàng)依據(jù)1.1 研究目的、意義骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，oa）又稱退行性關(guān)節(jié)病，以關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生彌漫性龜裂、纖維化和脫失及因骨組織增生性變化為特征的一組臨床征候群，是多見于中年

17、以后的慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)疾患。該病發(fā)病率隨年齡增長而升高，據(jù)調(diào)查，在美國目前2億多人口中，就有骨關(guān)節(jié)炎4500萬，發(fā)病率占總?cè)丝诘?0%，在老年人中所占比例更高，50歲以上人群中，oa的患病率僅次于心血管疾病，位居第二位。在我國，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，5564歲的人群中發(fā)病率達(dá)40%，而65歲以上人群的患病率達(dá)60%90%。隨著計(jì)劃生育政策的長久實(shí)施及經(jīng)濟(jì)發(fā)展，我國已進(jìn)入老齡化社會(huì)，oa的發(fā)病率還將越來越高，這不僅嚴(yán)重危害人民的生活、健康，對(duì)社會(huì)也將造成很大負(fù)擔(dān)。同時(shí)世界其他國家也面臨著同樣的問題，因而oa引起了國際、國內(nèi)醫(yī)學(xué)界的相當(dāng)重視。近年來對(duì)oa的研究頗多，在發(fā)病機(jī)制、檢測手段以及治療方法上

18、均取得較大進(jìn)步，但總的來說還缺乏令人滿意的突破性進(jìn)展。西藥治療oa的主要手段是非甾體藥，但存在副作用大、作用單一及有較多禁忌癥等缺點(diǎn)。雖然中藥治療oa也取得了一些經(jīng)驗(yàn)，但對(duì)其具體的作用機(jī)制有深入研究的卻很少，因此在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，對(duì)療效確切的中藥復(fù)方進(jìn)行深入的機(jī)理研究，使中藥治療oa的療效在國際先進(jìn)行列中占一席之地，是擺在我們面前非常重要的課題。1.2 國內(nèi)外現(xiàn)狀水平和發(fā)展趨勢近十年來，國內(nèi)外對(duì)oa進(jìn)行了較深入地研究，大致歸納如下：1.2.1 流行病學(xué)研究已廣泛開展在近100種不同類型的關(guān)節(jié)疾病中，oa是影響人類健康最常見的關(guān)節(jié)疾患之一，沒有明顯的種族和地域差異，本病的患病

19、率隨年齡增加而增高，故隨著人類平均壽命的延長，患病率也有增高的趨勢。felson等報(bào)道70歲以下人群膝oa患病率為7%（男6.4%，女11.4%），80歲以上為11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射學(xué)膝oa70歲以上為27.4%（男30.4%，女25.1%），80歲以上為43.7%。butter等報(bào)道，44歲以下、4559歲、60歲以上人群中，放射血oa 患病率各為6.2%、21.6%和42.0%。國內(nèi)陳順樂等隊(duì)13541名鋼鐵工人的調(diào)查結(jié)果顯示，癥狀性oa患病率2.2%；無癥狀性oa患病率53%，其中3039、4049、5059歲患病率各為11%、27%和62%。汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院統(tǒng)計(jì)5

20、51例，結(jié)果40歲以下、4049、5059和60歲以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同關(guān)節(jié)oa易感性不同。美國在衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)中心調(diào)查結(jié)果，oa患病率以手最高，以下依次為足、膝、髖。國內(nèi)陳順樂等調(diào)查結(jié)果oa是頸椎最多，以下依次為腰椎、膝、手和腕。本病性別差異在脊柱差別不大，但手、膝、髖oa均以女性較多，且女性骨關(guān)節(jié)炎的遺傳易感性較男性高。在framingham的研究中，felaon等發(fā)現(xiàn)女性體重減少11磅，骨關(guān)節(jié)炎形成的風(fēng)險(xiǎn)相應(yīng)減少50%。 saase等調(diào)查結(jié)果，膝oa患病率男、女峰值分別為24.7%和54.6%。根據(jù)1994年統(tǒng)計(jì)，在美國，骨關(guān)節(jié)炎的消耗為155億美元，

21、約為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的3倍，其中一半以上消耗緣于工作喪失。在我國雖未作全國大范圍的普查，但隨著老齡化社會(huì)進(jìn)程的不斷加快，oa的發(fā)病率會(huì)越來越高，這必將給家庭、社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。1.2.2 病因、發(fā)病機(jī)制有了巨大突破目前基礎(chǔ)研究認(rèn)為軟骨的損傷與退變是oa的根本，隨著分子生物學(xué)免疫學(xué)的發(fā)展，近年來眾多學(xué)者對(duì)oa關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的原因從不同角度進(jìn)行了大量研究，其發(fā)病機(jī)制仍未完全明了，又提出了許多學(xué)說，如軟骨下骨內(nèi)高壓學(xué)說：由于骨血液動(dòng)力學(xué)的改變，在骨髓腔容積不變的前提下增加內(nèi)容物引起壓力增高，即表現(xiàn)為骨內(nèi)壓力增高。骨內(nèi)高壓持續(xù)增高存在下關(guān)節(jié)滑液ph值下降，成分改變，干擾并破壞了軟骨細(xì)胞的正常代謝導(dǎo)致細(xì)

22、胞變性壞死，膠原纖維解聚，蛋白多糖分解，軟骨下骨破壞、修復(fù)，最終產(chǎn)生骨性關(guān)節(jié)炎。自由基學(xué)說：認(rèn)為自由基對(duì)軟骨細(xì)胞dna和pg的合成具有抑制作用。自由基作用軟骨細(xì)胞后，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化，使脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛增多，丙二醛可與dna發(fā)生交聯(lián)，自由基也可直接攻擊軟骨細(xì)胞dna即合成dna所需的酶，使dna鏈斷裂、堿基損傷從而影響了dna的合成，也造成前列腺（pg）合成障礙。骨關(guān)節(jié)炎時(shí)，滑膜、滑液、血管翳內(nèi)常有中性白細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞浸潤，其表面受免疫復(fù)合物、補(bǔ)體等作用能釋放大量o2-和h2o2；細(xì)胞因子學(xué)說：細(xì)胞因子對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展起了重要作用，如白細(xì)胞介素-1（il-1）、白細(xì)胞介素-6(i

23、l-6)、腫瘤壞死因子（tnf）等在oa中水平明顯增高。il-1具有刺激軟骨細(xì)胞分泌一氧化氮、前列腺e和il-6的作用，引起滑膜炎癥和疼痛，同時(shí)il-1也是軟骨基質(zhì)降解的主要驅(qū)動(dòng)因子；軟骨酶降解學(xué)說：oa軟骨細(xì)胞的基質(zhì)降解酶類的合成與分泌率明顯增加，并與關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。參與降解基質(zhì)大分子的降解酶類可以增加達(dá)到幾倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白?；|(zhì)金屬蛋白酶，尤其是基質(zhì)溶素和膠原酶，參與關(guān)節(jié)軟骨的降解過程，這些酶類可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分，與循環(huán)系統(tǒng)中的纖維蛋白溶酶和局部合成的纖溶酶原一起，快速降解軟骨。在滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的il-1和tnf的作用下，軟骨細(xì)胞以

24、酶原的形式分泌大量的基質(zhì)金屬蛋白酶，而對(duì)金屬蛋白酶組織抑制劑無影響，使二者失衡從而增加對(duì)軟骨主要成分型膠原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使軟骨進(jìn)行性破壞；一氧化氮學(xué)說：no是一種細(xì)胞間信使分子，可介導(dǎo)許多生物學(xué)現(xiàn)象。nos可催化重要炎性介質(zhì)no的產(chǎn)生，oa患者血清、滑液中no含量明顯高于正常。no可通過抑制軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，改變蛋白多糖和膠原蛋白的合成與分泌功能，同時(shí)使軟骨細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸減少，滑膜粘蛋白解聚，抑制軟骨細(xì)胞合成軟骨基質(zhì)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞糖酵解，使軟骨破壞。細(xì)胞凋亡學(xué)說：細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的形式之一，許多正常組織均可發(fā)現(xiàn)凋亡，但凋亡亢進(jìn)與不足則會(huì)引起相關(guān)疾病，在骨關(guān)節(jié)炎患者

25、軟骨中軟骨細(xì)胞的凋亡有異常表現(xiàn)，且凋亡細(xì)胞數(shù)目與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度明顯相關(guān)。凋亡小體存在于軟骨細(xì)胞小孔或間隙內(nèi)，其產(chǎn)生的焦磷酸鹽能從溶液中沉積鈣，有ntpph（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和堿性磷酸酶作用,造成余下軟骨細(xì)胞修復(fù)過程失敗，而逐漸發(fā)展成關(guān)節(jié)軟骨的完全丟失。oa軟骨細(xì)胞凋亡主要通過兩種相互獨(dú)立的途徑完成，一種是同滑膜炎癥無關(guān)的途徑,由no介導(dǎo);另一種是同滑膜炎癥相關(guān)的途徑,由fas介導(dǎo)。典型的oa不存在明顯的炎癥反應(yīng),此時(shí)軟骨細(xì)胞凋亡以no途徑為主;當(dāng)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)時(shí),則通過as途徑加劇軟骨細(xì)胞凋亡和關(guān)節(jié)破壞。no通過兩種方式

26、造成組織及細(xì)胞損傷。一是高濃度的no能抑制多種與線粒體呼吸傳遞系統(tǒng)及檸檬酸循環(huán)有關(guān)的酶,從而抑制線粒體呼吸,造成組織損傷;二是no與超氧化陰離子2-反應(yīng),生成氧化亞硝基陰離子onoo-,在酸性條件下(如病理?xiàng)l件)迅速分解為oh-和no2自由基,這兩種自由基具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,可造成組織細(xì)胞損傷。在oa患者中,受損區(qū)軟骨細(xì)胞的凋亡比例明顯高于未受損區(qū)。fas表達(dá)的結(jié)果與其相符,oa受損區(qū)的fas表達(dá)遠(yuǎn)高于未受損區(qū),提示fas表達(dá)可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。除no途徑和fas途徑外,還有一些因素可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡、關(guān)節(jié)破壞,如il-1、il-8、tnf-、pge2、aggrecan g1區(qū)等。1.2.3

27、治療方面有了不少新方法目前中西醫(yī)治療oa的藥物較多，西藥治療oa主要有三大類，第一類為快作用藥，即非甾體藥，特點(diǎn)是發(fā)揮作用快，但副作用較大，對(duì)胃腸、肝腎、血小板均有較大影響，oa多為老年人，長期服用此類藥尤其不能耐受，且部分藥物價(jià)格不菲，而且由于過分的鎮(zhèn)痛，導(dǎo)致病人失去警惕過分運(yùn)動(dòng)，以致出現(xiàn)“消炎痛髖”，從長期療效來看反而不佳，最新觀點(diǎn)認(rèn)為乙酰氨基酚應(yīng)作為治療oa的首選藥，但尚有一定爭議，且同樣存在上述副作用；第二類為慢作用藥，發(fā)揮作用慢，療效不確切，價(jià)格昂貴，臨床上尚未廣泛運(yùn)用；第三類為軟骨保護(hù)劑，尚未問世。關(guān)節(jié)清理術(shù)、膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，適應(yīng)癥較少，費(fèi)用高，創(chuàng)傷大，病人難以接受。中哦藥治療oa的

28、研究取得了可喜的進(jìn)步，但中藥治療仍存在較多共性的問題：多屬臨床經(jīng)驗(yàn)，無對(duì)照組，特別是西藥對(duì)照組觀察，處方不固定。缺乏用客觀的最新的國際公認(rèn)的、量化的臨床觀察指標(biāo)及療效判斷標(biāo)準(zhǔn)為手段來尋找治療oa的中藥。未針對(duì)oa發(fā)病機(jī)制進(jìn)行臨床及動(dòng)物試驗(yàn)從生化、免疫、病理、細(xì)胞分子水平來探討中藥的藥物作用機(jī)理。缺乏高效的、作用綜合、副作用小的新藥。中醫(yī)認(rèn)為oa屬痹癥中的痹、痛痹、骨痹，認(rèn)為其病因與年老體衰、長期勞損、外感風(fēng)寒濕邪有關(guān)，明確指出肝腎虧虛、氣血不足、筋骨失養(yǎng)為oa的發(fā)病基礎(chǔ)，而寒濕、痰瘀為病理因素及病理產(chǎn)物。周尊謙等人在傳統(tǒng)中醫(yī)理論基礎(chǔ)上，闡述了膝oa骨內(nèi)高壓血瘀證氧自由基之間的密切關(guān)系；謝林等論

29、述了膝oa與血瘀證之間的內(nèi)在聯(lián)系，旨在為運(yùn)用活血化淤藥治療oa提供理論依據(jù)。治療方面從古到今絕大部分醫(yī)家皆針對(duì)其病因病機(jī)采用益肝腎、強(qiáng)筋骨、補(bǔ)氣血治其本；散寒通絡(luò)、化痰勝濕治其標(biāo)。獨(dú)活寄生湯是用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛和腦血管后遺癥的傳統(tǒng)固防，具有補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)之功，臨床常見本方加減治療oa，療效比較肯定。朱健兒以本方加味治療262例，總有效率94.7%。單文龍等用本方加減治療骨關(guān)節(jié)炎24例，有效率為87.5%。陸智報(bào)道用本方加減治療104例，總有效率91.3%。1.2.4 實(shí)驗(yàn)研究方面有了較大的進(jìn)展隨著對(duì)oa發(fā)病機(jī)理的不斷深入認(rèn)識(shí)，對(duì)oa的實(shí)驗(yàn)研究方面也開始了向多層次多角度的方向發(fā)展。動(dòng)物

30、實(shí)驗(yàn)不再只局限于微循環(huán)和一般抗炎、鎮(zhèn)痛試驗(yàn)，現(xiàn)已使用針對(duì)oa的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并采用相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行檢測。目前實(shí)驗(yàn)研究內(nèi)容主要有以下幾個(gè)方面，研究最多的是oa的血液流變學(xué)、氧自由基及一氧化氮含量等，這些試驗(yàn)一般均可通過建立骨關(guān)節(jié)炎的模型來完成，也可通過使用其它相似的模型檢測相關(guān)指標(biāo)來進(jìn)行，如可建立急性血淤模型來檢查血液流變學(xué)指標(biāo)，使用老齡動(dòng)物通過檢測體內(nèi)sod及mda含量推斷藥物的抗氧自由基的能力等。在no對(duì)oa影響的實(shí)驗(yàn)中，一般采用硝酸還原酶法來測定no含量，運(yùn)用pt-pcr技術(shù)測定nos基因表達(dá)。il-1、il-6、tnf等細(xì)胞因子、軟骨降解酶尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶、誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜炎癥的物質(zhì)如纖溶酶原

31、/纖溶酶原激活物和前列腺素pge2、軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡及增殖情況、性激素水平等也越來越多地被作為檢測指標(biāo)使用到實(shí)驗(yàn)研究中來。1.3 選題的理論和實(shí)踐依據(jù)祖國醫(yī)學(xué)并無骨關(guān)節(jié)炎的病名，從歷代文獻(xiàn)來看本病應(yīng)歸屬于“骨痹”、“痛痹”范疇。我們認(rèn)為oa病人除了肝腎虧虛，寒濕痹阻外，一般oa病人體重超重較多，也即為痰濕偏盛之體，另外脾虛生濕及寒濕痹阻日久濕聚成痰，痰淤交阻是引起膝關(guān)節(jié)腫脹畸形、活動(dòng)受限的重要因素，所謂頑癥怪病皆質(zhì)之于痰淤?；诂F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)oa發(fā)病機(jī)理的深入研究，我們在補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)基礎(chǔ)上，結(jié)合中藥對(duì)緩解軟骨降解，增加軟骨細(xì)胞功能，抑制滑膜增生及炎癥的研究成果，于1995年即對(duì)備急千金要方

32、中的獨(dú)活寄生湯進(jìn)行化裁，重用活血化淤，加用化痰清熱之品，總結(jié)制定出了高效、藥源廣泛、安全可行的痛痹顆粒，并于1999年采用痛痹顆粒的組方治療膝oa，方中以獨(dú)活為君藥，以祛下焦與筋骨間風(fēng)寒濕邪；威靈仙舒筋通絡(luò)止痹痛；淫羊藿、懷牛膝補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，通經(jīng)絡(luò)，其中懷牛膝為引經(jīng)藥；當(dāng)歸養(yǎng)血柔肝、舒筋活血；川芎則通達(dá)四肢關(guān)節(jié)，為血中氣藥；虎杖活血清熱解毒，同時(shí)防諸藥辛燥太過。諸藥合用共起補(bǔ)肝腎、祛風(fēng)濕、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保護(hù)軟骨。通過36例的臨床研究、觀察，結(jié)果表明本方療效顯著且副作用小。因此有必要對(duì)痛痹顆粒治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制尤其是該方對(duì)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡與增殖機(jī)理做進(jìn)一步的研究，冀能證實(shí)痛

33、痹顆粒的臨床療效，明確其作用機(jī)制，并初步探討本病發(fā)病的可能機(jī)理，為新藥問世提供客觀的依據(jù)，所以進(jìn)行設(shè)計(jì)并立題。1.4本研究達(dá)到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會(huì)效益和應(yīng)用推廣前景1.4.1繼承和發(fā)揚(yáng)祖國醫(yī)學(xué)，保持中醫(yī)特色，以臨床療效為前提，以實(shí)驗(yàn)研究為基礎(chǔ)，制造規(guī)范化大鼠的膝oa模型，從發(fā)病機(jī)理探討本藥的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)采用可靠地國際公認(rèn)的方法復(fù)制動(dòng)物模型，并采用最新的檢測指標(biāo)il-1、tnf、sod、mda、no等，總之本研究基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)oa發(fā)病機(jī)制的最新研究成果，從生化、免疫等多個(gè)角度多個(gè)層次，系統(tǒng)觀察并進(jìn)行歸納總結(jié)，確保本課題不但可行而且先進(jìn)，冀能填補(bǔ)省內(nèi)外運(yùn)用中藥治療oa的空白，并希望以此為基

34、礎(chǔ)，進(jìn)一步從細(xì)胞水平（包括本藥對(duì)軟骨細(xì)胞及細(xì)胞凋亡與增殖的影響）研究中藥對(duì)oa的長久作用及影響，從而達(dá)到擠身國際先進(jìn)水平的目的，讓中藥真正走向世界。1.4.2目前，中藥治療oa的方法頗多，但大多以臨床療效研究為主，大樣本、規(guī)范化的研究很少，中醫(yī)中藥治療機(jī)理的研究，雖有涉及，但大多分散且存在一定的重復(fù)性，理想的治療藥物尚未問世，具有公認(rèn)療效的小兒遷延性腹瀉臨床治療方案尚未確立，其療效評(píng)價(jià)體系尚需研究確定，尤其是缺少中醫(yī)藥治療學(xué)整體研究思路與方法，使中藥復(fù)方治療oa的療效機(jī)理尚未能全面揭示，影響了該領(lǐng)域研究的深入。而痛痹顆粒是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下選用千金要方中獨(dú)活寄生湯進(jìn)行加減所得，并采用可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)?/p>

35、型及最新的國際公認(rèn)的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，觀察其對(duì)oa的確切療效及作用機(jī)理，這必將對(duì)oa的中醫(yī)理論產(chǎn)生較大影響，同時(shí)對(duì)臨床治療也起到更好的指導(dǎo)作用，從而產(chǎn)生較好的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。隨著改革開放的形勢發(fā)展，以及中國加入wto與國際接軌的進(jìn)程的不斷完善，祖國醫(yī)學(xué)國際地位不斷的提高，我們將從祖國醫(yī)學(xué)寶庫中發(fā)掘出的治療oa的高效藥物與現(xiàn)代新技術(shù)、新方法進(jìn)行研究總結(jié)，從而為人類造福，為振興中醫(yī)事業(yè)做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。2.科研假說或技術(shù)構(gòu)想：主要內(nèi)容、技術(shù)關(guān)鍵目的，技術(shù)特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項(xiàng)目應(yīng)說明開發(fā)規(guī)模。2.1主要內(nèi)容2.1.1探討oa的病因病機(jī)，提出新見解，發(fā)展中醫(yī)理論。2.1.2運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，開展實(shí)驗(yàn)

36、研究，從分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生理生化學(xué)等多方面來探討“痛痹顆?！敝委熛a的療效機(jī)制及藥理毒理作用。2.2主要技術(shù)關(guān)鍵2.2.1膝oa模型的復(fù)制目前所使用的oa動(dòng)物模型一般可分為兩大類，其一是誘發(fā)模型，即通過各種操作方法如制動(dòng)、手術(shù)、關(guān)節(jié)內(nèi)注藥、關(guān)節(jié)內(nèi)植入軟骨碎片或微粒等誘導(dǎo)oa產(chǎn)生；另一類為自發(fā)模型，即不用任何外界干預(yù)，動(dòng)物自發(fā)oa，如c57黑鼠等。在選擇動(dòng)物模型時(shí)一般應(yīng)考慮動(dòng)物的種屬（包括其生活習(xí)性、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)、組織學(xué)及病理學(xué)特征）、不同方法的造模機(jī)制和oa模型的特點(diǎn)，并應(yīng)參照研究目的加以選擇。在誘發(fā)模型中，常用的方法是手術(shù)造成關(guān)節(jié)的應(yīng)力改變及關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入木瓜蛋白酶， 這兩種方法都能復(fù)制出較

37、成功較高的oa模型，且操作較為簡單。具體的造模機(jī)制在于低應(yīng)力可以造成軟骨厚度減少，so染色變淡，水分增加，蛋白聚糖聚集度損傷等變化，木瓜蛋白酶作為一種蛋白水解酶會(huì)引起關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變。在具體的造模過程中我們選用以上兩種方法來分別復(fù)制動(dòng)物模型。用于動(dòng)物模型的動(dòng)物一般有狗、兔、鼠等，我們選用大鼠做oa模型，因?yàn)樵撃Ｐ完P(guān)節(jié)軟骨退變的組織學(xué)特征與人類相似，且動(dòng)物來源較廣泛，且經(jīng)濟(jì)。2.2.2關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)基于來源廣泛，操作可行的原則，目前用于體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞一般均為兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)所得。軟骨需在嚴(yán)格無菌的條件下分離，經(jīng)過一系列的漂洗、消化等工作后獲取軟骨細(xì)胞。目前還沒有專門用于軟

38、骨細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液，國外采用的培養(yǎng)液種類繁多，有199、1640、f12、改良eagle等，國內(nèi)的有199、1640、dmem（高糖）等，其中加入胎牛血清（占15%），一般以使用dmem培養(yǎng)液居多。在培養(yǎng)液中還含有一些輔助添加劑，包括25mmol/l hepes、1mmol/l 丙酮酸鈉、2mmol/l 谷氨酰胺、50umol/l 二硫基乙醇以及10萬單位/l的青霉素和10萬單位/l的鏈霉素，ph7.4。培養(yǎng)過程中一般使用5%co237的恒溫培養(yǎng)箱。2.2.3采用的檢測手段及指標(biāo)在病理組織形態(tài)學(xué)的檢查中，一般采用以下幾個(gè)觀察指標(biāo)：大體肉眼觀察軟骨及滑膜表面情況；he染色觀察有關(guān)的形態(tài)變化；ma

39、sson三色染色觀察膠原的變化；sanfranin-o即沙紅o染色用于組織學(xué)評(píng)分，評(píng)分方法按mankin法；電鏡下觀察軟骨細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)形態(tài)變化及其周圍膠原纖維的變化。在細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)檢測中，我們采用mtt法檢測軟骨細(xì)胞的增殖能力，用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)檢測總蛋白含量，使用細(xì)胞流式儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡的測定，對(duì)inos、no含量的測定則使用分型nos試劑盒和no試劑盒。2.3目標(biāo)（達(dá)到的主要技術(shù)指標(biāo)或技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)）、技術(shù)特征及創(chuàng)新之處。現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與中醫(yī)藥理論相結(jié)合，深入研究中醫(yī)藥治療oa的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供更加科學(xué)有利的客觀依據(jù)，發(fā)揮中醫(yī)藥治療oa的特色和優(yōu)勢，為臨床常見、嚴(yán)重影響人類健康的oa研

40、究出有效、安全、便于推廣應(yīng)用的中醫(yī)藥治療方法，使能迅速緩解癥狀，大大減輕病人痛苦，降低膝骨關(guān)節(jié)炎的致殘率和復(fù)發(fā)率，且副作用小的簡、便、廉、驗(yàn)的中藥制劑問世。治療膝oa的新藥生產(chǎn)及對(duì)其在治療中所起作用機(jī)制的深入探討，既符合國情又能夠走向世界，產(chǎn)生較大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益，這必然形成高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)進(jìn)入高新領(lǐng)域，對(duì)促進(jìn)科技進(jìn)步，發(fā)展中醫(yī)藥，有著積極的作用，同時(shí)這也是中藥現(xiàn)代化研究的發(fā)展方向和新的探索。3.實(shí)驗(yàn)研究方法及技術(shù)路線。3.1對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠骨性關(guān)節(jié)炎的防治作用 oa模型的制備：（1）取sd雄性大鼠50只，體重200220g，固定，常規(guī)備皮消毒，沿髕韌帶內(nèi)側(cè)緣切口，切斷雙后肢內(nèi)側(cè)副韌帶及膝前內(nèi)側(cè)筋膜擴(kuò)

41、張部，并在斷端處修剪去除約2mm，造成雙后肢膝外翻畸形。術(shù)后第二天放造模大鼠于拖箱內(nèi)每天趕其行走30m。（2）取sd雄性大鼠50只，體重200220g，4%木瓜蛋白酶溶液與0.03mol/l半胱氨酸溶液1：1混置0.5小時(shí)后，分別在第1、3、5、7天于實(shí)驗(yàn)大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入混合液20ul。方法：將造模后的大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性對(duì)照組（維骨力組）、治療組，另設(shè)正常對(duì)照組，分別灌胃給藥或蒸餾水，連續(xù)7周。七周后將動(dòng)物麻醉后，立即將大鼠以仰臥位固定，頸總?cè)⊙尤朐嚬苤校?000rmp15min離心獲取含藥血清；切開關(guān)節(jié)囊，進(jìn)行大體觀察后，然后以銳利刀片切取膝關(guān)節(jié)前正中部分的滑膜組織，作he染色，

42、電鏡下觀察。再用銳利刀片切取股骨內(nèi)倮軟骨使其呈2mm×1mm全層軟骨標(biāo)本，2.5%戊二醛溶液固定，電鏡下觀察。所余之股骨內(nèi)倮連同軟骨下骨一并切下，10%福爾馬林溶液固定24小時(shí)以上，分別作he、沙紅-o及masson三色染色后光鏡檢查，取樣后即可將動(dòng)物處死。觀察指標(biāo)：大體肉眼觀察軟骨及滑膜表面情況；he染色觀察有關(guān)的形態(tài)變化；masson三色染色觀察膠原的變化；sanfranin-o即沙紅o染色用于組織學(xué)評(píng)分，評(píng)分方法按mankin法（附評(píng)分等級(jí)表如下）；電鏡下觀察軟骨細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)形態(tài)變化及其周圍膠原纖維的變化。評(píng)分等級(jí).結(jié)構(gòu)正常 0表面結(jié)構(gòu)微小不規(guī)則 1表面結(jié)構(gòu)中等不規(guī)則 2表面結(jié)構(gòu)

43、嚴(yán)重不規(guī)則 3過渡層出現(xiàn)裂隙 4輻射層出現(xiàn)裂隙 5鈣化層出現(xiàn)裂隙 6過渡層消失 7輻射層消失 8鈣化層消失 9結(jié)構(gòu)完全破壞 10.細(xì)胞1. 切線的區(qū)域正常 0細(xì)胞腫脹 1細(xì)胞消失 22. 過渡和輻射的區(qū)域正常 0少量的細(xì)胞增多 1中等量的細(xì)胞增多 2大量的細(xì)胞增多 3少量的克隆 4中等量的克隆 5大量的克隆 6少量的細(xì)胞減少 7中等量的細(xì)胞減少 8大量的細(xì)胞減少 9細(xì)胞消失 10.變異標(biāo)記 完整 0多層 1模糊 2血管的交叉 3.血管翳形成沒有 0少量 1中等量 2大量 33.2 對(duì)體外培養(yǎng)兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的影響 3.2.1 兔膝軟骨細(xì)胞的原代培養(yǎng) 無菌條件下取兩周齡新西蘭白兔后肢關(guān)節(jié)，用刀片

44、取關(guān)節(jié)表面軟骨，收集在含磷酸緩沖液（pbs）的無菌小培養(yǎng)皿內(nèi)，反復(fù)清洗除去軟骨片表面的血液，以及可能勿帶之滑膜組織。漂洗完畢后，用無菌的眼科小剪刀在培養(yǎng)皿中將其細(xì)切至不大于1mm3。切碎后將其裝入10u試管內(nèi)，按1：10量加入消化酶類進(jìn)行化學(xué)解離。先用0.25%胰酶消化30min，然后去除胰酶，加入0.2%膠原酶消化78小時(shí)后，1500rpm10min離心，棄上清，加入pbs，搖勻在同上離心棄上清，在加pbs反復(fù)三次，最后一次加含15%胎牛血清dmem培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打均勻，200目篩網(wǎng)過濾，放入培養(yǎng)瓶中， 5%co237培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期換液，并觀察照相，長滿后用0.25%胰酶消化傳代。3

45、.2.2 對(duì)軟骨細(xì)胞增殖反應(yīng)的作用 將在培養(yǎng)瓶中長滿的細(xì)胞消化，接入96孔培養(yǎng)板中，100ul/孔， 待細(xì)胞長成單層后，將舊液棄去，用pbs輕輕蕩洗一遍，然后加入含藥血清，100ul/孔，每組4個(gè)復(fù)孔。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱孵育72h后，取上清液。每孔加入mtt試劑20ul（5g/l）既無血清培養(yǎng)液100ul，再孵育4h。取上清，每孔加入200ul溶甲瓚液，以主波長570nm，參比波長690nm于酶標(biāo)儀上比色，讀取吸光度（a）值。3.2.3 對(duì)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的影響 單層細(xì)胞培養(yǎng)板制作同上，加入含藥血清，每組4個(gè)復(fù)孔，于5%co237培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，棄去舊液，用0.25%胰酶消化待細(xì)胞有變圓

46、趨勢即取出消化液，加入pbs，用吸管輕輕吹打，使成單個(gè)細(xì)胞懸液，移入離心管離心，1000rpm，5min，去掉上清液，約留0.5ml細(xì)胞懸液，用振蕩器使細(xì)胞分散，用細(xì)滴管或注射器將細(xì)胞迅速注入4冷乙醇中（乙醇終濃度為70%），用細(xì)胞流式儀檢測凋亡細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算凋亡百分率。3.2.4 對(duì)軟骨細(xì)胞蛋白合成和no含量的影響 同樣將各組含藥血清加入已長成單層細(xì)胞的培養(yǎng)板內(nèi)，co2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，收集上清液，用全自動(dòng)生化分析儀檢測總蛋白含量，用分型nos試劑盒和no試劑盒檢測各組inos、no含量。3.2.5 拆方后對(duì)軟骨細(xì)胞的影響 進(jìn)行拆方實(shí)驗(yàn)，篩選出補(bǔ)肝腎組方、祛風(fēng)濕組方和化瘀痰組方三組，對(duì)

47、這三組及復(fù)方分別進(jìn)行體外的軟骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，設(shè)立陽性對(duì)照組（維骨力組）：細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將各組方藥液用培養(yǎng)基分別配成幾個(gè)待測濃度，加入已長成單層細(xì)胞的培養(yǎng)板內(nèi)，分別觀察24h、48h、72h細(xì)胞形態(tài)的變化，選擇細(xì)胞不發(fā)生變圓、萎縮、漂浮的最大濃度為藥物對(duì)細(xì)胞的最大無毒濃度，以便繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡、增殖、no含量及inos基因表達(dá)的影響 將各組方藥液分別配置成最大無毒濃度，加入已長成單層軟骨細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，具體檢測操作則同加入含藥血清的實(shí)驗(yàn)。4.現(xiàn)有工作條件和基本條件本課題主要承擔(dān)者是江蘇省中醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所。本所具有江蘇省科學(xué)技術(shù)委員會(huì)，江蘇省標(biāo)準(zhǔn)局頒布的動(dòng)物飼育環(huán)境合格證書，動(dòng)物質(zhì)量合格證書，人員素質(zhì)高，均擁有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從業(yè)人員崗位證書。儀器設(shè)備先進(jìn)完善，擁有無菌室，能夠進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及指標(biāo)檢測等一系列工作，具有較強(qiáng)的科研能力。本組方的提供者是本院的風(fēng)濕科，該科擁有?？撇》浚?0張病床）及全天