生化實驗技術(shù)與方法

1、糖的薄層層析糖的薄層層析 v 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握薄層層析的原理和方法v實驗原理實驗原理 層析法層析法是利用混合物中各組分物理化是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。的目的。 固定相固定相：固定相是層析的一個基

2、質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。 流動相流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。 按操作形式不同分類：按操作形式不同分類：柱層析：柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達到分離。紙層析：紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。薄層層析：薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定。 層析法的分類

3、層析法的分類按機理分類：按機理分類：吸附層析吸附層析分配層析分配層析離子交換層析離子交換層析凝膠層析凝膠層析親和層析親和層析v薄層層析是一種微量而快速的層析方法。該薄層層析是一種微量而快速的層析方法。該法是把吸附劑或支持劑涂布在玻璃板上成為法是把吸附劑或支持劑涂布在玻璃板上成為一薄層，將要分析的樣品滴加到薄層上，然一薄層，將要分析的樣品滴加到薄層上，然后用合適的溶劑進行展開，使樣品各個成分后用合適的溶劑進行展開，使樣品各個成分分離，然后進行定性鑒定和定量測定。分離，然后進行定性鑒定和定量測定。 實驗操作實驗操作1.硅膠薄板的制備硅膠薄板的制備：注意膠要均勻。 1.2 g硅膠H加4.0 ml0.

4、5%CMC溶液，研磨數(shù)分鐘后，倒在預(yù)先準(zhǔn)備好的玻璃板上，鋪開，使?jié){液分部均勻，放在水平臺上，自然晾干。硅膠硅膠G 硅膠硅膠H 硅膠硅膠GF254 硅膠硅膠HF2542. 板的處理板的處理：薄板的活化：105，0.5h 薄板的刮分：徑向?qū)游龅膬?yōu)點是：樣品展層后圖譜呈弧形帶狀，使Rf值相近的化合物也能清楚地分開。3. 點樣：點樣：樣品為鼠李糖、木糖和葡萄糖。點樣量8-10l。注意：點樣點的直徑小于5mm，點樣要少量多次，吹風(fēng)機風(fēng)力不能過大。4. 展層：展層：展層溶劑為：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3：2（體積比），新鮮配制。5. 顯色顯色：顯色劑：苯胺-二苯胺-磷酸試劑。20mm10mm3

5、0mm8mm苯丙氨酸解氨酶的提取純化苯丙氨酸解氨酶的提取純化 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康膙掌握分離純化酶的基本操作和方法。v實驗原理實驗原理v苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：ammonia lyase，簡稱PAL；EC4.3.1.5）是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶，與一些重要的次生物質(zhì)如木質(zhì)素、異黃酮類植保素、黃酮類色素等合成密切有關(guān)，在植物正常生長發(fā)育和抵御病菌侵害過程中起重要作用。 v本次實驗是以銀杏葉為原料采用分步鹽析、透析脫鹽、離子交換等方法得到苯丙氨酸解氨酶。 離子交換層析法離子交換層析法主要是利用溶液中各種主要是利用溶液中各種帶電帶電離子離子與與離子交換劑離子交換劑之間的結(jié)合

6、力的差異進行的分離之間的結(jié)合力的差異進行的分離方法。各種氨基酸分子的等電點不同，在同一方法。各種氨基酸分子的等電點不同，在同一pH時時所帶電荷不同，與離子交換樹脂的結(jié)合力有差異，所帶電荷不同，與離子交換樹脂的結(jié)合力有差異，因此可依據(jù)結(jié)合力從小到大的順序被洗脫液洗脫下因此可依據(jù)結(jié)合力從小到大的順序被洗脫液洗脫下來，達到分離的效果。來，達到分離的效果。離子交換劑為固定相。離子交換劑為固定相。帶電離子與離子交換劑之間的作用力主要是靜電力，帶電離子與離子交換劑之間的作用力主要是靜電力，它們的結(jié)合是可逆的。它們的結(jié)合是可逆的。 離子交換劑由基質(zhì)（惰性不溶性載體）、離子交換劑由基質(zhì)（惰性不溶性載體）、電荷

7、基團（功能基團）和反離子（平衡離電荷基團（功能基團）和反離子（平衡離子）三部分組成。子）三部分組成。 纖維素-O-CH2-COO-Na+ 基質(zhì) 電荷基團 反離子離子交換劑的種類離子交換劑的種類（一）（一）按載體種類不同按載體種類不同1.離子交換樹脂離子交換樹脂：主要有聚苯乙烯樹脂：主要有聚苯乙烯樹脂2.離子交換纖維素離子交換纖維素3.離子交換凝膠離子交換凝膠（二）（二）按功能基團帶電荷性質(zhì)不同按功能基團帶電荷性質(zhì)不同陽離子交換劑陽離子交換劑功能基團功能基團帶負電荷帶負電荷 （平衡離子帶正電平衡離子帶正電荷）荷） ，與陽離子交換。，與陽離子交換。陰離子交換劑陰離子交換劑 功能基團功能基團帶正電荷

8、（帶正電荷（平衡離子帶負電平衡離子帶負電荷）荷） ，與陰離子交換。，與陰離子交換。聚苯乙烯聚苯乙烯-苯二乙烯是由苯乙烯（單體）和苯苯二乙烯是由苯乙烯（單體）和苯二乙烯（交聯(lián)劑）進行聚合和交聯(lián)反應(yīng)生成的具有二乙烯（交聯(lián)劑）進行聚合和交聯(lián)反應(yīng)生成的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高聚物。它是離子交換樹脂的基質(zhì)，帶網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高聚物。它是離子交換樹脂的基質(zhì)，帶電基團是通過后來的反應(yīng)引入基質(zhì)的，樹脂一般都電基團是通過后來的反應(yīng)引入基質(zhì)的，樹脂一般都制成球形顆粒。制成球形顆粒。 CH2CH2CHCH2CH2CHSO3 CH CH2CH2CH苯環(huán)SO3有氫型和鈉型H+或Na+H+或Na+從交換劑上洗脫目的物的方法有兩種：從交

9、換劑上洗脫目的物的方法有兩種：1.調(diào)節(jié)洗脫液的調(diào)節(jié)洗脫液的pH，使目的物在此，使目的物在此pH下下失去電荷甚至帶相反電荷。失去電荷甚至帶相反電荷。2.用高濃度的同性離子，將目的離子取代用高濃度的同性離子，將目的離子取代下來。下來。儀器儀器高速冷凍離心機；恒溫水浴；電子天平；柱層析系統(tǒng)等試劑試劑0.1mol/L硼酸-硼砂緩沖液（含1mmol/LEDTA、20mmol/L-巰基乙醇）固體硫酸銨0.01mol/LTris-HCl（pH8.8）緩沖液）；DEAE纖維素52操作步驟操作步驟酶的提取酶的提取（1）植物材料2g，剪成小段，加入5倍體積的酶提取液，于冰浴上用研缽研磨。（2）將已勻漿的酶液轉(zhuǎn)入離

10、心管，4000r冷凍離心30min。（3）取離心后的上清液（酶粗提液），量出其體積，留樣 0.5ml 。硫酸銨分級沉淀酶蛋白硫酸銨分級沉淀酶蛋白（1）根據(jù)實際體積、溫度和硫酸銨飽和度用量表，算出達到38%飽和度應(yīng)加入酶粗提液中的硫酸銨量，并稱硫酸銨。（240g/L)（2）將酶液倒入燒杯內(nèi)，邊緩慢攪拌邊緩慢加入稱好的固體硫酸銨，待全部加完后，再緩慢攪拌10min；然后于9000r離心15min，保留上清液于燒杯內(nèi)。（3）根據(jù)硫酸銨飽和度用量表，算出從38%到75%飽和度所需硫酸銨用量。 （222g/L)（4）按上述（2）步同法處理，離心后，棄去上清液，保留沉淀。（5）將沉淀溶于2ml酶抽提液中,

11、留樣 0.5ml 。透析脫鹽透析脫鹽酶液裝入透析袋，放入低鹽溶液中透析過夜,留樣 0.5ml 。銀杏葉銀杏葉2g +10ml酶提取液研磨酶提取液研磨 4000rpm、30min 取取上清液上清液 加硫酸銨至飽和度加硫酸銨至飽和度38% 9000rpm、15min 取取上清液上清液 加硫酸銨至飽和加硫酸銨至飽和度度75% 9000rpm、15min 取取沉淀沉淀 溶于溶于2ml酶抽提液酶抽提液 透析透析純化純化離子交換層析-DEAE纖維素（1）稱取DEAE纖維素52干粉11.5g，加20ml的0.01mol/LTris-HCl（pH8.8）浸泡4h以上（或浸泡過夜）。（2）裝柱：把預(yù)處理的DEA

12、E纖維素52裝柱。裝柱完成后，用23個床體積的0.01mol/LTris-HCl（pH8.8）洗脫平衡該柱。（3）上樣：把所得的酶洗脫液小心地注入柱床面中央，上樣結(jié)束后，在床面以上小心地加入0.01mol/LTris-HCl（pH8.8） 23cm厚液層。注意上樣開始就收集流出液。（4）洗柱：用A液（ 0.01mol/LTris-HCl（pH8.8） ）及B液（含1mol/LNaCl 的0.01mol/LTris-HCl（pH8.8） ）洗柱，流速為1 mL/min，3ml/管,紫外檢測儀檢測，取A280值高的管中洗脫液測其PAL的活力；合并主要含有PAL活力的各管洗脫液，并量出其體積（ml）

13、。苯丙氨酸解氨酶苯丙氨酸解氨酶的活力測定的活力測定 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康膶W(xué)習(xí)苯丙氨酸解氨酶活力測定方法。vPAL催化催化L-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸，反苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸，反式肉桂酸在式肉桂酸在290nm處有最大吸收值。若酶的處有最大吸收值。若酶的加入量適當(dāng)，加入量適當(dāng)，A290升高的速率可在幾小時內(nèi)升高的速率可在幾小時內(nèi)保持不變，因此通過測定保持不變，因此通過測定A290升高的速率以升高的速率以測定測定PAL活力。規(guī)定活力。規(guī)定1h內(nèi)內(nèi)A290增加增加0.01為為PAL的一個活力單位。的一個活力單位。實驗原理實驗原理v取試管取試管2支，按表中所述（支，按表中所述（0號為調(diào)零管，號為調(diào)零管，

14、1號為測定管。號為測定管。注意按表格從上到下的順序加入試劑）。（單位：注意按表格從上到下的順序加入試劑）。（單位：ml） 將各管混勻，放入將各管混勻，放入40恒溫水浴保溫恒溫水浴保溫1h（準(zhǔn)確計時），到時（準(zhǔn)確計時），到時在待測管（1號）加加0.2 ml 2 mol/LHCl終止反應(yīng)。終止反應(yīng)。紫外分光光度于波長紫外分光光度于波長290nm處測定處測定1號管的號管的A290。操作步驟操作步驟試劑類型調(diào)零管（0號） 待測管（1號）pH8.7的0.1mol/L硼酸緩沖液2.92.90.2mol/L L-苯丙氨酸溶液1 16 mol/L鹽酸0.2 0樣品（酶）溶液1.01.0蛋白質(zhì)測定（考馬斯亮藍染

15、色法）蛋白質(zhì)測定（考馬斯亮藍染色法）取酶液取酶液0.1ml，用蒸餾水稀釋至，用蒸餾水稀釋至5ml取試管取試管8支，按下表加入各溶液：支，按下表加入各溶液：將上述各試管混勻，靜置將上述各試管混勻，靜置2min，測定各管的，測定各管的A595。 試管編號01234567標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（ml）50ug/ml 00.20.40.60.81.0/稀釋酶液（ml）/1.01.0蒸餾水（ml）2.01.81.61.41.21.01.01.0考馬斯亮藍（ml）2.02.02.02.02.02.02.02.0PAL總活力、比活力、蛋白質(zhì)含量的計算總活力、比活力、蛋白質(zhì)含量的計算步驟步驟體積（體積（ml）蛋白質(zhì)含

16、量蛋白質(zhì)含量（mg）總活力總活力（m）比活力比活力（m/mg protein）粗提粗提硫酸銨沉淀硫酸銨沉淀透析透析離子交換層析離子交換層析SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）測定蛋白質(zhì)分子量測定蛋白質(zhì)分子量 v實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康膙掌握SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量的原理和方法SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）測定蛋白質(zhì)分子量測定蛋白質(zhì)分子量 v原理：原理：vSDS PAGE是最常用的定性分析蛋白質(zhì)是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方法，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測的電泳方法，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和測定蛋白質(zhì)分子量。和測定蛋白質(zhì)分子量。v

17、 電泳遷移率與顆粒的電荷、形狀、大小電泳遷移率與顆粒的電荷、形狀、大?。ǚ肿恿浚┯嘘P(guān)，如電荷、形狀都一樣，（分子量）有關(guān)，如電荷、形狀都一樣，則電泳遷移率只與分子量有關(guān)。則電泳遷移率只與分子量有關(guān)。測定各條帶的相對遷移率，測定各條帶的相對遷移率，根據(jù)已知蛋白質(zhì)分子量和根據(jù)已知蛋白質(zhì)分子量和它們的相對遷移率，以相它們的相對遷移率，以相對遷移率為橫坐標(biāo)，對遷移率為橫坐標(biāo)，lgMr為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)未知蛋白質(zhì)的相對遷移據(jù)未知蛋白質(zhì)的相對遷移率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它們率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它們的的lgMr，再換算成蛋白質(zhì)，再換算成蛋白質(zhì)分子量分子量操作如同操作如同PAGE。樣品：蛋

18、白質(zhì)要完全變性。樣品：蛋白質(zhì)要完全變性。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)+SDS+巰基乙醇巰基乙醇 100 2-5 100 2-5分鐘分鐘標(biāo)準(zhǔn)蛋白市場有售，被測蛋白質(zhì)的分子量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白市場有售，被測蛋白質(zhì)的分子量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量以內(nèi)。蛋白分子量以內(nèi)。染色：染色：考馬氏亮藍、銀染色考馬氏亮藍、銀染色該法測定蛋白質(zhì)分子量的局限性：該法測定蛋白質(zhì)分子量的局限性：1.1.蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，測定時只是它們的亞基或單條肽鏈的乳蛋白酶）組成的，測定時只是它們的亞基或單條肽鏈的MWMW。2.2. 電荷異常的蛋白質(zhì)（如組蛋白，帶大量正電荷）電荷異常的蛋白質(zhì)（如組蛋白，帶大量正電荷）3.3.結(jié)構(gòu)異常，不于分子量呈線性關(guān)系（如膠原蛋白）結(jié)構(gòu)異常，不于分子量呈線性關(guān)系（如膠原蛋白）4.4.帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（如糖蛋白）帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（如糖蛋白）實驗操作實驗操作編號溶液名稱12%分離膠4%濃縮膠13