北五味子中4種木脂素類化合物的高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定

1、北五味子中 4 種木脂素類化合物的高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定 11-04-24 16:22:00 編輯： studa20作者：可成友，邊薔，康宏玲，于亮，吳曉芳，徐培石【摘要】目的建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定北五味子中4 種木脂素類化合物的分析方法。方法考察流動(dòng)相組成及配比、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫、流速和進(jìn)樣量對(duì)測(cè)定的影響，確定了最佳色譜條件：流動(dòng)相為乙腈- 水，梯度洗脫程序?yàn)椋?025 min 乙腈水 =5050(V/V);25 35 min 線性變化到 7030(V/V) ，并保持 5 min;40 44 min 再線性變化到 8020(V/V);DAD 檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為五味子醇甲、五味子甲素和五味子

2、乙素 216 nm，五味子酯甲 222 nm; 柱溫 25; 流速 0.8 ml/min; 進(jìn)樣量 10.0 l 。結(jié)果在最佳色譜條件下， 4 種化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為 0.999 4 0.999 8 ，各組分的檢出限為 0.04 0.05 g/ml ，平均回收率為 90.23 95.24%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 3.2%4.9%。結(jié)論該方法靈敏，準(zhǔn)確，實(shí)現(xiàn)了對(duì) 4 種木脂素類化合物的同時(shí)測(cè)定。【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法; 北五味子 ; 木脂素五味子為木蘭科植物五味子的成熟果實(shí)，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效。北五味子主產(chǎn)于吉林、遼寧、黑龍江，具有很高的藥用價(jià)值1 。建立一種

3、高效、快速、準(zhǔn)確測(cè)定五味子中有效成分的方法，對(duì)五味子的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)跟蹤 2 ，3 ，意義將非常重大，同時(shí)也為北五味子規(guī)范化種植基地的藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)提供依據(jù)?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)外對(duì)于木脂素的測(cè)定方法研究的比較多47 ，但各種方法都有不同程度的缺陷。本研究采用高效液相色譜法對(duì)五味子中4 種木脂素類化合物的同時(shí)測(cè)定進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，實(shí)現(xiàn)了4 種化合物的同時(shí)測(cè)定。經(jīng)實(shí)際樣品檢測(cè)和分析性能研究表明，方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、可靠。1 器材1.1 儀器與試劑 Agilent HP1100高效液相色譜儀 ( 配有四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器); 色譜柱：迪馬公司Diamonsil( 鉆石

4、 )C18 柱(250 mm×4.6 mm， 5 m); 超純水發(fā)生系統(tǒng)(MILLIPORE公司 );LG10-2.4A 型高速離心機(jī) ( 北京醫(yī)用離心機(jī)廠 );C18 固相萃取小柱 (3 ml ， 100 mg， waters 公司 );TurboVap LV氮?dú)獯蹈蓛x (Zymark 公司 ); 13 mm 0.22 m一次性微孔樣品過濾膜 ( 希波氏 );SHZ- D() 循環(huán)水式真空泵 ( 鞏義市英峪予華儀器廠 ) 。1.2 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品甲醇，色譜純(Fisher Chemicals公司 ); 標(biāo)準(zhǔn)品，五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素，均為化學(xué)對(duì)照品 ( 中國(guó)藥

5、品生物制品檢定所 ); 乙腈，色譜純 (Fisher Chemicals 公司 ); 丙酮，分析純 ( 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 ); 苯，分析純 ( 沈陽(yáng)市新西試劑廠 ); 正己烷，分析純 ( 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 ); 環(huán)己烷，分析純 ( 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 ) 。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別準(zhǔn)確稱取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品 0.010 0 g 于小燒杯中，加入乙腈溶解，轉(zhuǎn)移于 10 ml 容量瓶中，定容至刻度，混勻，制得各儲(chǔ)備液的濃度均為 1 000 g/ml 。北五味子 1 號(hào)和北五味子 2 號(hào)藥材，均由遼寧金世中藥材科技開發(fā)有限公司提供。1.3 色譜條

6、件色譜柱為迪馬公司Diamonsil(鉆石 )C18 柱(250 mm×4.6mm，5 m); 流動(dòng)相為 A 乙腈， B 水;梯度洗脫程序： 0 25 min 流動(dòng)相配比為乙腈水 =5050 (V/V);25 35 min 流動(dòng)相比例線性變化到7030(V/V);35 40 min 保持乙腈水 =7030(V/V);40 44 min 再線性變化到 8020(V/V) 。2 方法2.1 樣品預(yù)處理化，保持水的液面為C18固相萃取柱活化：分別用2 mm左右時(shí)上樣。10 ml甲醇和10 ml水活準(zhǔn)確稱取 0.100 0 g 樣品于比色管中，加入 10 ml 乙腈超聲 40 min 左右，

7、將所得液體和固體混合物過濾，得到澄清溶液和固體殘?jiān)?，用乙腈將固體殘?jiān)礈鞌?shù)次，合并乙腈液和原澄清溶液，將合并液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入 10%甲醇水溶液 10.00 ml 溶解，取出 1.00 ml 慢慢加入到已活化的 C18固相萃取柱中，全程的層析過程中不應(yīng)使柱干涸，用 5 ml 水做淋洗液洗柱，棄去全部淋洗液，用 5 ml 甲醇做洗脫液洗柱，收集洗脫液，用氮?dú)獯蹈蓛x吹干洗脫液，然后加入 1.00 ml 乙腈溶解，經(jīng) 0.22 m微孔濾膜過濾后待測(cè)。2.2 儀器操作按分析方法中設(shè)定的流動(dòng)相配比、流速、柱溫、檢測(cè)器溫度平衡整個(gè)液相色譜系統(tǒng)。待基線完全穩(wěn)定后進(jìn)樣分析，同時(shí)在 Offline 下進(jìn)行數(shù)據(jù)

8、處理與報(bào)告編輯。每次做完實(shí)驗(yàn)后應(yīng)先用 20 倍柱體積的溶液 ( 二次蒸餾水乙腈 =955) 沖洗色譜柱 ( 注意此時(shí)應(yīng)關(guān)閉檢測(cè)器 ) ，最后用純乙腈沖洗約20 min ，封柱，待用。 3 結(jié)果與討論3.1 色譜柱的選擇由于本實(shí)驗(yàn)欲分離的對(duì)象均為親脂性的物質(zhì)，又因?yàn)榉聪嗷瘜W(xué)鍵合色譜柱具有柱效高、重現(xiàn)性好、選擇性高、色譜柱壽命長(zhǎng)、可進(jìn)行梯度洗脫等優(yōu)點(diǎn)，可選用反相化學(xué)鍵合色譜法進(jìn)行分析，而且反相色譜使用水作為流動(dòng)相的主體能大大降低實(shí)驗(yàn)成本 8,9 。為此本實(shí)驗(yàn)選擇反相化學(xué)鍵合色譜柱，即 C18柱為色譜分離柱。3.2 流動(dòng)相體系的選擇本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇- 水流動(dòng)相體系和乙腈 - 水流動(dòng)相兩種體系下，

9、 4 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其樣品的色譜分離情況，實(shí)驗(yàn)得出， 4 種被測(cè)物質(zhì)在相同配比的兩種體系下均能得到洗脫和分離，而應(yīng)用甲醇 - 水體系分析時(shí)間長(zhǎng)，后出峰物質(zhì)的峰形變寬，而采用相同配比的乙腈 - 水體系可以大大縮短組分的保留時(shí)間，而且各物質(zhì)的峰形尖銳，對(duì)稱度好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樣品中的干擾物質(zhì)很多，欲滿足分析要求，必須使各種物質(zhì)有良好的分離度和洗脫效果，并且減少拖尾和包峰情況，應(yīng)用乙腈- 水體系能明顯抑制峰形變寬，而且乙腈-水體系溶劑強(qiáng)度大、黏度小，會(huì)使各物質(zhì)的洗脫和分離效果更好。為此本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈 - 水為流動(dòng)相體系。3.3 流動(dòng)相配比及洗脫方式和洗脫程序的確定本實(shí)驗(yàn)考察了樣品的色譜分離情況，樣品中的

10、干擾物質(zhì)很多，單純考慮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分離來(lái)確定流動(dòng)相的配比已經(jīng)不能滿足分離分析的要求，乙腈和水的配比調(diào)整為 6535，此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已能達(dá)到很好的分離，但樣品中五味子醇甲和五味子酯甲與周圍的干擾物質(zhì)仍然無(wú)法分開，而五味子甲素和五味子乙素的分配比較大，雖然已經(jīng)彼此分離開且周圍干擾較少，但色譜峰變寬。由此可見欲使被測(cè)物質(zhì)與其他的干擾物質(zhì)達(dá)到良好的分離，就需降低流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度，即減少流動(dòng)相中乙腈的含量，這樣會(huì)導(dǎo)致五味子甲素和五味子乙素的洗脫時(shí)間延長(zhǎng)，為此可采用梯度洗脫方式進(jìn)行分離，先以低強(qiáng)度流動(dòng)相洗脫 10 ，即開始時(shí)乙腈含量較少，待五味子醇甲和五味子酯甲以理想的分離度彼此分開后，逐漸增加乙腈的含量，即

11、增加流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度，使強(qiáng)保留組分五味子甲素和五味子乙素能在合適的保留時(shí)間內(nèi)以滿意的分離度從色譜柱中流出，從而提高分離效果，改變峰形，縮短分析時(shí)間 11 。為獲得最佳洗脫效果，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了4 套梯度洗脫程序，考察了不同的梯度洗脫條件對(duì)各組分分離的影響。通過實(shí)驗(yàn)得到，4 號(hào)梯度洗脫程序的色譜圖中 4 種待測(cè)物質(zhì)的分離效果最好，在分離效果良好的基礎(chǔ)上盡量縮短分析時(shí)間。因此，選擇4 號(hào)梯度洗脫程序?yàn)樽罴训奶荻认疵摮绦颉Ｈ绫? 所示。表 1 最佳的梯度洗脫程序3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇進(jìn)行高效液相色譜分析時(shí)經(jīng)常采用的檢測(cè)器是紫外- 可見檢測(cè)器，其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，波長(zhǎng)范圍寬，但只能在同一波長(zhǎng)下檢測(cè)，對(duì)分析多種

12、物質(zhì)不能同時(shí)選擇每種物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)12 ，這樣會(huì)使某些物質(zhì)的檢測(cè)靈敏度降低。而本實(shí)驗(yàn)采用 DAD檢測(cè)器，該檢測(cè)器可以動(dòng)態(tài)地快速掃描被測(cè)組分的紫外 - 可見吸收光譜圖，可直接得到每個(gè)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)，而且可在每個(gè)色譜峰出峰之前，動(dòng)態(tài)調(diào)整檢測(cè)器波長(zhǎng)，完全可以以每個(gè)組分的最大吸收波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)以此來(lái)提高檢測(cè)靈敏度，并能有效地減小基線漂移。實(shí)驗(yàn)分別取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，采用 DAD檢測(cè)器于 190900 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。結(jié)果如圖 1 所示。圖 14 種組分的紫外 - 可見吸收光譜圖由 4 種組分的紫外 - 可見吸收光譜可以看出，五味子醇

13、甲、五味子甲素和五味子乙素均在 216 nm 處有最大吸收峰，五味子酯甲在 222 nm 處有最大吸收峰。所以本實(shí)驗(yàn)選擇五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的檢測(cè)波長(zhǎng)為 216 nm，五味子酯甲的檢測(cè)波長(zhǎng)為 222 nm。3.5 柱溫的選擇本實(shí)驗(yàn)在上述確定的實(shí)驗(yàn)條件下以流速0.8 ml/min，進(jìn)樣量 10 l ，分別在 20，25， 30，35，40 進(jìn)行柱溫選擇實(shí)驗(yàn)，考察了柱溫對(duì)樣品中各物質(zhì)分離度及理論塔板數(shù)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各種物質(zhì)的分離度隨著柱溫的升高呈不同的變化趨勢(shì)，只有在 20和 25時(shí)各物質(zhì)的分離度才大于 1.0 ，可以滿足分析要求。實(shí)驗(yàn)得出，在 20和 25時(shí)，五味子醇甲和五味

14、子甲素的柱效變化不大，但五味子酯甲和五味子乙素柱效在 25時(shí)最高，為此，本實(shí)驗(yàn)選擇柱溫為 25。3.6 流速的選擇由實(shí)驗(yàn)中可以看出，流動(dòng)相流速對(duì) 4 種組分的保留時(shí)間有一定的影響，隨著流速的增大，各組分的保留時(shí)間提前，分析效率提高。但當(dāng)流動(dòng)相流速過大時(shí)，系統(tǒng)的壓力太高，容易沖塌柱。當(dāng)流速為0.8 ml/min五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的柱效達(dá)到最高，為此，本實(shí)驗(yàn)采用0.8 ml/min為最佳流速。時(shí)，3.7 樣品前處理方法的確定3.7.1 提取方法、提取試劑和提取條件的確定本實(shí)驗(yàn)考察了 3 種提取方法，即超聲提取法、冷浸提取法和回流提取法。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)回流提取法對(duì)各種物質(zhì)的提取結(jié)果較低

15、，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，所以實(shí)驗(yàn)主要對(duì)超聲提取法和冷浸提取法進(jìn)行了比較，提取中又選用不同的提取溶劑和提取時(shí)間來(lái)比較各組分的提取結(jié)果，在超聲提取法中主要選擇正己烷、醋酸乙酯、乙腈和環(huán)己烷進(jìn)行比較，在冷浸提取法中主要選擇正己烷、苯、醋酸乙酯、乙腈和甲醇進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)表明，應(yīng)用超聲提取法可選擇乙腈超聲， 4 種物質(zhì)的提取量最多，而且超聲時(shí)間長(zhǎng)提取量多，但時(shí)間太長(zhǎng)，分析周期延長(zhǎng)，為此實(shí)驗(yàn)選擇超聲 40 min 。實(shí)驗(yàn)還得出，用正己烷冷浸 1216 h 4 種物質(zhì)均獲得比較好的提取量，同超聲提取法相比較，提取量相當(dāng)，但由于冷浸需要的時(shí)間比較長(zhǎng)，為此本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈超聲 40 min 進(jìn)行提取。3.7.2 固相萃取

16、柱的選擇本實(shí)驗(yàn)分別考察了氧化鋁和C18兩種固相萃取柱對(duì)被測(cè)物質(zhì)的純化和富集情況，結(jié)果表明，用氧化鋁萃取，被測(cè)組分難以被洗脫，在吸附劑中的保留強(qiáng)，為此實(shí)驗(yàn)也考察了應(yīng)用不同的淋洗液和洗脫液，以及增加洗脫液的用量來(lái)洗脫被測(cè)物質(zhì)，但被測(cè)物質(zhì)仍然無(wú)法被很好的洗脫，回收率較低。而應(yīng)用C18萃取的結(jié)果與氧化鋁不同，洗脫的效果比較好，實(shí)驗(yàn)同樣也考察了不同淋洗液和洗脫液對(duì)樣品純化和被測(cè)物質(zhì)洗脫效率的影響。實(shí)驗(yàn)表明采用 C18進(jìn)行固相萃取，分別用10 ml 甲醇和 10 ml 水活化后上樣，然后用 5 ml 水做淋洗液， 5 ml 甲醇作為洗脫液進(jìn)行凈化，可以達(dá)到良好的效果。 11-04-24 16:22:00

17、編輯： studa203.8 干擾實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中用到甲醇作洗脫溶劑，在檢測(cè)范圍內(nèi)很可能出現(xiàn)甲醇溶劑峰的干擾 13 ，為此取少量甲醇用氮?dú)獯蹈蓛x吹干后，用流動(dòng)相定容，在上述確定的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明甲醇在 3 min 時(shí)出峰，而樣品中待測(cè)物質(zhì)第一峰的出峰時(shí)間為 13 min ，說明甲醇溶劑峰對(duì) 4 種組分的分析不產(chǎn)生干擾。3.9 標(biāo)準(zhǔn)曲線分別移取濃度為1 000 g/ml 的 4 種木脂素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.02 ，0.08 ，0.20 ，0.40 ，1.00 ，2.00 ml 于 10 ml 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，配制成濃度為 2.00 ，8.00 ，20.00 ， 40.00 ，1

18、00.00 ， 200.00 g/ml 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按最佳色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)做各種組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖 2 所示。經(jīng)線性回歸計(jì)算，得到 4 種化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)。見表 2。由表 2 可以看出，該 4 種化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在 0.9994 0.9998 之間，可以滿足日常分析的要求。3.10 檢出限和線性范圍檢出限又稱敏感度，是指產(chǎn)生一個(gè)能夠確證在試樣中存在的分析信號(hào)所需要的該組分的最小含量。亦即待測(cè)組分所產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度等于其噪聲強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差三倍時(shí)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度或質(zhì)量，用最小檢測(cè)濃度 g/ml( g/g) 或最小檢測(cè)質(zhì)量 g/ng

19、來(lái)表示。檢出限是衡量一個(gè)分析方法的重要指標(biāo)，它能更全面地反映檢測(cè)器質(zhì)量，檢測(cè)方法的靈敏度14 。為此在最佳色譜條件下測(cè)定了 4 種化合物的檢出限及線性范圍。結(jié)果見表3。由表 3 可以看出，本實(shí)驗(yàn)建立的 HPLC分析北五味子中 4 種木脂素成分的方法靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬。圖23 種組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線經(jīng)線性回歸計(jì)算，得到4 種化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)見表 2。表 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)表3各組分的檢出限及線性范圍3.11 儀器精密度實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)在最佳色譜條件下，以1.00 g/ml 的標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定 18 次，由測(cè)定結(jié)果可以看出，4 種物質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于 3.0%，測(cè)定結(jié)果的

20、可靠性可以滿足分析的要求。3.12 樣品測(cè)定在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定北五味子樣品中4 種組分的分析結(jié)果見表 4。表 4 北五味子的分析結(jié)果3.13 回收率實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。取北五味子2 號(hào)樣品 0.100 0 g ，加入 2 ml 200 g/ml 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，即提取液中各組分的濃度為 40 g/ml ，按前述提取方法平行實(shí)驗(yàn) 7 次，由實(shí)驗(yàn)得出，五味子中 4 種組分的平均回收率為 90.23% 95.24%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 3.2%4.9%。說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度較高，可以滿足日常分析檢測(cè)的要求。3.14 標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性為考察溶液的穩(wěn)定性15 ，配制濃度為 40.0

21、0 g/ml 使用液，密封避光保存。在不同的時(shí)間進(jìn)樣測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，濃度為 40.00 g/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液在第 20 天時(shí)五味子醇甲、五味子酯甲和五味子乙素的變化率都超過了 10%，在第 10 天時(shí) 4 種物質(zhì)的變化率均小于 10%，說明標(biāo)準(zhǔn)溶液在 10 d 內(nèi)是基本穩(wěn)定的。峰面積的升高，說明溶液濃度在增大，溶劑揮發(fā)，因此，標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)放置于溫度低的地方，使用時(shí)注意防止揮發(fā)。4 結(jié)論采用高效液相色譜法測(cè)定北五味子中木脂素類化合物的含量，通過實(shí)驗(yàn)得到以下結(jié)論。通過條件實(shí)驗(yàn)，確定了最佳實(shí)驗(yàn)條件： Diamonsil( 鉆石 )C18 柱 ;DAD檢測(cè)器檢測(cè)，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的檢

22、測(cè)波長(zhǎng)均為216 nm，五味子酯甲的檢測(cè)波長(zhǎng)為 222 nm; 流動(dòng)相乙腈 - 水，采用梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?025 min 乙腈 : 水=5050(V/V) ， 25 35 min 流動(dòng)相比例線性變化到 7030(VV)， 3540 min 保持乙腈 : 水=7030(V/V) ， 40 44 min 再線性變化到 8020(V/V); 柱溫 25; 流速 0.8 ml/min; 進(jìn)樣量 10.0 l 。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下 4 種木脂素類化合物能與樣品中其他雜質(zhì)達(dá)到良好的分離，通過定性分析 4 種物質(zhì)的出峰順序?yàn)槲逦蹲哟技住⑽逦蹲吁ゼ?、五味子甲素和五味子乙素。在最佳色譜條件下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在

23、0.15 200 g/ml 的范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為 0.999 4 0.999 8 。經(jīng)計(jì)算各組分的最小檢測(cè)濃度為 0.04 0.05 g/ml 。本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行了測(cè)定，并考察了方法的精密度和準(zhǔn)確度。對(duì)樣品進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平均回收率為 90.23% 95.24%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%4.9%。說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度較高，可以滿足日常分析檢測(cè)的要求。本研究所建立的高效液相色譜法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、線性范圍寬，適用于木脂素類化合物的分析。【參考文獻(xiàn)】1 靳杰 . 中藥五味子的研究進(jìn)展 J. 黑龍江醫(yī)藥， 2005， 18(5):335.2 高建平，王彥涵，郁韻秋，等 . 南五味子木

24、脂素成分的 HPLC含量測(cè)定及其變異規(guī)律 J. 中國(guó)天然藥物， 2003， 1(2):89.3 戴好富，周俊，彭再剛，等 . 北五味子的水溶性化學(xué)成分 J. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2001，13(1):24.4Schmidt T J, Stausberg S, Von Raison J, et al. Lignans from Arnica species J, Nat. Prod. Res., 2006, 20:443.5 王媚，吳皓 . 中藥有機(jī)酸類成分的提取分離及測(cè)定方法研究進(jìn)展 J.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2004，20(3):190.6 韓正洲，李亞鳳 . 南、北五味子的薄層色譜鑒定及

25、定量分析 J. 時(shí)珍國(guó)藥研究， 1997，8(4):24.7 楊映霞，牛志多，張桂英 . 薄層掃描法測(cè)定安神口服液中五昧子乙素的含量 J. 吉林中醫(yī)藥， 2000，1:53.8 Kvasnickova L ，Glatz Z ，Sterbova H ，et al. 用大孔聚丙烯酰胺柱毛細(xì)管電色譜法分析五味子種子中的木脂素J. J. Chromatogr. A, 2001，916(1):265.9Chen A J, Li C H, Gao W H, et al. Separation and determination of active components in Schisandra chin

26、ensis Baill. and its medicinal preparations by non-aqueous capillary electrophoresis J, Biomed. Chromatogr., 2005,19: 481.10 袁軍，付平，王野 . 南五味子種子中木脂素類成分的高效液相色譜 - 電噴霧電離 - 質(zhì)譜分析 J. 藥物分析雜志， 2005，25(5):565.11 裴毅，聶江力 . 高效液相色譜法測(cè)定五味子乙素含量 J. 植物研究，2005，25(3):373.12 周瑩，程海燕 . 高效液相色譜法鑒別南北五味子 J. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2005，24(10):951

27、.13 付紹平，張峰，張慧，等 . 反相高效液相色譜法測(cè)定五味子中木脂素的含量 J. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐， 2004， 18( 增刊 ):32.14 王彥涵，高建平，陳道峰 . 高效液相色譜法測(cè)定五味子屬藥用植物木脂素的含量 J. 中國(guó)中藥雜志， 2003，28(12):1155.15Wang Y H, Gao J P, Chen D F. Determination of lignans ofSchisandra medicinal plant by HPLC J, Chinese Materia Medica, 2003, 28:1155. 11-04-24 16:22:00 編輯： st

28、uda203.8 干擾實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中用到甲醇作洗脫溶劑，在檢測(cè)范圍內(nèi)很可能出現(xiàn)甲醇溶劑峰的干擾 13 ，為此取少量甲醇用氮?dú)獯蹈蓛x吹干后，用流動(dòng)相定容，在上述確定的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明甲醇在 3 min 時(shí)出峰，而樣品中待測(cè)物質(zhì)第一峰的出峰時(shí)間為 13 min ，說明甲醇溶劑峰對(duì) 4 種組分的分析不產(chǎn)生干擾。3.9 標(biāo)準(zhǔn)曲線分別移取濃度為1 000 g/ml 的 4 種木脂素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.02 ，0.08 ，0.20 ，0.40 ，1.00 ，2.00 ml 于 10 ml 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，配制成濃度為 2.00 ，8.00 ，20.00 ， 40.00 ，100.00

29、， 200.00 g/ml 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按最佳色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)做各種組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖 2 所示。經(jīng)線性回歸計(jì)算，得到 4 種化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)。見表 2。由表 2 可以看出，該 4 種化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在 0.9994 0.9998 之間，可以滿足日常分析的要求。3.10 檢出限和線性范圍檢出限又稱敏感度，是指產(chǎn)生一個(gè)能夠確證在試樣中存在的分析信號(hào)所需要的該組分的最小含量。亦即待測(cè)組分所產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度等于其噪聲強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差三倍時(shí)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度或質(zhì)量，用最小檢測(cè)濃度 g/ml( g/g) 或最小檢測(cè)質(zhì)量 g/ng 來(lái)表示。檢出

30、限是衡量一個(gè)分析方法的重要指標(biāo)，它能更全面地反映檢測(cè)器質(zhì)量，檢測(cè)方法的靈敏度14 。為此在最佳色譜條件下測(cè)定了 4 種化合物的檢出限及線性范圍。結(jié)果見表3。由表 3 可以看出，本實(shí)驗(yàn)建立的 HPLC分析北五味子中 4 種木脂素成分的方法靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬。圖23 種組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線經(jīng)線性回歸計(jì)算，得到4 種化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)見表 2。表 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)表3各組分的檢出限及線性范圍3.11 儀器精密度實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)在最佳色譜條件下，以1.00 g/ml 的標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定 18 次，由測(cè)定結(jié)果可以看出，4 種物質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于 3.0%，測(cè)定結(jié)果的可靠性可以滿

31、足分析的要求。3.12 樣品測(cè)定在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定北五味子樣品中4 種組分的分析結(jié)果見表 4。表 4 北五味子的分析結(jié)果3.13 回收率實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。取北五味子2 號(hào)樣品 0.100 0 g ，加入 2 ml 200 g/ml 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，即提取液中各組分的濃度為 40 g/ml ，按前述提取方法平行實(shí)驗(yàn) 7 次，由實(shí)驗(yàn)得出，五味子中 4 種組分的平均回收率為 90.23% 95.24%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 3.2%4.9%。說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度較高，可以滿足日常分析檢測(cè)的要求。3.14 標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性為考察溶液的穩(wěn)定性15 ，配制濃度為 40.00 g/ml

32、 使用液，密封避光保存。在不同的時(shí)間進(jìn)樣測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，濃度為 40.00 g/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液在第 20 天時(shí)五味子醇甲、五味子酯甲和五味子乙素的變化率都超過了 10%，在第 10 天時(shí) 4 種物質(zhì)的變化率均小于 10%，說明標(biāo)準(zhǔn)溶液在 10 d 內(nèi)是基本穩(wěn)定的。峰面積的升高，說明溶液濃度在增大，溶劑揮發(fā)，因此，標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)放置于溫度低的地方，使用時(shí)注意防止揮發(fā)。4 結(jié)論采用高效液相色譜法測(cè)定北五味子中木脂素類化合物的含量，通過實(shí)驗(yàn)得到以下結(jié)論。通過條件實(shí)驗(yàn)，確定了最佳實(shí)驗(yàn)條件： Diamonsil( 鉆石 )C18 柱 ;DAD檢測(cè)器檢測(cè)，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的檢測(cè)波長(zhǎng)均為2

33、16 nm，五味子酯甲的檢測(cè)波長(zhǎng)為 222 nm; 流動(dòng)相乙腈 - 水，采用梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?025 min 乙腈 : 水=5050(V/V) ， 25 35 min 流動(dòng)相比例線性變化到 7030(VV)， 3540 min 保持乙腈 : 水=7030(V/V) ， 40 44 min 再線性變化到 8020(V/V); 柱溫 25; 流速 0.8 ml/min; 進(jìn)樣量 10.0 l 。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下 4 種木脂素類化合物能與樣品中其他雜質(zhì)達(dá)到良好的分離，通過定性分析 4 種物質(zhì)的出峰順序?yàn)槲逦蹲哟技?、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素。在最佳色譜條件下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在 0.15 2

34、00 g/ml 的范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為 0.999 4 0.999 8 。經(jīng)計(jì)算各組分的最小檢測(cè)濃度為 0.04 0.05 g/ml 。本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行了測(cè)定，并考察了方法的精密度和準(zhǔn)確度。對(duì)樣品進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平均回收率為 90.23% 95.24%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%4.9%。說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度較高，可以滿足日常分析檢測(cè)的要求。本研究所建立的高效液相色譜法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、線性范圍寬，適用于木脂素類化合物的分析?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 靳杰 . 中藥五味子的研究進(jìn)展 J. 黑龍江醫(yī)藥， 2005， 18(5):335.2 高建平，王彥涵，郁韻秋，等 . 南五味子木脂素成分的

35、HPLC含量測(cè)定及其變異規(guī)律 J. 中國(guó)天然藥物， 2003， 1(2):89.3 戴好富，周俊，彭再剛，等 . 北五味子的水溶性化學(xué)成分 J. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2001，13(1):24.4Schmidt T J, Stausberg S, Von Raison J, et al. Lignans from Arnica species J, Nat. Prod. Res., 2006, 20:443.5 王媚，吳皓 . 中藥有機(jī)酸類成分的提取分離及測(cè)定方法研究進(jìn)展 J.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2004，20(3):190.6 韓正洲，李亞鳳 .南、北五味子的薄層色譜鑒定及定量分析J.時(shí)

36、珍國(guó)藥研究， 1997，8(4):24.7 楊映霞，牛志多，張桂英 . 薄層掃描法測(cè)定安神口服液中五昧子乙素的含量 J. 吉林中醫(yī)藥， 2000，1:53.8 Kvasnickova L ，Glatz Z ，Sterbova H ，et al. 用大孔聚丙烯酰胺柱毛細(xì)管電色譜法分析五味子種子中的木脂素J. J. Chromatogr. A, 2001，916(1):265.9Chen A J, Li C H, Gao W H, et al. Separation and determination of active components in Schisandra chinensis Bai

37、ll. and its medicinal preparations by non-aqueous capillary electrophoresis J, Biomed. Chromatogr., 2005,19: 481.10 袁軍，付平，王野 . 南五味子種子中木脂素類成分的高效液相色譜 - 電噴霧電離 - 質(zhì)譜分析 J. 藥物分析雜志， 2005，25(5):565.11 裴毅，聶江力 . 高效液相色譜法測(cè)定五味子乙素含量 J. 植物研究，2005，25(3):373.12 周瑩，程海燕 . 高效液相色譜法鑒別南北五味子 J. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2005，24(10):951.13 付紹平，張

38、峰，張慧，等 . 反相高效液相色譜法測(cè)定五味子中木脂素的含量 J. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐， 2004， 18( 增刊 ):32.14 王彥涵，高建平，陳道峰 . 高效液相色譜法測(cè)定五味子屬藥用植物木脂素的含量 J. 中國(guó)中藥雜志， 2003，28(12):1155.15Wang Y H, Gao J P, Chen D F. Determination of lignans ofSchisandra medicinal plant by HPLC J, Chinese Materia Medica, 2003, 28:1155. 11-04-24 16:22:00 編輯： studa203.8

39、干擾實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中用到甲醇作洗脫溶劑，在檢測(cè)范圍內(nèi)很可能出現(xiàn)甲醇溶劑峰的干擾 13 ，為此取少量甲醇用氮?dú)獯蹈蓛x吹干后，用流動(dòng)相定容，在上述確定的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明甲醇在 3 min 時(shí)出峰，而樣品中待測(cè)物質(zhì)第一峰的出峰時(shí)間為 13 min ，說明甲醇溶劑峰對(duì) 4 種組分的分析不產(chǎn)生干擾。3.9 標(biāo)準(zhǔn)曲線分別移取濃度為1 000 g/ml 的 4 種木脂素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.02 ，0.08 ，0.20 ，0.40 ，1.00 ，2.00 ml 于 10 ml 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，配制成濃度為2.00 ，8.00 ，20.00 ， 40.00 ，100.00 ， 200.00 g

40、/ml的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按最佳色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)做各種組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖 2 所示。經(jīng)線性回歸計(jì)算，得到 4 種化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)。見表 2。由表 2 可以看出，該 4 種化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在 0.9994 0.9998 之間，可以滿足日常分析的要求。3.10 檢出限和線性范圍檢出限又稱敏感度，是指產(chǎn)生一個(gè)能夠確證在試樣中存在的分析信號(hào)所需要的該組分的最小含量。亦即待測(cè)組分所產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度等于其噪聲強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差三倍時(shí)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度或質(zhì)量，用最小檢測(cè)濃度 g/ml( g/g) 或最小檢測(cè)質(zhì)量 g/ng 來(lái)表示。檢出限是衡量一個(gè)分析方法的

41、重要指標(biāo)，它能更全面地反映檢測(cè)器質(zhì)量，檢測(cè)方法的靈敏度14 。為此在最佳色譜條件下測(cè)定了 4 種化合物的檢出限及線性范圍。結(jié)果見表3。由表 3 可以看出，本實(shí)驗(yàn)建立的 HPLC分析北五味子中 4 種木脂素成分的方法靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬。圖23 種組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線經(jīng)線性回歸計(jì)算，得到4 種化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)見表 2。表 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)表3各組分的檢出限及線性范圍3.11 儀器精密度實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)在最佳色譜條件下，以1.00 g/ml 的標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定 18 次，由測(cè)定結(jié)果可以看出，4 種物質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于 3.0%，測(cè)定結(jié)果的可靠性可以滿足分析的要求。3.12

42、 樣品測(cè)定在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定北五味子樣品中4 種組分的分析結(jié)果見表 4。表 4 北五味子的分析結(jié)果3.13 回收率實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。取北五味子2 號(hào)樣品 0.100 0 g ，加入 2 ml 200 g/ml 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，即提取液中各組分的濃度為 40 g/ml ，按前述提取方法平行實(shí)驗(yàn) 7 次，由實(shí)驗(yàn)得出，五味子中 4 種組分的平均回收率為 90.23% 95.24%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 3.2%4.9%。說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度較高，可以滿足日常分析檢測(cè)的要求。3.14 標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性為考察溶液的穩(wěn)定性15 ，配制濃度為 40.00 g/ml 使用液，密封避光保存

43、。在不同的時(shí)間進(jìn)樣測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，濃度為 40.00 g/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液在第 20 天時(shí)五味子醇甲、五味子酯甲和五味子乙素的變化率都超過了 10%，在第 10 天時(shí) 4 種物質(zhì)的變化率均小于 10%，說明標(biāo)準(zhǔn)溶液在 10 d 內(nèi)是基本穩(wěn)定的。峰面積的升高，說明溶液濃度在增大，溶劑揮發(fā)，因此，標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)放置于溫度低的地方，使用時(shí)注意防止揮發(fā)。4 結(jié)論采用高效液相色譜法測(cè)定北五味子中木脂素類化合物的含量，通過實(shí)驗(yàn)得到以下結(jié)論。通過條件實(shí)驗(yàn)，確定了最佳實(shí)驗(yàn)條件： Diamonsil( 鉆石 )C18 柱 ;DAD檢測(cè)器檢測(cè)，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的檢測(cè)波長(zhǎng)均為216 nm，五味子酯甲的檢測(cè)波長(zhǎng)為 222 nm; 流動(dòng)相乙腈 - 水，采用梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?025 min 乙腈 : 水=5050(V/V) ， 25 35 min 流動(dòng)相比例線性變化到 7030(VV)， 3540 min 保持乙腈 : 水=7030(V/V) ， 40 44 min 再線性變化到 8020(V/V); 柱溫 25; 流速 0.8 ml/min; 進(jìn)樣量 10.0 l 。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下 4 種木脂素類化合物能與樣品中其他雜質(zhì)達(dá)到良好的分離，通過定性分析 4 種物質(zhì)的出峰順序?yàn)槲逦蹲哟技?、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素。在最佳色譜條件下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在 0.15 200 g