植物原生質體培養(yǎng)和體細胞雜交

1、植物原生質體培養(yǎng)和細胞融合原生質體的分離與培養(yǎng)原生質體的分離與培養(yǎng)概念及研究進展概念及研究進展原生質體融合原生質體融合原生質體原生質體(protoplast)：脫去細胞壁、裸露的細胞。又稱原生質球脫去細胞壁、裸露的細胞。又稱原生質球 原生質體是為質膜所包圍的裸露細胞。原生質體是為質膜所包圍的裸露細胞。v亞原生質體亞原生質體(subprotoplast) 在原生質體分離過程中，有時會引起細胞內含物的在原生質體分離過程中，有時會引起細胞內含物的斷裂而形成的一些較小的原生質體。它可以具有細斷裂而形成的一些較小的原生質體。它可以具有細胞核，也可不具有細胞核。胞核，也可不具有細胞核。v核質體核質體(nu

2、clearplast) 由原生質膜和薄層細胞質包圍細胞核形成的小原生由原生質膜和薄層細胞質包圍細胞核形成的小原生質體。也稱為微小原生質體。質體。也稱為微小原生質體。v胞質體胞質體(cytoplast) 不含細胞核，而僅含有細胞質的原生質體。不含細胞核，而僅含有細胞質的原生質體。protoplast system organogenesis regenerative abilityontogenic processes cell differentiation somatic genetics cell physiology cell cloning organelle,dna uptake c

3、ell fusion 應應 用用v 植物細胞育種中的核質替換植物細胞育種中的核質替換v 細胞質雜種的獲得細胞質雜種的獲得v 遠緣雜交創(chuàng)造新物種細胞遠緣雜交創(chuàng)造新物種細胞v 細胞器的互作研究細胞器的互作研究意意 義義植物原生質體的分離和培養(yǎng)植物原生質體的分離和培養(yǎng)v材料預處理材料預處理v原生質體原生質體分離的方法分離的方法v原生質體原生質體純化純化v原生質體原生質體活力測定活力測定v影響原生質體影響原生質體數量和活力的因素數量和活力的因素v原生質體培養(yǎng)方法原生質體培養(yǎng)方法v影響原生質體培養(yǎng)的因素影響原生質體培養(yǎng)的因素v原生質體再生過程原生質體再生過程flash用于分離原生質體的材料用于分離原生質

4、體的材料材料預處理材料預處理用黑暗處理、低溫處理和不同光質照射等方法，用黑暗處理、低溫處理和不同光質照射等方法，可提高某些材料原生質體的產量和活力?？商岣吣承┎牧显|體的產量和活力。 龍膽試管苗的葉片用龍膽試管苗的葉片用4 4o oc c處理較好。處理較好。 甘蔗植株必須先在黑暗下培養(yǎng)甘蔗植株必須先在黑暗下培養(yǎng)12h12h后分離的后分離的原生質體才能分裂。原生質體才能分裂。 馬鈴薯試管苗葉片需在黑暗下處理馬鈴薯試管苗葉片需在黑暗下處理48h48h后分后分離原生質體，才能獲得高產量。離原生質體，才能獲得高產量。原生質體分離的方法原生質體分離的方法機機 械械 分分 離離 法法酶酶 解解 分分 離

5、離 法法機械分離法機械分離法：先將細胞放在高滲糖溶液中先將細胞放在高滲糖溶液中預處理，待細胞發(fā)生輕微質壁分離，原生質預處理，待細胞發(fā)生輕微質壁分離，原生質體收縮成球形后，再用機械法磨碎組織，從體收縮成球形后，再用機械法磨碎組織，從傷口處可釋放出完整的原生質體。傷口處可釋放出完整的原生質體。v缺點：獲得完整的原生質體的數量比較少，缺點：獲得完整的原生質體的數量比較少，能夠用此法產生原生質體的植物種類受到能夠用此法產生原生質體的植物種類受到限制。限制。v優(yōu)點：該方法可避免酶制劑對原生質體的優(yōu)點：該方法可避免酶制劑對原生質體的破壞作用。破壞作用。酶解分離法酶解分離法： 指將材料放入能降解細胞壁指將材

6、料放入能降解細胞壁的混合等滲酶液中保溫一定時間，在酶液的的混合等滲酶液中保溫一定時間，在酶液的作用下，細胞壁被降解，從而獲得大量有活作用下，細胞壁被降解，從而獲得大量有活力的原生質體的方法。力的原生質體的方法。v常用的酶種類：纖維素酶類（纖維素酶、半常用的酶種類：纖維素酶類（纖維素酶、半纖維素酶、崩潰酶纖維素酶、崩潰酶driselase）、果膠酶類）、果膠酶類（果膠酶和離析酶（果膠酶和離析酶macerozyme）、蝸牛）、蝸牛酶和胼胝質酶。酶和胼胝質酶。酶酶來源來源生產廠家生產廠家纖維素酶類纖維素酶類onozuka r-10綠色木霉綠色木霉yakult honsha co. ltd., tok

7、yo, japancellulysin綠色木霉綠色木霉calbiochem.,san diego,ca 92037, usadriselaseirpex lutenskayowa hakko kogyo co., tokyo,japan酶酶來源來源生產廠家生產廠家果膠酶類果膠酶類macerozyme r-10根霉根霉yakult honsha co. ltd., tokyo, japanpectinase黑曲霉黑曲霉sigma chemical co.pectolyase y-23黑曲霉黑曲霉seishin pharm. co. ltd., tokyo, japan半纖維素酶半纖維素酶rhoz

8、ymehp-150黑曲霉黑曲霉rohm and hass co., rhiladelphia, uas酶解法的優(yōu)缺點酶解法的優(yōu)缺點v優(yōu)點：獲得量大，適用廣泛。優(yōu)點：獲得量大，適用廣泛。v缺點：商品酶制劑均含有核酸酶、蛋白酶、缺點：商品酶制劑均含有核酸酶、蛋白酶、過氧化物酶以及酚類物質。過氧化物酶以及酚類物質。會影響所獲原生質體的活力。會影響所獲原生質體的活力。沉沉 降降 法法漂漂 浮浮 法法不不 連連 續(xù)續(xù) 梯梯 度度 法法原生質體純化的方法原生質體純化的方法飄浮法飄浮法protoplastv采用比原生質體密度大的高滲溶采用比原生質體密度大的高滲溶液（蔗糖、液（蔗糖、percoll、ficol

9、l），）， 使原生質體漂浮在液體表層的純使原生質體漂浮在液體表層的純化方法?；椒?。v優(yōu)點：優(yōu)點：可以避免分離的原生質體因震可以避免分離的原生質體因震蕩被組織碎片撞擊而破損。蕩被組織碎片撞擊而破損。 所用藥品簡單，成本低。所用藥品簡單，成本低。v缺點及補救措施：缺點及補救措施：對離心力要求比較嚴格，掌握不對離心力要求比較嚴格，掌握不好，原生質體則不易漂浮?？刹珊?，原生質體則不易漂浮。可采用不同濃度和不同離心速度分次用不同濃度和不同離心速度分次漂浮的方法。漂浮的方法。沉沉 降降 法法v利用比重原理，在具有一定滲透壓的溶利用比重原理，在具有一定滲透壓的溶液中，先進行過濾然后低速離心，使純液中，先進

10、行過濾然后低速離心，使純凈完整的原生質體沉積于試管底部。凈完整的原生質體沉積于試管底部。v優(yōu)缺點：優(yōu)缺點： 純化原生質體比較簡單。純化原生質體比較簡單。 由于原生質體沉積于試管底部，造成相互由于原生質體沉積于試管底部，造成相互 擠壓，常引起原生質體的破碎。擠壓，常引起原生質體的破碎。v又稱界面法，采用兩又稱界面法，采用兩種密度不同的溶液形種密度不同的溶液形成不連續(xù)梯度，通過成不連續(xù)梯度，通過離心使原生質體與破離心使原生質體與破損細胞分別處于不同損細胞分別處于不同液相中，從而純化原液相中，從而純化原生質體的方法。生質體的方法。v優(yōu)點：可以收集到數優(yōu)點：可以收集到數量較大的純凈原生質量較大的純凈原

11、生質體，同時避免收集過體，同時避免收集過程中原生質體因相互程中原生質體因相互擠壓而破碎。擠壓而破碎。12ml碎片帶碎片帶含原生含原生質體帶質體帶0.6ml 0.45m蔗糖蔗糖0.45m甘露醇甘露醇不連續(xù)梯度法不連續(xù)梯度法原原 生生 質質 體體 鑒鑒 定定v低滲爆破法低滲爆破法v熒光增白劑法熒光增白劑法(calcoflower white 0.1%)原原 生生 質質 體體 活活 力力 測測 定定v形態(tài)識別形態(tài)識別 形態(tài)完整、富含形態(tài)完整、富含細胞質、顏色新細胞質、顏色新鮮的正常球形，鮮的正常球形，放入低滲溶液中，放入低滲溶液中，可正常膨大?？烧Ｅ虼?。原原 生生 質質 體體 活活 力力 測測 定

12、定v熒光顯微鏡識別熒光顯微鏡識別(fda法法) fda (fluorescein diacetate) 本身不發(fā)熒光也不具有本身不發(fā)熒光也不具有極性，能自由穿過細胞極性，能自由穿過細胞質膜?；罴毎麅荣|膜?；罴毎麅萬da可可以被酯酶裂解，將能發(fā)以被酯酶裂解，將能發(fā)熒光的極性部分釋放出熒光的極性部分釋放出來。熒光素則不能自由來。熒光素則不能自由穿越質膜，在完整的活穿越質膜，在完整的活細胞內積累細胞內積累。使用濃度：使用濃度：0 0.01%01%原原 生生 質質 體體 活活 力力 測測 定定v酚藏花紅染色法（酚藏花紅染色法（0.1%) )酚藏花紅能使無活力的原酚藏花紅能使無活力的原生質體染成紅色，有

13、活力生質體染成紅色，有活力的原生質體不著色。的原生質體不著色。v伊凡藍伊凡藍(evans blue)染色法染色法( (0.025%) )有活力但受損傷的細胞和死細胞能有活力但受損傷的細胞和死細胞能夠攝取這種染料，活細胞不攝取。夠攝取這種染料，活細胞不攝取。v氧電極法氧電極法影響原生質體數量和活力的因素影響原生質體數量和活力的因素v供試材料及預處理方法供試材料及預處理方法v酶解條件：酶解條件：酶質量、組合、濃度、酶質量、組合、濃度、ph、光照和溫度、光照和溫度v滲透壓穩(wěn)定劑滲透壓穩(wěn)定劑v質膜穩(wěn)定劑質膜穩(wěn)定劑v分離條件：分離條件：離心次數、離心速度、純化方法、分離純化持續(xù)離心次數、離心速度、純化方

14、法、分離純化持續(xù)時間。時間。v分離用具分離用具 酶的種類、組合、濃度酶的種類、組合、濃度材料材料纖維纖維素酶素酶半纖半纖維素維素酶酶崩崩潰潰酶酶果果膠膠酶酶離析離析酶酶蝸蝸牛牛酶酶研究者研究者煙草葉片煙草葉片禾谷類葉片禾谷類葉片油菜花粉油菜花粉馬鈴薯子葉馬鈴薯子葉馬鈴薯花粉馬鈴薯花粉1.02.01.01.01.00.51.00.10.20.50.51.0uchimiyauchimiyascottscott李仕瓊李仕瓊戴朝曦戴朝曦王蒂王蒂幾種草本植物原生質體分離使用的酶種類及濃度幾種草本植物原生質體分離使用的酶種類及濃度(%)材料材料纖維纖維素酶素酶半纖半纖維素維素酶酶崩潰崩潰酶酶果膠酶果膠酶離

15、離析析酶酶研究者研究者枸杞愈傷組織枸杞愈傷組織檀香幼葉檀香幼葉檀香愈傷組織檀香愈傷組織榆幼葉榆幼葉山毛櫸幼葉山毛櫸幼葉胡楊懸浮細胞胡楊懸浮細胞0.52.01.00.10.21.00.50.50.50.20.50.050.50.50.010.030.11.00.20.50.5孫勇如等孫勇如等lakshmilakshmilakshmilakshmidorindorinahujaahuja諸葛強諸葛強幾種木本植物原生質體分離使用的酶種類及濃度幾種木本植物原生質體分離使用的酶種類及濃度(%)phphv分離原生質體時，酶液的分離原生質體時，酶液的ph值是值得注意的值是值得注意的問題。因為降解酶的活力和細

16、胞活力最適問題。因為降解酶的活力和細胞活力最適ph值是不一致的。值是不一致的。v如制備菜豆葉片原生質體時：如制備菜豆葉片原生質體時： 低低ph（40%40%）交變電場的振幅頻率交變電場的振幅頻率100 v/cm交變電場處理時間交變電場處理時間20s支流高頻電壓支流高頻電壓1100v/cm脈沖寬度脈沖寬度60us脈沖次數脈沖次數1融融 合合 類類 型型v自發(fā)融合自發(fā)融合v誘發(fā)融合誘發(fā)融合v對稱融合對稱融合v非對稱融合非對稱融合 核失活核失活細胞質失活細胞質失活flashflash影響原生質體融合的因素影響原生質體融合的因素v原生質體質量至關重要，高質量的原生質體原生質體質量至關重要，高質量的原生

17、質體是細胞融合的首要條件。是細胞融合的首要條件。v融合方法融合方法v融合參數，包括各種融合液都應選擇適當。融合參數，包括各種融合液都應選擇適當。融融 合合 體體 類類 型型v異核體異核體(heterokaryon)或異核細胞或異核細胞基因型不同的原生質體融合成雜交細胞基因型不同的原生質體融合成雜交細胞 v同核體同核體(homokaryon)基因型相同的原生質體融合成的雜交細胞基因型相同的原生質體融合成的雜交細胞 v非對稱雜種或細胞質雜種非對稱雜種或細胞質雜種細胞質工程細胞質工程(cytoplasmic engineering)v細胞質工程細胞質工程 又稱細胞拆合工程又稱細胞拆合工程是通過物理或

18、化學方法將細胞質與細胞核是通過物理或化學方法將細胞質與細胞核分開，再進行不同細胞間核質的重新組合，分開，再進行不同細胞間核質的重新組合，重建成新細胞。重建成新細胞。v可用于研究細胞核與細胞質的關系的基礎研可用于研究細胞核與細胞質的關系的基礎研究和育種工作。究和育種工作。 細胞質工程細胞質工程v細胞質雜種細胞質雜種應用細胞融合技術，使兩種來源不同的核應用細胞融合技術，使兩種來源不同的核外遺傳物質與一個特定的核基因組結合在外遺傳物質與一個特定的核基因組結合在一起一起細胞質雜種獲得途徑（細胞質雜種獲得途徑（4條）：條）：v一個正常原生質體與一個去核原生質體融合；一個正常原生質體與一個去核原生質體融合

19、；lorz等（等（1981）用密度梯度離心（）用密度梯度離心（550% percoll，2000040000g，4090min）獲得高純度的去核原生質體。）獲得高純度的去核原生質體。細胞質工程細胞質工程v細胞質雜種獲得途徑細胞質雜種獲得途徑一個正常原生質體和一個核失活原生質體融合一個正常原生質體和一個核失活原生質體融合v使核失活的方法：使核失活的方法：x射線，碘乙酰胺，羅丹明射線，碘乙酰胺，羅丹明異核體形成后，兩個核中有一個消失；異核體形成后，兩個核中有一個消失；較晚時期，染色體選擇性消失。較晚時期，染色體選擇性消失。體細胞雜種產生的其它途徑體細胞雜種產生的其它途徑v細胞器移植細胞器移植葉綠體

20、移植葉綠體移植v葉綠體的來源葉綠體的來源葉片機械法低速離心葉片機械法低速離心原生質體低滲漲破低速離心原生質體低滲漲破低速離心v葉綠體的純化葉綠體的純化 percoll或蔗糖密度梯度離心或蔗糖密度梯度離心v葉綠體的轉移葉綠體的轉移 夾層離心法和夾層離心法和peg誘導融合誘導融合應用應用peg誘導胡蘿卜原生質體攝入藻類葉綠體誘導胡蘿卜原生質體攝入藻類葉綠體利用葉綠體的轉移使低光效作物的原生質體通過利用葉綠體的轉移使低光效作物的原生質體通過攝取高光效作物的葉綠體而提高其光合效率。攝取高光效作物的葉綠體而提高其光合效率。v細胞器移植細胞器移植細胞核移植細胞核移植v細胞核的來源細胞核的來源植物組織機械法

21、植物組織機械法（加（加triton x-100）過濾離心過濾離心原生質體低滲漲破原生質體低滲漲破(加加triton x-100)過濾離心過濾離心v細胞核的純化細胞核的純化 percoll或蔗糖密度梯度離心或蔗糖密度梯度離心v細胞核的轉移細胞核的轉移 夾層離心法：原生質體核原生質體核夾層離心法：原生質體核原生質體核 peg誘導誘導 電場誘導和微注射電場誘導和微注射體細胞雜種產生的其它途徑體細胞雜種產生的其它途徑體細胞雜種產生的其它途徑體細胞雜種產生的其它途徑v微生物移植微生物移植內吞作用內吞作用攝入固氮根瘤菌攝入固氮根瘤菌v外源染色體和外源染色體和dna的的攝入攝入染色體分離染色體分離v細胞同步

22、化處理原生質體漲破差速離細胞同步化處理原生質體漲破差速離心（心（200 g,10 min200 g,10 min；1000g1000g，20 min20 min）轉移方法轉移方法vpegpeg誘導，顯微注射誘導，顯微注射v農桿菌介導，基因搶，電穿孔，超聲波，激光穿孔農桿菌介導，基因搶，電穿孔，超聲波，激光穿孔體細胞雜種選擇及雜種植株鑒定體細胞雜種選擇及雜種植株鑒定v根據可見標記性狀根據可見標記性狀的的機械選擇法機械選擇法體細胞雜種選擇及雜種植株鑒定體細胞雜種選擇及雜種植株鑒定。 fitc( fitc(異硫氰酸異硫氰酸熒光素熒光素) )在熒光顯在熒光顯徽鏡下呈綠色徽鏡下呈綠色 ritc ( ri

23、tc (異硫氰酸異硫氰酸羅丹明羅丹明) ) ritcritc在熒在熒光顯徽鏡下呈紅色光顯徽鏡下呈紅色體細胞雜種選擇及雜種植株鑒定體細胞雜種選擇及雜種植株鑒定v根據其遺傳和生理生化特性的根據其遺傳和生理生化特性的互補選擇互補選擇法法互補選擇法互補選擇法v互補選擇法互補選擇法是指利用兩個親本具有不同遺傳是指利用兩個親本具有不同遺傳和生理特性和生理特性, ,在特定培養(yǎng)條件下在特定培養(yǎng)條件下, ,只有發(fā)生互只有發(fā)生互補作用的雜種細胞才能生長的選擇方法。補作用的雜種細胞才能生長的選擇方法。抗性互補選擇法抗性互補選擇法營養(yǎng)代謝互補選擇法營養(yǎng)代謝互補選擇法生長互補生長互補選擇法選擇法矮牽牛矮牽牛+爬山虎融合

24、體的選擇爬山虎融合體的選擇原生質體原生質體矮牽牛矮牽牛爬山虎冠癭爬山虎冠癭混合體混合體融合處理融合處理矮牽牛矮牽牛+爬山虎爬山虎細胞團細胞團愈傷組織愈傷組織（異核體）（異核體）ntnt培養(yǎng)基培養(yǎng)基msms培養(yǎng)基培養(yǎng)基( (無激素無激素) )ntnt培養(yǎng)基培養(yǎng)基ntnt培養(yǎng)基培養(yǎng)基細細 胞胞 團團msms培養(yǎng)基培養(yǎng)基(無激素無激素)死亡死亡msms培養(yǎng)基培養(yǎng)基(有激素有激素)愈傷組織愈傷組織原生質體原生質體細胞團細胞團msms培養(yǎng)基培養(yǎng)基( (無激素無激素) )死亡死亡愈傷組織愈傷組織體細胞雜種選擇及雜種植株鑒定體細胞雜種選擇及雜種植株鑒定v細胞學鑒定細胞學鑒定利用染色體顯帶技術，以親本染色體為

25、對利用染色體顯帶技術，以親本染色體為對照，對細胞雜種的染色體數目、形態(tài)和照，對細胞雜種的染色體數目、形態(tài)和帶帶型型進行觀察。進行觀察。體細胞雜種選擇及雜種植株鑒定體細胞雜種選擇及雜種植株鑒定v同功酶鑒定同功酶鑒定根據親本和雜種同根據親本和雜種同功酶譜的差異來鑒功酶譜的差異來鑒別雜種。有的呈雙別雜種。有的呈雙親譜帶的總和、有親譜帶的總和、有的出現新譜帶或丟的出現新譜帶或丟失部分親本譜帶。失部分親本譜帶。常用的鑒定酶為：常用的鑒定酶為：乙醇脫氫酶、乳酸乙醇脫氫酶、乳酸脫氫酶、過氧化物脫氫酶、過氧化物酶、酯酶等。酶、酯酶等。體細胞雜種選擇及雜種植株鑒定體細胞雜種選擇及雜種植株鑒定vdna分子標記鑒定分子標記鑒定是在是在dna水平上對水平上對親本和雜種植株遺親本和雜種植株遺傳差異進行鑒定的傳差異進行鑒定的一種技術。一種技術。依據依據dna的多態(tài)性的多態(tài)性（polymorphism）random amplif