最新7第七章重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞精選PPT文檔

1、 轉(zhuǎn)化過(guò)程中，這些分子同時(shí)被轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化過(guò)程中，這些分子同時(shí)被轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)。移到宿主細(xì)胞內(nèi)。 未連接的分子即使被細(xì)菌攝取，只未連接的分子即使被細(xì)菌攝取，只有在特殊的條件下才能復(fù)制，寄主的有在特殊的條件下才能復(fù)制，寄主的酶可降解這些酶可降解這些dna片段。片段。 自連的載體和錯(cuò)誤插入的重組質(zhì)自連的載體和錯(cuò)誤插入的重組質(zhì)?？梢赃M(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行正常的復(fù)制粒可以進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行正常的復(fù)制一、轉(zhuǎn)化方法一、轉(zhuǎn)化方法 自然界中，轉(zhuǎn)化并不是細(xì)菌遺傳信自然界中，轉(zhuǎn)化并不是細(xì)菌遺傳信息傳遞的主要方式，實(shí)驗(yàn)室中只有小部息傳遞的主要方式，實(shí)驗(yàn)室中只有小部分的細(xì)菌可以很容易的轉(zhuǎn)化。分的細(xì)菌可以很容易的轉(zhuǎn)化。 正常條件下，

2、大部分細(xì)菌包括大腸正常條件下，大部分細(xì)菌包括大腸桿菌，只能吸收有限的桿菌，只能吸收有限的dna，為了提高，為了提高轉(zhuǎn)化效率，建立了一系列的轉(zhuǎn)化方法：轉(zhuǎn)化效率，建立了一系列的轉(zhuǎn)化方法： 供體菌游離供體菌游離dnadna供體菌供體菌dnadna（轉(zhuǎn)化因子）（轉(zhuǎn)化因子）轉(zhuǎn)化示意圖轉(zhuǎn)化示意圖 a. 熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 b. peg介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 c. 高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化 d. 顯微注射法轉(zhuǎn)化顯微注射法轉(zhuǎn)化 e. 接合轉(zhuǎn)化接合轉(zhuǎn)化f. 噬菌體轉(zhuǎn)染噬菌體轉(zhuǎn)染 大腸桿菌常用轉(zhuǎn)化方法的比較大腸桿菌常用轉(zhuǎn)化方法的比較 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 化化 方方 法法轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 化化 效

3、效 率率ca 誘誘 導(dǎo)導(dǎo)107-8原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化105-6噬菌體轉(zhuǎn)化噬菌體轉(zhuǎn)化107-8電電 穿穿 孔孔 法法106-9（100kb）接接 合合 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 化化104-5一）受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件一）受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件 a. 限制性缺陷型限制性缺陷型recb-，recc-，hsdr-（外切、內(nèi)切酶）（外切、內(nèi)切酶） b. 重組整合缺陷型重組整合缺陷型reca-（對(duì)于用于基（對(duì)于用于基因擴(kuò)增或基因高效表達(dá)的受體）因擴(kuò)增或基因高效表達(dá)的受體） c. 具有較高的轉(zhuǎn)化效率具有較高的轉(zhuǎn)化效率 d. 具有與重組體互補(bǔ)的遺傳性狀具有與重組體互補(bǔ)的遺傳性狀 e. 感染與寄生缺陷型感染與寄生缺陷型 安全角

4、度的要求。安全角度的要求。 二）大腸桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化二）大腸桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化 感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞(competent cells): 受體受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法的處理后，細(xì)胞細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許有外膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許有外源源dna的載體分子通過(guò)的感受態(tài)細(xì)胞的載體分子通過(guò)的感受態(tài)細(xì)胞(competent cells) 。1、熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞、熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞2 2、氯化鈣法轉(zhuǎn)化、氯化鈣法轉(zhuǎn)化 在某些情況下，在某些情況下，cacl2只影響只影響dna的結(jié)合，并不影響細(xì)胞的吸收，的結(jié)合，并不影響細(xì)胞的吸收，當(dāng)當(dāng)dna分子

5、加到處理的細(xì)胞內(nèi)，仍然分子加到處理的細(xì)胞內(nèi)，仍然吸附在細(xì)胞的外部，并沒(méi)有轉(zhuǎn)化到細(xì)吸附在細(xì)胞的外部，并沒(méi)有轉(zhuǎn)化到細(xì)胞質(zhì)中，將胞質(zhì)中，將dna帶入感受態(tài)細(xì)胞的條帶入感受態(tài)細(xì)胞的條件可提高溫度到件可提高溫度到42。 3、peg介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化4、高壓電穿孔法、高壓電穿孔法（1）基本原理）基本原理在高壓電場(chǎng)的作用下，細(xì)胞膜發(fā)生臨時(shí)性破裂形在高壓電場(chǎng)的作用下，細(xì)胞膜發(fā)生臨時(shí)性破裂形成微孔，細(xì)胞外環(huán)境中的核酸分子便會(huì)穿孔而入，并成微孔，細(xì)胞外環(huán)境中的核酸分子便會(huì)穿孔而入，并最終進(jìn)到細(xì)胞核內(nèi)部。最終進(jìn)到細(xì)胞核內(nèi)部。(2)影響因素影響因素脈沖的最大電壓脈沖的最大電壓 脈沖持續(xù)的時(shí)間脈沖持續(xù)

6、的時(shí)間 與與dna濃度則無(wú)多大關(guān)系濃度則無(wú)多大關(guān)系電穿孔轉(zhuǎn)染效率主要取決于所用的細(xì)胞類(lèi)型。電穿孔轉(zhuǎn)染效率主要取決于所用的細(xì)胞類(lèi)型。對(duì)于不適合用傳統(tǒng)方法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用電穿孔法對(duì)于不適合用傳統(tǒng)方法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用電穿孔法得到的永久轉(zhuǎn)化的頻率約為得到的永久轉(zhuǎn)化的頻率約為10-410-5之間。之間。5、顯微注射法轉(zhuǎn)化、顯微注射法轉(zhuǎn)化在顯微鏡下，用顯微操作裝置對(duì)細(xì)胞進(jìn)行解剖在顯微鏡下，用顯微操作裝置對(duì)細(xì)胞進(jìn)行解剖手術(shù)、人工受精、細(xì)胞核移植、基因注入、細(xì)手術(shù)、人工受精、細(xì)胞核移植、基因注入、細(xì)胞內(nèi)微量注射、胚胎切割等的技術(shù)。胞內(nèi)微量注射、胚胎切割等的技術(shù)。（1）真正的顯微注射）真正的顯微注射(true mi

7、croinjection)法法 dna是由注射針直接注入細(xì)胞是由注射針直接注入細(xì)胞（2）“穿刺穿刺”(pricking)導(dǎo)入法導(dǎo)入法 dna是處在細(xì)胞周?chē)囵B(yǎng)基中，它通過(guò)穿刺形成是處在細(xì)胞周?chē)囵B(yǎng)基中，它通過(guò)穿刺形成的小孔進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)部，或是隨穿刺的針頭一道進(jìn)入的小孔進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)部，或是隨穿刺的針頭一道進(jìn)入的。的。 用顯微注射法轉(zhuǎn)移基因的效率明顯地超出其它方用顯微注射法轉(zhuǎn)移基因的效率明顯地超出其它方法。顯微注射用的受體細(xì)胞，多數(shù)是沿培養(yǎng)皿貼壁生法。顯微注射用的受體細(xì)胞，多數(shù)是沿培養(yǎng)皿貼壁生長(zhǎng)的長(zhǎng)的單層細(xì)胞單層細(xì)胞。顯微注射分為顯微注射分為 6、接合轉(zhuǎn)化、接合轉(zhuǎn)化不需要細(xì)菌細(xì)胞不需要細(xì)菌細(xì)胞的直

8、接接觸的直接接觸基因重組的范圍基因重組的范圍更小，只限于更更小，只限于更小的一段染色體小的一段染色體片段和少數(shù)幾個(gè)片段和少數(shù)幾個(gè)緊密連鎖的基因緊密連鎖的基因 細(xì)菌的細(xì)菌的“接合接合”狀態(tài)狀態(tài)接合- f+ff+f-f+f-f+f+f+f+donorrecipient染色體染色體質(zhì)粒f+菌f- 菌f質(zhì)粒的半保留轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的半保留轉(zhuǎn)移f+菌染色體hfr質(zhì)粒f+菌f質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的不同結(jié)果質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的不同結(jié)果f 質(zhì)粒二、二、phage dna的轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化 兩種方法可以將噬菌體兩種方法可以將噬菌體dna轉(zhuǎn)入細(xì)菌：轉(zhuǎn)入細(xì)菌：1） 轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染（transfection）：是將純化）：是將純化的噬菌體的噬菌體dna通過(guò)

9、熱激的方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)通過(guò)熱激的方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌的過(guò)程。大腸桿菌的過(guò)程。2） 體外裝配（體外裝配（in vitro packaging）：）： dna的轉(zhuǎn)染效率不高，如果將重組的的轉(zhuǎn)染效率不高，如果將重組的分分子裝配成頭子裝配成頭-尾結(jié)構(gòu)的病毒粒子，將極大的尾結(jié)構(gòu)的病毒粒子，將極大的提高效率。提高效率。 噬菌體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法 一）一） dna的轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染 dna的轉(zhuǎn)染作用，是一種低效的過(guò)程。的轉(zhuǎn)染作用，是一種低效的過(guò)程。使用未經(jīng)任何基因操作處理的新鮮制備的使用未經(jīng)任何基因操作處理的新鮮制備的 dna，其，其典型的轉(zhuǎn)染效率（即每微克典型的轉(zhuǎn)染效率（即每微克dna轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的噬菌斑轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的噬菌斑數(shù)目），也僅為數(shù)目），也僅為 105106之間。之間。體外連接的結(jié)果，轉(zhuǎn)染效率便下降到了體外連接的結(jié)果，轉(zhuǎn)染效率便下降到了104103左右。左右。二）二）噬菌體的體外裝配噬菌體的體外裝配 有兩種不同的系統(tǒng)可以應(yīng)用：有兩種不同的系統(tǒng)可以