瓊脂糖凝膠電泳

1、DNA/RNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟一一注意事項(xiàng)與實(shí)驗(yàn)技巧注意事項(xiàng)與實(shí)驗(yàn)技巧凝膠電泳凝膠電泳是分離和純化DNA片段最常用的技術(shù)；分離、鑒定和提純核酸首選的標(biāo)準(zhǔn)方法。分離、鑒定和提純核酸首選的標(biāo)準(zhǔn)方法。根據(jù)制備凝膠的材料: 瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳凝膠電泳 聚丙烯酰胺電泳一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理（1）某物質(zhì)在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫做電泳）某物質(zhì)在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫做電泳的速率，電泳的速率與核酸分子大小和構(gòu)型有關(guān)。的速率，電泳的速率與核酸分子大小和構(gòu)型有關(guān)。DNADNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)分子

2、在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。作用下向正極泳動(dòng)。分子質(zhì)量越小跑得越快，緊分子質(zhì)量越小跑得越快，緊密構(gòu)型快于松散型開環(huán)分子或線性分子，從而可密構(gòu)型快于松散型開環(huán)分子或線性分子，從而可以分離大小不同的以分離大小不同的DNA或或RNA分子。分子。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。（2 2）瓊脂糖是一種）瓊脂糖是一種線性多糖聚合物線性多糖聚合物，可以形成具有剛，可以

3、形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度瓊脂糖的濃度。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。分離長(zhǎng)度分離長(zhǎng)度凝膠電泳凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳200bp近近50kb 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 5500bp 分辨率高分辨率高采用不同濃度的凝膠可以分辨范圍廣泛的采用不同濃度的凝膠可以分辨范圍廣泛的DNA分子分子。含不同量瓊脂糖的凝膠的分離范圍含不同量瓊脂糖的凝膠的分離范圍 凝膠中的瓊脂糖含量%（W/V）DNA/RNA分子的分離范圍（ kb ）0.35600.61200.70.8100.90.571

4、.20.461.50.2320.12二、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑二、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑 質(zhì)粒樣品、酶切樣品和質(zhì)粒樣品、酶切樣品和PCRPCR樣品。樣品。 凝膠電泳系統(tǒng)和電泳圖像分析系統(tǒng)凝膠電泳系統(tǒng)和電泳圖像分析系統(tǒng)( (凝膠成凝膠成像系統(tǒng)像系統(tǒng)) )等。等。 瓊脂糖、瓊脂糖、 1XTAE電泳緩沖液電泳緩沖液、溴化乙錠溴化乙錠、 6X載樣緩沖液載樣緩沖液 （ 6X loading buffer）和）和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)準(zhǔn)等。等。凝膠電泳系統(tǒng)凝膠電泳系統(tǒng)DYY-6C型型 雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀電源（北京雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀電源（北京六一）六一） 輸出范圍（顯示分辨率）：6-600V(1V) 4-400mA

5、(1mA) 240W 美國(guó)美國(guó)Bio-rad伯樂(lè)伯樂(lè) 小型水平電泳槽小型水平電泳槽Mini-Sub Cell GT Cell 凝膠成像分析系統(tǒng)凝膠成像分析系統(tǒng)DNA Marker一個(gè)已知分子質(zhì)量的一個(gè)已知分子質(zhì)量的DNA樣品做對(duì)照，用樣品做對(duì)照，用來(lái)確定待測(cè)樣品的相來(lái)確定待測(cè)樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。對(duì)分子質(zhì)量。常用電泳緩沖液常用電泳緩沖液 高度復(fù)雜高度復(fù)雜DNA混合混合物；超螺物；超螺旋旋DNATris-硼酸（硼酸（TBE） Tris-乙酸（乙酸（TAE） Tris-磷酸（磷酸（TPE） DNA的泳動(dòng)受到電泳緩沖液和離子濃度的影響。的泳動(dòng)受到電泳緩沖液和離子濃度的影響。 缺乏離子，電導(dǎo)率嚴(yán)重降低，

6、電泳遷移率很慢；離子強(qiáng)度過(guò)高，缺乏離子，電導(dǎo)率嚴(yán)重降低，電泳遷移率很慢；離子強(qiáng)度過(guò)高，電導(dǎo)率升高，極易產(chǎn)生大量的熱能，最嚴(yán)重的結(jié)果是凝膠熔化，電導(dǎo)率升高，極易產(chǎn)生大量的熱能，最嚴(yán)重的結(jié)果是凝膠熔化，DNA變性。變性。 常用的電泳緩沖液有常用的電泳緩沖液有TAE，TPE和和TBE，其中，其中TAE的緩沖容量的緩沖容量最低，長(zhǎng)時(shí)間電泳將被消耗。最低，長(zhǎng)時(shí)間電泳將被消耗。上樣緩沖液上樣緩沖液電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成上樣緩沖液。組成上樣緩沖液。 作用：作用：增加樣品比重，以確保增加樣品比重，以

7、確保DNA均勻沉入加樣均勻沉入加樣孔內(nèi)?？變?nèi)。形成肉眼可見(jiàn)的指示帶，預(yù)測(cè)核酸電泳的速形成肉眼可見(jiàn)的指示帶，預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置。度和位置。使樣品呈色，使加樣操作更方便。使樣品呈色，使加樣操作更方便。EB染料染料 溴化乙錠（溴化乙錠（EB）是一種高度靈敏的熒光染色劑，）是一種高度靈敏的熒光染色劑，它在標(biāo)準(zhǔn)的它在標(biāo)準(zhǔn)的302mm紫外光照射下能發(fā)射橙紅色紫外光照射下能發(fā)射橙紅色信號(hào)，當(dāng)信號(hào)，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，瓊樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，瓊脂糖凝膠中的脂糖凝膠中的EB就插入就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)分子中形成熒光絡(luò)合物，使合物，使DNA發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾十倍，電泳后發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾

8、十倍，電泳后就可直接紫外燈照射下檢測(cè)瓊脂糖中的就可直接紫外燈照射下檢測(cè)瓊脂糖中的DNA。 EB染料優(yōu)點(diǎn)：染色操作簡(jiǎn)便，快速，室溫下染料優(yōu)點(diǎn)：染色操作簡(jiǎn)便，快速，室溫下15-20min；不會(huì)使核酸斷裂；靈敏度高，不會(huì)使核酸斷裂；靈敏度高，10ng或更少或更少的的DNA即可檢出，效果較好；可以加到樣品中或膠即可檢出，效果較好；可以加到樣品中或膠中。中。 EB是誘變劑，有是誘變劑，有劇毒劇毒，使用時(shí)一定要戴手套，且一，使用時(shí)一定要戴手套，且一定要注意等到瓊脂糖涼到四十多度的時(shí)候再加定要注意等到瓊脂糖涼到四十多度的時(shí)候再加EB，否則否則EB有一定的揮發(fā)性，而鼻黏膜對(duì)有一定的揮發(fā)性，而鼻黏膜對(duì)EB的吸收

9、是較的吸收是較明顯的。明顯的。 EB廢液要經(jīng)過(guò)凈化處理再行棄置。廢液要經(jīng)過(guò)凈化處理再行棄置。 SYBR:新型低毒，高靈敏度染料，但操作不便，信新型低毒，高靈敏度染料，但操作不便，信號(hào)不穩(wěn)定，易猝滅，價(jià)格較昂貴。號(hào)不穩(wěn)定，易猝滅，價(jià)格較昂貴。 Goldview:主要成分吖啶橙，主要成分吖啶橙，高毒高毒，在相當(dāng)程度導(dǎo)致，在相當(dāng)程度導(dǎo)致細(xì)胞凋忘。較便宜，但效果不及細(xì)胞凋忘。較便宜，但效果不及EB。三、實(shí)驗(yàn)步驟三、實(shí)驗(yàn)步驟1. 制備瓊脂糖凝膠（制備瓊脂糖凝膠（1%）2. 制備凝膠板制備凝膠板3. 加樣加樣4. 電泳電泳 5. 染色染色6. 結(jié)果觀察結(jié)果觀察 二、實(shí)驗(yàn)方法二、實(shí)驗(yàn)方法 150TAE的稀釋

10、：如的稀釋：如制備制備50mL 1TAE，取，取1mL 50TAE加入加入49mL水定容至水定容至50mL。 2制備制備1%的瓊脂糖膠的瓊脂糖膠液：取液：取0.2g瓊脂糖溶于瓊脂糖溶于20mL TAE中，在短時(shí)間中，在短時(shí)間里加熱瓊脂糖全部熔化，里加熱瓊脂糖全部熔化，使溶液冷卻至使溶液冷卻至40.(加入加入濃度為濃度為10mg/mL的的EB 2L，使，使EB的終濃度為的終濃度為1g/mL)。 3用于用于RNA電泳的電泳槽用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用電泳的電泳槽用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙醇干燥后灌滿乙醇干燥后灌滿3% 的的H2O2溶液，于室溫放置溶液，于室溫放置10分鐘，然后用分鐘，然后

11、用DEPCSDW沖洗電泳槽，梳子同樣處理。沖洗電泳槽，梳子同樣處理。 4用膠帶封住膠床，放好梳子。用膠帶封住膠床，放好梳子。 5將溫?zé)岘傊堑谷肽z床中，凝膠的厚度在將溫?zé)岘傊堑谷肽z床中，凝膠的厚度在35mm之間，凝之間，凝固固2060min。 6在凝膠完全凝固之后，小心移去梳子，將膠床放在凝膠完全凝固之后，小心移去梳子，將膠床放在電泳槽內(nèi)，加樣孔一側(cè)靠近陰極（黑極）。在電泳槽內(nèi)，加樣孔一側(cè)靠近陰極（黑極）。 7向電泳槽中注入適量的向電泳槽中注入適量的TAE緩沖液，通常緩沖液高緩沖液，通常緩沖液高于膠面于膠面1cm。 8分別將分別將DNA/RNA樣品與加樣緩沖液混合樣品與加樣緩沖液混合,用移液

12、槍用移液槍將樣品加入加樣孔。將樣品加入加樣孔。 9正確連接電泳槽和電源，設(shè)定穩(wěn)壓為正確連接電泳槽和電源，設(shè)定穩(wěn)壓為75V，電流一，電流一般為般為50mA。 10電泳結(jié)束后，在紫外觀測(cè)儀上進(jìn)行觀察。電泳結(jié)束后，在紫外觀測(cè)儀上進(jìn)行觀察。四、注意事項(xiàng)與實(shí)驗(yàn)技巧四、注意事項(xiàng)與實(shí)驗(yàn)技巧 制膠和加樣過(guò)程中要制膠和加樣過(guò)程中要防止氣泡防止氣泡的產(chǎn)生。的產(chǎn)生。 紫外光紫外光對(duì)人眼有害對(duì)人眼有害，觀察時(shí)加蓋玻璃罩，觀察時(shí)間不宜太長(zhǎng)。，觀察時(shí)加蓋玻璃罩，觀察時(shí)間不宜太長(zhǎng)。 EB具有強(qiáng)誘變性，可具有強(qiáng)誘變性，可致癌致癌。必須戴手套操作，嚴(yán)格注意防護(hù)。必須戴手套操作，嚴(yán)格注意防護(hù)。 加樣時(shí)，加樣時(shí)，Tip頭不宜插入樣

13、品孔太深，也不要穿破膠孔壁，否頭不宜插入樣品孔太深，也不要穿破膠孔壁，否則樣品滲漏或則樣品滲漏或DNA帶型不整齊。帶型不整齊。 配膠和灌電泳槽需使用配膠和灌電泳槽需使用同一批緩沖液同一批緩沖液。因?yàn)?。因?yàn)閜H 或離子強(qiáng)度很或離子強(qiáng)度很小的差別也會(huì)在凝膠前部造成紊亂，影響小的差別也會(huì)在凝膠前部造成紊亂，影響DNA 片段的泳動(dòng)。片段的泳動(dòng)。 梳板的選用梳板的選用 一般每個(gè)制膠模具均配有多個(gè)齒型不同的梳板，梳一般每個(gè)制膠模具均配有多個(gè)齒型不同的梳板，梳齒寬厚，形成的點(diǎn)樣容積較大，用于齒寬厚，形成的點(diǎn)樣容積較大，用于DNA 片段回收實(shí)驗(yàn)等；相片段回收實(shí)驗(yàn)等；相反，梳齒窄而薄，形成的點(diǎn)樣容積就較小，用于反，梳齒窄而薄，形成的點(diǎn)樣容積就較小，用于PCR產(chǎn)物、酶產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物鑒定等。一般來(lái)說(shuō)，上樣量小時(shí)盡量選擇薄的梳板制膠，切產(chǎn)物鑒定等。一般來(lái)說(shuō)，上樣量小時(shí)盡量選擇薄的梳板制膠，此時(shí)電泳條帶致密清晰，便于結(jié)果分析。此時(shí)電泳條帶致密清晰，便于結(jié)果分析。 跑出好看的電泳圖跑出好看的電泳圖 凝膠一定要加熱凝膠一定要加熱熔解完全熔解完全，均勻，可以對(duì)著光亮的地方看看清，均勻，可以對(duì)著光亮的地方看看清澈不清澈澈不清澈 ； 一般情況下，梳子一般情況下，梳子越薄而長(zhǎng)越薄而長(zhǎng)，條帶越好看，條帶越好看 ； 上樣量上樣量不宜過(guò)多不宜過(guò)多，會(huì)造成條帶的相互擠壓；，會(huì)造成條帶的相互