實驗八：NADH正、負向反應(yīng)測定酶的活性ppt課件

1、實驗五實驗五NADHNADH正、負向反應(yīng)測定酶的活性正、負向反應(yīng)測定酶的活性 1;.2一、一、NADHNADH正向反應(yīng)法測定血清正向反應(yīng)法測定血清LD(LD(連續(xù)監(jiān)測法連續(xù)監(jiān)測法) ) 目的：1通過對LD的測定，要求掌握NADH正向反應(yīng)法測定的基本原理，以及該法測定應(yīng)注意的事項；2熟悉LD測定原理和注意事項及方法學評價；了解利用NADH正向反應(yīng)法測定其它項目的基本原理。3原理 LD催化下述反應(yīng)： L一乳酸+NAD+ LD 丙酮酸+NADH+H+ 在反應(yīng)過程中，乳酸氧化生成丙酮酸，同時使NAD+還原為NADH。NADH在340nm處有吸收峰，因此反應(yīng)會引起340nm吸光度的增高，并且吸光度增加的

2、速率與樣本中LD的酶活性成正比。4試劑 1 Tris一乳酸鋰緩沖液(含Tris 100mmol/L，乳酸鋰55mmolL) : 2底物應(yīng)用液(含Tris 100mmolL，NAD8.5mmolL)5操作步驟 1標本要求：血清或肝素抗凝血漿 2主要參數(shù)： 孵育時間：120s 連續(xù)檢測時間：120s 溫度：37 5minS:4l R1:200l R2:50l340/405nm6結(jié)果計算式中 Amin：平均每分鐘吸光度增加值6220：340nm處NADH的摩爾吸光系數(shù)V(1.05)：比色液總體積(m1) v(0.05)： 血清用量(m1) L:1cm比色光徑。參考范圍:成人109245 UL。LvV

3、ALU610min/7注意事項 1LD活性測定也可用抗凝血漿，但不同抗凝劑對LD測定的影響不同：草酸鹽抗凝劑、EDTA能抑制LD活性，而肝素的影響不大。 2不同的LD同工酶對溫度的敏感性是不同的，組織提取液若放于一20過夜，LD4和LD5會喪失全部的活性。血清標本應(yīng)存放于室溫下，一般23天不會出現(xiàn)活性的丟失。如果血清標本需要存放較長時間，應(yīng)加入10mgml的NAD+或31/ml的谷胱甘肽后于4保存。 3LD活性能被巰基試劑所抑制，另外硼酸、丙二酸、草酸以及EDTA都是競爭性抑制劑。 4由于紅細胞、血小板中含有大量的LD，故嚴禁使用溶血標本。在采用血漿作為標本時必須用3000rmin離心15mi

4、n以除去血小板。8方法學評價 乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LD)是糖酵解和糖異生中的一個重要酶，含有鋅離子，廣泛分布于人和動物組織、植物和微生物中，能可逆地催化乳酸(L)和丙酮酸(P)之間的氧化還原反應(yīng)。 其中LP為正向反應(yīng)，PL為逆向反應(yīng)。正反兩向 反應(yīng)的最適pH不同，其中正向反應(yīng)最適pH為8.89.8，偏堿，能使平衡偏向生成丙酮酸的方向。其優(yōu)點是乳酸和NAD+穩(wěn)定性好，且NAD+純品易得、價格較低，過量乳酸對LD活性的抑制較小，反應(yīng)線性較好。缺點是需要較高的底物濃度，反應(yīng)速度較慢。 LD活性測定時正向反應(yīng)和逆向反應(yīng)都可以運用，但1996年中華醫(yī)學會檢驗學會酶學組

5、專家推薦選擇正向反應(yīng) 9方法學評價本實驗是根據(jù)正向反應(yīng)(LP)建立的連續(xù)監(jiān)測法，其優(yōu)點在于：乳酸鹽與NAD+底物溶液的穩(wěn)定性較好，冰凍放置可穩(wěn)定6個月以上。且兩溶液的濃度對測定方法的影響最小，NAD+較少被產(chǎn)物抑制。反應(yīng)的線性范圍較寬(726U/L)，重復(fù)性較好，精密度較高(LD為65U/L時日間CV為5.8，LD為149U/L時日間CV為3.2)特異性高(血清中存在的非LD的其他NAD+類氧化還原酶的內(nèi)源性底物少，加上樣本被高度稀釋，故這些酶的干擾作用可忽略不計)。 10思考題 1NADH正向反應(yīng)法測定的基本原理是什么?請列舉出應(yīng)用NADH正向反應(yīng)法測定其他生化檢驗項目的原理? 2LD的測定

6、為什么推薦采用L P正向反應(yīng)法?該反應(yīng)存在哪些缺點? 3LD的測定的血清標本，在處理和保存中應(yīng)注意哪些事項?11二、二、NADHNADH負向反應(yīng)法測定血清負向反應(yīng)法測定血清ALT(ALT(連續(xù)監(jiān)測法連續(xù)監(jiān)測法) ) 目的:通過對ALT測定，要求掌握NADH負向反應(yīng)法測定的基本原理，以及該法測定應(yīng)注意的事項；掌握單、雙試劑測定ALT的原理和方法；熟悉ALT連續(xù)監(jiān)測法測定的優(yōu)缺點和方法學評價；了解利用NADH負向反應(yīng)法測定其他項目的基本原理。12原理 L-丙氨酸+-酮戊二酸 ALT -丙酮酸 + L-谷氨酸 -丙酮酸+NADH LDH 乳酸+NAD+連續(xù)監(jiān)測法測定NADH被氧化為NAD+可在340

7、nm連續(xù)監(jiān)測到NADH的消耗量，從而計算出ALT活性濃度ALT雙試劑法測定中，首先使血清與缺少-酮戊二酸的、底物溶液混合，37保溫5min，將樣品中所含的-酮酸(如丙酮酸)消 耗完，然后，加入-酮戊二酸啟動ALT催化的反應(yīng)，在波長340nm處連續(xù)監(jiān)測吸光度下降速率。根據(jù)線性反應(yīng)期吸光度下降速率(-A/min)，來計算ALT的活性濃度。13操作步驟 1標本要求：血清或肝素抗凝血漿 2主要參數(shù)： 孵育時間：90s 連續(xù)檢測時間：150s 溫度：37 5minS:20l R1:200l R2:50l340/405nm14結(jié)果計算 式中6220為NADH在340nm的摩爾吸光系數(shù)。 參考范圍540UL

8、。15注意事項 1使用連續(xù)監(jiān)測法測定酶的活性時，要求使用的分光光度計， 比色杯光徑1.0cm，具有 (370.1)的恒溫裝置。由于試劑空白的讀數(shù)來自工具酶中的雜酶及NADH自發(fā)氧化。在報告結(jié)果時應(yīng)扣除每批試劑的空白測定值。 2血清不宜反復(fù)冰凍保存，以免影響酶活性。血清置4冰箱1 周，酶活性無顯著變化，不推薦冰凍保存ALT測定標本，而宜用新鮮血清標本。草酸鹽、肝素、枸櫞酸鹽雖不抑制酶活性，但可引起反應(yīng)液輕度混濁。血液混濁時可影響測定結(jié)果或無法測定(如血脂過高、血清蛋白變質(zhì)等)。紅細胞內(nèi)ALT含量為血清中35倍，應(yīng)避免 使用溶血標本。 3正常新生兒ALT水平比成年人約高2倍，出生后約3個月降至成人

9、水平。16方法學評價 1ALT測定中存在著兩個副反應(yīng) (1)血清中存在的-酮酸(如丙酮酸)能消耗NADH。 丙酮酸+NADH LDH 乳酸+NAD+ (2)血清中谷氨酸脫氫酶(GLDH)增高時，在有氨存在條件下，亦能消耗NADH. NH4+-酮戊二酸+NADH GLDH 谷氨酸+NAD+CO2上述副反應(yīng)都能消耗NADH,使340nm處吸光度下降值(-Amin)增加，使測定結(jié)果偏高。但在雙試劑法，因溫育期長，能有效地消除干擾反應(yīng)，測定準確性高，因而是ALT測定的首選方法。雙試劑法還可適當降低試劑中的LD的用量。至于NH4+的干擾，除嚴重肝病時血清谷氨酸脫氫酶活性增高和血氨增高外，一般血清中NH4

10、+的含量甚微，此干擾反應(yīng)不大。17方法學評價2在AACC(美國臨床化學學會)或IFCC(國際臨床化 學學會)推薦的試劑盒中，含有磷酸吡哆醛(P一5一 P)，在某些病理狀態(tài)下，血清中存在脫輔基的ALT酶蛋白，當使用含P一5一P的底物時可使血清ALT活性提高755。變化的大小與血清中原有P一5一P含量有關(guān)，健康人血清中P一5一P水平偏低，底物中P一5一P可顯著升高ALT活性。根據(jù)我國的實際情況和習慣,國家衛(wèi)生部臨床檢驗中心的推薦方法試劑中不加P一5一P。18方法學評價3在ALT測定中，有的用磷酸鹽緩沖液，有的用Tris緩沖液，有文獻報告：NADH在Tris緩沖液中穩(wěn)定性較高；P-5-P在Tris緩沖液中卻能顯示更有效的激活作用；4本法由于測定上限在酶促反應(yīng)的線性范圍內(nèi)，偏差小，準確性好；測定條件較賴氏法易于控制，CV值比賴氏法小，精確性好；標本測定中不需要標準對照，測定結(jié)果計算方便，操作簡便。但實驗條件要求嚴格，成本高。19思考題 1NADH負向反應(yīng)法測定的基本原理是什么?請列舉出應(yīng)用NADH負向反應(yīng)