報(bào)告題目東海大學(xué)化學(xué)工程與材料工程學(xué)系.doc

1、題目：培養(yǎng)條件對(duì)毛黴mucor rouxii.生產(chǎn)多元不飽和脂肪酸之影響研究生：沈鳳堯 指導(dǎo)教授：楊芳鏘 摘要本研究探討不同培養(yǎng)環(huán)境對(duì)mucor rouxii bcrc 30546多元不飽和脂肪酸生成之影響。主要考量因素包括：培養(yǎng)時(shí)間、溫度、溶氧量、培養(yǎng)基組成、油類的添加、剪切力及外接式均質(zhì)機(jī)（polytrron）等。結(jié)果顯示：在三角瓶中，最佳培養(yǎng)條件為：碳源30 g/l、氮源5 g/l、ph 5.5、溫度30，其菌體濃度（5.608 g/l）、gla濃度（0.086 g/l）、細(xì)胞油脂含量（21.6）與總油脂（1.323 g/l）。培養(yǎng)基中碳氮比的高低、添加的葵花油濃度及在不同的溶氧程度操作

2、條件下，皆會(huì)造成菌體生長(zhǎng)及代謝的明顯差異。在5 l發(fā)酵槽中，轉(zhuǎn)速500 rpm、通氣量1 vvm操作下，兩階段控溫造成菌體濃度減少，使得gla濃度下降，但在菌體生產(chǎn)gla的能力上卻能提高42，推測(cè)可能在低溫時(shí)，菌體為了要適應(yīng)其環(huán)境，而增加pufas之生成。而在饋料批式操作下則提高12.5細(xì)胞油脂含量，並且維持菌體濃度在8 g/l左右，且油脂穩(wěn)定累積。將兩階段控溫與饋料批式同時(shí)進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)不但可以有效增加菌體生產(chǎn)gla的能力，提高了67，並且最大gla濃度則從0.285 g/l增加到了0.443 g/l ，約有55的提昇。此外，將轉(zhuǎn)速由500 rpm降低至300 rpm，利用兩階段控溫與饋料批式操

3、作再加上外接式均質(zhì)機(jī)，則可以在低轉(zhuǎn)速下，有效阻止菌絲體的聚集，最大菌體濃度由原本的7.65 g/l增加至9.11 g/l，增加了19，且在脂肪酸生合成以及油脂累積方面，也有明顯的提升效果。一、 緒論1-1 前言多元不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, pufas)，對(duì)於人體生理功能有很大的益處，例如：-次亞麻油酸（-linolenic acid，gla）是人體母乳中所含的多元不飽和脂肪酸，具有緩和過(guò)敏性皮膚炎、改善生理痛、緩和痛風(fēng)等功效，是嬰兒攝取多元不飽和脂肪酸的主要來(lái)源，一般如要取得大量油脂的方法大多由植物或動(dòng)物組織所萃取。一般植物油，如紅花油、葵花油、大豆

4、油.等含有豐富的-6系脂肪酸；動(dòng)物油方面，一般家禽、家畜所含的油脂多為飽和脂肪酸，長(zhǎng)期食用容易發(fā)生心血管疾病。深海魚類之魚油及脂質(zhì)中，則含有豐富的-3系多元不飽和脂肪酸，不會(huì)使血液中之膽固醇及三酸甘油脂增加，不易使血管阻塞，並且還有抗血栓之形成及降低三酸甘油脂的作用，可以預(yù)防與治療人類心血管與免疫系統(tǒng)方面之疾病。 -6系多元不飽和脂肪酸之gla為例，傳統(tǒng)來(lái)源為月見(jiàn)種子萃取油，琉璃苣種子萃取油以及黑醋栗種子萃取油。這些富含gla的植物籽油，在美國(guó)大約有一年2000噸、每公斤市價(jià)100美金之市場(chǎng)1。二、文獻(xiàn)回顧2-1多元不飽和脂肪酸簡(jiǎn)介 脂質(zhì)主要是由脂肪酸（fatty acids）與甘油（glyc

5、erol）所組成，其中脂肪酸是存在於生物體內(nèi)之生物生合成物質(zhì)。脂肪酸為325 碳原子以單鍵或雙鍵相連而成的碳?xì)浠衔?，由碳、氫、氧三元素所組成，一端為甲基(-ch3)，另一端為羧基(-cooh)，原子之間以共價(jià)鍵串聯(lián)，中間的碳原子上都連接有兩個(gè)氫原子。天然脂肪酸為偶數(shù)碳，依其碳鏈?zhǔn)欠窈须p鍵，可區(qū)分成飽和脂肪酸、元不飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸的雙鍵大多以順式（cis-configuration）存在。含有兩個(gè)以上雙鍵之不飽和脂肪酸稱為多元不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, pufas)，其命名方式可簡(jiǎn)寫成cx：ynz，x代表碳源子的多寡、y為雙鍵數(shù)，nz則是甲基

6、端算起的第一個(gè)雙鍵位置1。以-次亞麻油酸為例，c18：3n6，即有18個(gè)碳、三個(gè)雙鍵，由結(jié)構(gòu)得知雙鍵位置是從甲基端算起第六、第九及第十二個(gè)碳上。（圖1）為脂肪酸之分類。2-2多元不飽和脂肪酸之微生物來(lái)源 傳統(tǒng)上大量的多元不飽和脂肪酸之取得方法多由動(dòng)物組織或植物之果實(shí)種子所萃取。植物部分如紅花油、葵花油、大豆油、玉米油以及上述的月見(jiàn)草籽油、琉璃苣子油等。動(dòng)物方面如深海魚類之魚油以及脂質(zhì)中，則含有豐富的-3系多元不飽和脂肪酸，如epa與dha。但這只是因?yàn)槔鄯e食物鏈中微生物的油脂於體內(nèi)（海洋微藻->浮游生物->魚類），魚類本身並沒(méi)有合成多元不飽和脂肪酸之能力1。所以微藻類、細(xì)菌、黴菌和

7、真菌等微生物，才是合成多元不飽和脂肪酸的主要來(lái)源。2-3多元不飽和脂肪酸之合成途徑 微生物體內(nèi)鏈增長(zhǎng)與所有生物體脂肪酸增長(zhǎng)路徑相同，以乙醯輔酶a或乙醯磷脂質(zhì)(acyl-phopspholipid)為起始，然後經(jīng)去飽和脂肪酵素作用，分成-3、-6、-9三系列之脂肪酸生成路徑，因此原核細(xì)胞以及某些細(xì)菌的多元不飽和脂肪酸生合成之有氧路徑，是由飽和脂肪酸經(jīng)9去飽和酵素作用為起始，由此可之微生物是以油酸(c18：1 cis 9)為起始，於12去飽和成亞麻油酸(c18：2)，在以15去飽和生成-次亞麻油酸( c18：3)，此三種脂肪酸即為-9、-6以及-3系列脂肪酸的先驅(qū)物質(zhì)，而多元不飽和脂肪酸的生合成分

8、別是從此三種先驅(qū)物之6位置去飽和及延長(zhǎng)，再一次於5位置去飽和及增長(zhǎng)，分別產(chǎn)生c20和c22的多元不飽和脂肪酸如（圖2）。 2-4影響油脂性真菌產(chǎn)油量之因素 環(huán)境因素影響包括了物理（溫度、機(jī)械剪切力、ph），或化學(xué)因子（培養(yǎng)基組成）。（1）培養(yǎng)時(shí)間：隨著培養(yǎng)時(shí)期的進(jìn)行，油脂性微生物合成脂質(zhì)可分為兩階段：第一階段，細(xì)胞生長(zhǎng)期（growth phase），此時(shí)營(yíng)養(yǎng)充分，微生物的菌體量與油脂同時(shí)增加中；第兩階段為脂肪合成期（production phase），若碳源仍充足但其他養(yǎng)分耗盡，脂肪酸持續(xù)累積於菌體內(nèi)；若碳源與其他養(yǎng)分皆耗盡時(shí)，某些微生物會(huì)自行分解內(nèi)脂質(zhì)作為碳源來(lái)使用2。（2）培養(yǎng)基組成影響微

9、生物生長(zhǎng)最重要的因素莫過(guò)於培養(yǎng)基的組成，特別是基質(zhì)組成裡比重很大的碳源與氮源，其影響微生物生理狀態(tài)的程度更加直接。碳源與氮源是微生物合成細(xì)胞時(shí)所需要的成分，但在碳源足夠而氮源欠缺的情況下，微生物不在增殖，而是將所吸收的碳源轉(zhuǎn)變成脂質(zhì)。(3）ph 培養(yǎng)基的酸鹼度往往直接了培養(yǎng)基裡養(yǎng)分的溶解度以及對(duì)微生物的質(zhì)傳，甚至影響與生長(zhǎng)有關(guān)的酵素反應(yīng)。在菌相型態(tài)上，在不同的ph値培養(yǎng)下會(huì)有不同的菌體型態(tài)，是由於ph値影響了真菌細(xì)胞壁對(duì)機(jī)械應(yīng)力的抵抗力。（4）溫度許多研究皆發(fā)現(xiàn)在低溫時(shí)，微生物具有較高的之-3系列不飽和脂肪酸之生產(chǎn)能力。推測(cè)是在低溫環(huán)境下，微生物為了要適應(yīng)低溫，而增加多元不飽和脂肪酸之生成。文

10、獻(xiàn)指出在低溫時(shí)有較多氧溶於培養(yǎng)基中，而氧氣是脂肪酸進(jìn)行去飽和酵素作用時(shí)所必需，故可能是溫度的不同造成溶氧不同而影響菌體生長(zhǎng)以及代謝。（5）震盪速率震盪培養(yǎng)提供了菌體與養(yǎng)分與較佳氧氣的質(zhì)傳效果。當(dāng)震盪速率過(guò)慢時(shí)，除了菌體與培養(yǎng)基間的接觸變的不均勻之外，液面與空氣接觸的面積變小，而造成溶氧不足導(dǎo)致去飽和與鏈延長(zhǎng)酵素作用能力下降；過(guò)快，所生的剪應(yīng)力（shear stress）對(duì)菌體生長(zhǎng)的有一定的傷害。（6）油類與酒精的添加 油類的添加不但可以增加油脂的累積並且可以從碳鏈的長(zhǎng)度以及添加油脂結(jié)構(gòu)的改變知道累積的油脂組成.有文獻(xiàn)指出在培養(yǎng)基中，細(xì)胞外的油脂會(huì)造成絲狀真菌在生合成脂肪酸時(shí)，油脂會(huì)在液面或菌體

11、表面形成油膜，改變培養(yǎng)基質(zhì)、氧傳效果以及菌體間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞，間接改變菌體吸收以及代謝能力，而使得去飽和以及延長(zhǎng)作用受到抑制，但是由於加入的油脂中會(huì)含特定的脂肪酸，因此可以扮演基質(zhì)或前驅(qū)物來(lái)合成新的脂肪酸，可由此達(dá)到可以有商業(yè)價(jià)值的脂肪酸進(jìn)行生產(chǎn)3。三、實(shí)驗(yàn)材料與分析方法3-1 菌株本研究菌株來(lái)源為新竹食品工業(yè)發(fā)展研究所之生物資源保存暨研究中心的mucor rouxii bcrc no.30546。前培養(yǎng)之液態(tài)培養(yǎng)基組成以lindberg(1991)4最佳化之培養(yǎng)基質(zhì)組成作為前培養(yǎng)基質(zhì)。主培養(yǎng)之液態(tài)培養(yǎng)基組成本研究以(2005,宋)5中的培養(yǎng)基組成作為主培養(yǎng)基。3-2實(shí)驗(yàn)分析方法菌體濃度菌體分析

12、方法如下：（1） 當(dāng)菌體培養(yǎng)至收成時(shí)間，取100 ml菌液並抽氣過(guò)濾之。（2） 沖洗過(guò)濾菌體若干次再濾乾。（3） 將菌體從濾紙刮下並放置於玻璃取樣瓶中，隨後於-20下冰凍之。（4） 於取樣瓶口中用鋁箔紙密封並戳數(shù)洞，於-110、100 mmhg下冷凍乾燥24 hr。（5） 取出冷凍乾燥之菌體秤重紀(jì)錄之，並經(jīng)由換算可得菌體濃度。脂質(zhì)萃取與水解 稱取0.1克之菌體重，使用均質(zhì)機(jī)以15000 rpm打碎2分鐘，再加入8 ml之15（w/v）氫氧化鉀酒精溶液置於一密封玻璃瓶中於70水浴中水解2小時(shí)後，利用濃鹽酸將ph調(diào)至3以下，再用正己烷8 ml連續(xù)萃取兩次，每一次均震盪1分鐘，合併後取出正己烷層，置

13、於70烘箱中24小時(shí)，測(cè)油脂重。 脂肪酸甲酯之製備樣品處理步驟如下：（1）細(xì)胞破碎：秤取0.1克之細(xì)胞乾重並加入koh / meoh溶液、以細(xì)胞破碎機(jī)破碎細(xì)胞，儘可能的不要有糾結(jié)成團(tuán)的菌體存在，以免造成實(shí)驗(yàn)上分析誤差。（2）皂化：將以破碎的koh / meoh菌液，於60密閉狀態(tài)下水浴30分鐘進(jìn)行皂化反應(yīng)。本反應(yīng)為鹼催化製程，生成脂肪酸鉀。（3）甲酯化：將前述皂化後的產(chǎn)物冷卻至室溫，加入hcl / meoh以及bf3 / meoh 作為催化劑。於60水浴30分鐘形成脂肪酸甲酯，反應(yīng)冷卻後加入飽和nacl 溶液均勻混合，以避免乳化。再添加正己烷（n-hexane）以萃取脂肪酸甲酯再以gc分析。第

14、四章 、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論4-1三角瓶實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間之影響 如圖3所示，在4天以前為生長(zhǎng)期，其菌體濃度與油脂隨時(shí)間進(jìn)行而累積，到第四天時(shí)其碳源已經(jīng)消耗完了，而此時(shí)的菌體濃度（5.608 ± 0.244 g/l）、gla濃度（0.086 ± 0.0025 g/l）、細(xì)胞油脂含量（21.6 ± 2.35）與總油脂（1.323 ± 0.111 g/l）則到達(dá)到最高點(diǎn)，第四天後，推測(cè)由於沒(méi)有碳源可以提供微生物生長(zhǎng)以及代謝，菌體便會(huì)自我分解細(xì)胞體內(nèi)儲(chǔ)存的油脂來(lái)當(dāng)作碳源使用，而菌體的自我分解導(dǎo)致細(xì)胞油脂含量、gla濃度與總油脂的減少。碳氮比之影響 由圖4可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)我們將

15、菌體培養(yǎng)至一定濃度時(shí)，再置入於新的培養(yǎng)基中，而當(dāng)新的培養(yǎng)基中沒(méi)有任何氮源時(shí)，其細(xì)胞油脂含量為最高，但是因?yàn)槿狈Φ矗沟镁w無(wú)法再次生長(zhǎng)，因此菌體濃度為最低，也造成總油脂無(wú)法再往上提升；當(dāng)在有添加氮源時(shí)，無(wú)論氮源濃度的多寡，其細(xì)胞油脂含量，皆低於不加氮源的條件。 添加sunflower oil之影響由圖5所示，當(dāng)添加10 g/l的葵花油時(shí)達(dá)到最大值，gla濃度從沒(méi)有添加時(shí)的0.086 g/l提升到0.095 g/l，提高了將近10，但是無(wú)論添加多少濃度的油類，對(duì)菌體的生成以及油脂的累積則有不利的影響，推測(cè)由於添加油類會(huì)在液面或菌體表面形成油膜，改變培養(yǎng)基質(zhì)、造成氧傳效果變差以及菌體間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳

16、遞困難，改變了菌體吸收以及代謝能力。並且因?yàn)閬喡橛退崾谴蝸喡橛退岬那膀?qū)物，因此有刺激次亞麻油酸（gla）的生成效果，但是當(dāng)濃度過(guò)高則不利於gla之生產(chǎn)。4-2 5 l發(fā)酵槽兩階段控溫 由圖6可知，第48小時(shí)將溫度降低至20後，明顯的發(fā)現(xiàn)菌體濃度開(kāi)始減少，造成gla濃度、總油脂的下降，值得注意的是，當(dāng)將溫度從30降到20時(shí)，do值也從100降到80左右，推測(cè)可能是微生物為要適應(yīng)低溫的環(huán)境下，在生產(chǎn)大量多元不飽合脂肪酸的同時(shí)，對(duì)氧的需求量增加了。饋料批式 由圖7可知，第48小時(shí)加入320 g/l 的葡萄糖250 ml 觀察發(fā)現(xiàn)，其菌體濃度均維持在8 g/l左右，雖然此時(shí)菌體已不再繼續(xù)生長(zhǎng)，但是加入

17、的碳源則可以有效的抑制菌體自我分解的情況發(fā)生，也因?yàn)槿绱?，使得總油脂也穩(wěn)定維持在4 g/l上下，而do溶氧的下降在此實(shí)驗(yàn)中並沒(méi)有發(fā)生。兩階段控溫並搭配饋料批式 有鑒於兩階段控溫以及饋料批式之實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)過(guò)程中降低溫度，可以增加菌體生產(chǎn)多元不飽和脂肪酸的能力，但是此時(shí)的菌體濃度會(huì)因此而減少，導(dǎo)致gla濃度與總油脂的減少；而在培養(yǎng)過(guò)程中加入碳源，則可以減少細(xì)胞因?yàn)樘荚吹牟蛔?，而發(fā)生自我分解的現(xiàn)象，因此將兩者同時(shí)操作將可能有利於脂肪酸合成以及油脂累積。 如圖8發(fā)現(xiàn)在48小時(shí)將溫度改變以及添加碳源之後，其菌體濃度依然會(huì)呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)，有別於單純只是改變溫度時(shí)之條件，此時(shí)菌體減少的速率較慢，這說(shuō)明了

18、溫度對(duì)於菌體濃度的影響大於碳源的影響。polytron 間歇式均質(zhì) 如圖9所示，雖然有外接polytron，但在48小時(shí)後，降溫所產(chǎn)生的影響以及饋料批式的效果一樣存在，且在轉(zhuǎn)速300 rpm時(shí)，利用polytron間歇式均質(zhì)，就不會(huì)有菌體聚集的情形發(fā)生，且最大菌體濃度達(dá)到9.11 g/l。 將不同的操作方式做一個(gè)比較如表1，當(dāng)我們?cè)谂囵B(yǎng)過(guò)程採(cǎi)用兩階段控溫，發(fā)現(xiàn)菌體生產(chǎn)gla的能力增加了，對(duì)於恆溫以及饋料批式條件下分別增加了42與47，說(shuō)明了溫度對(duì)產(chǎn)gla的影響；而對(duì)於油脂的累積，發(fā)現(xiàn)添加的碳源的確是可以增加細(xì)胞的油脂含量，對(duì)於恆溫以及兩階段控溫條件下則分別增加了12.5以及17，說(shuō)明碳源影響到

19、細(xì)胞油脂的累積；而將兩階段控溫搭配饋料批式之方法則可以將gla濃度提升，從恆溫條件下的0.285 g/l到0.443 g/l提高了將近55，且又不會(huì)造成油脂累積的減少；而在300 rpm轉(zhuǎn)速下，外接polytron間歇式均質(zhì)，可以使最大菌體濃度由原本的7.65 g/l增加至9.11 g/l，增加了19，且在脂肪酸生合成以及油脂累積方面，也有明顯的提升效果。第五章、結(jié)論以及未來(lái)展望5-1 結(jié)論mucor rouxii生產(chǎn)多元不飽和脂肪酸時(shí)，需要氧分子進(jìn)行去飽和作用，因此培養(yǎng)中如何讓菌體有充足的溶氧，是影響多元不飽和脂肪酸濃度高低以及組成的重要關(guān)鍵。在三角瓶實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)：適當(dāng)?shù)奶荚磁c限制的氮源濃度

20、，是菌體生長(zhǎng)以及油脂累積的關(guān)鍵，除此之外，發(fā)現(xiàn)溫度、碳氮比、震盪速率以及培養(yǎng)體積，亦會(huì)影響菌體濃度，還會(huì)造成培養(yǎng)液裡溶氧程度的不同，而影響菌體在合成多元不飽和脂肪酸時(shí)的能力，而添加油類則可以有效的促進(jìn)gla的生成。當(dāng)培養(yǎng)系統(tǒng)中如果有溶氧不足、碳源缺乏或者碳源濃度過(guò)高等情形時(shí)，菌絲的尾端就會(huì)有大量的分節(jié)孢子出現(xiàn)，當(dāng)有這種現(xiàn)象發(fā)生時(shí)，皆不利於菌體生長(zhǎng)、脂肪酸生合成以及油脂的累積。 5 l發(fā)酵槽實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)通氣量的大小、溶氧值差異以及轉(zhuǎn)速高低不同，影響菌體濃度、不飽和脂肪酸、油脂累積的情形更明顯；兩階段控溫雖然會(huì)提高菌體生產(chǎn)gla的能力但卻不利於菌體濃度；饋料批式則可以有效的抑制菌體的自我分解情況發(fā)

21、生；而將兩者結(jié)合，則發(fā)現(xiàn)菌體濃度依然會(huì)受到溫度的影響，但添加的碳源則可減緩菌體濃度下降的速度，而細(xì)胞油脂含量並沒(méi)有如預(yù)期的增加，但菌體生產(chǎn)gla的能力則明顯增加，而且gla濃度則從0.285 g/l增加到了0.443 g/l；外接式的polytron的確可以有效的降低菌體的聚集，對(duì)於脂肪酸生合成以及油脂累積皆有明顯的幫助，但是polytron的效果取決於均質(zhì)頻率，因?yàn)闀r(shí)間的長(zhǎng)短以及轉(zhuǎn)速的高低，皆會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)及代謝造成不同程度的影響。5-2未來(lái)展望1. 以農(nóng)業(yè)廢棄物為基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，例如：米糠、麥麩、馬鈴薯皮等，亦可生產(chǎn)多元不飽和脂肪酸，利用農(nóng)產(chǎn)廢棄物不僅可減少環(huán)境污染，也可以降低發(fā)酵成本，是

22、種符合經(jīng)濟(jì)效益的生產(chǎn)方式。2. 均質(zhì)機(jī)（polytron）在發(fā)酵槽的應(yīng)用上， 其均質(zhì)的頻率對(duì)於菌體形態(tài)、生長(zhǎng)以及代謝有很大的關(guān)聯(lián)，因此找出最佳的均質(zhì)條件，將是可以未來(lái)可以再進(jìn)一步探討的方向。參考文獻(xiàn)1 alonso, d.l., maroto, f.g.,（2000）.,plant as chemical factories for the production of polyunsaturated fatty acids, biotechnology advances 18：481-497.2 kavadia, a., komaitis, m., chevalot, i., blanchar

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